Artículo de método

Adelante Genética pantallas usando macrófagos identificar

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DOI:

10.3791/52556

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12 de marzo de 2015

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1Department of Microbiology and Immunology, New York Medical College

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Forward genetics es un poderoso enfoque para identificar genes en patógenos intracelulares importantes para la resistencia a la inmunidad celular autónoma. El enfoque actual utiliza células inmunitarias innatas, concretamente macrófagos, para identificar nuevos genes de Toxoplasma gondii importantes para la evasión inmunitaria.

Resumen

Toxoplasma gondii, el agente causante de la toxoplasmosis, es un patógeno protozoario intracelular obligado. El parásito invade y se replica dentro de prácticamente cualquier tipo de célula de vertebrado de sangre caliente. Durante la invasión del parásito a una célula huésped, el parásito crea una vacuola parasitófora (PV) que se origina en la membrana de la célula huésped independientemente de la fagocitosis dentro de la cual se replica el parásito. Si bien la inmunidad innata y mediada por células dependientes de IFN es importante para el control final de la infección, las células inmunitarias innatas, incluidos los neutrófilos, los monocitos y las células dendríticas, también pueden servir como vehículos para la diseminación sistémica del parásito en las primeras etapas de la infección. Se describe un enfoque que utiliza la respuesta inmunitaria innata del huésped, en este caso macrófagos, en un cribado genético directo para identificar parásitos mutantes con un defecto de aptitud en los macrófagos infectados tras la activación, pero con una invasión y replicación normales en los macrófagos naïf. Por lo tanto, el cribado aísla mutantes parásitos que tienen un defecto específico en su capacidad para resistir los efectos de la activación de los macrófagos. El artículo describe dos grandes fenotipos de parásitos mutantes después de la activación de macrófagos infectados: estasis del parásito versus degradación del parásito, a menudo en vacuolas amorfas. A continuación, se analizan los mutantes del parásito para identificar los genes del parásito responsables, específicamente importantes para la resistencia a los mediadores inducidos de la inmunidad celular autónoma. El artículo presenta un enfoque general para el cribado de genética avanzada que, en teoría, puede modificarse para dirigirse a genes de parásitos importantes para la resistencia a mediadores antimicrobianos específicos. También describe un enfoque para evaluar los mediadores antimicrobianos específicos de los macrófagos a los que es susceptible el parásito mutante. La activación de macrófagos infectados también puede promover la diferenciación del parásito de la etapa de taquizoíto a bradizoíto que mantiene la infección crónica. Por lo tanto, se presenta una metodología para evaluar la importancia del gen del parásito identificado para el establecimiento de la infección crónica.

Introducción

Toxoplasma gondii (T. gondii) es un intracelular obligado, protozoos patógenos. Es el agente causante de la toxoplasmosis, un peligro para la salud en individuos inmunocomprometidos. También es el sistema modelo para otros patógenos que infectan a los seres humanos apicomplexan incluyendo Cryptosporidium y Cyclospora. La toxoplasmosis se adquiere con mayor frecuencia a través de la ingestión de alimentos o agua contaminados con la etapa bradizoíto o ooquistes del parásito. Después de la ingestión, estas etapas se convierten en el escenario taquizoíto del parásito que se replica dentro de las células huésped y disemina sistémicamente. Células T, IFN-γ y, en menor medida, el óxido nítrico 1-4, son importantes para el control de la infección, pero no son capaces de eliminar la enfermedad, como una proporción de taquizoítos se convierten en la etapa de bradyzoite que están protegidos dentro de quistes tisulares resultando en una infección crónica de larga duración. De hecho, no hay terapias eficaces contra el quiste s crónicataje de la enfermedad. Toxoplasmosis severa es más a menudo debido a la reactivación de la infección persistente, con la etapa bradizoíto del parásito convertir de nuevo a la fase de replicación rápida característica taquizoíto de la infección primaria y aguda.

La supervivencia temprana en la cara de la respuesta inmune innata es importante para permitir que el parásito para alcanzar el número de parásitos suficientes, así como para llegar a sitios distales, para permitir el establecimiento de la infección crónica. T. gondii ha desarrollado estrategias para contrarrestar los mecanismos de defensa del huésped que probablemente contribuyen a su capacidad de replicar y difundir principios de la infección. En primer lugar, T. gondii forma un PV única durante la invasión parásito que es en gran parte segregados de los procesos de endocitosis y exocytic de la célula huésped en comparación con otros patógenos intracelulares 5-9. Además, como todos exitosa T. patógenos intracelulares gondii modifica su célula huésped para crear un ambiente permisivo fo el crecimiento. Esto incluye anfitrión reprogramación de la expresión génica de células mediante la alteración de los factores de transcripción de la célula huésped, incluyendo aquellos que son importantes para la regulación de la activación de células 10-15. ROP16 16-19, GRA15 20, 21 y GRA16 GRA24 22, han demostrado ser importantes en la regulación de la respuesta transcripcional y señalización celular cascadas de células huésped infectadas con T. gondii. Estudios recientes utilizando cruces genéticos entre las cepas del parásito con fenotipos distintos han sido muy productivo en la identificación de genes del parásito que subyacen rasgos genotipo dependiente de parásitos incluyendo evasión de la inmunidad relacionada GTPasas (IRGs) 16,19,23-26. En ratones, GTPasas de inmunidad relacionada (IRGs) son críticos para el control de tipo II y III genotipos del parásito mientras que el tipo muy virulenta I genotipos han desarrollado mecanismos para evadir las IRGs murinos. Sin embargo, también es claro que el parásito ha desarrollado mecanismos para evadir medios antimicrobianoTdR en Además de los IRGs y que algunos de estos mecanismos pueden ser conservadas a través de los genotipos de parásitos 27,28. Además, se sabe muy poco acerca de los mediadores críticos de la inmunidad celular autónoma contra T. gondii toxoplasmosis durante humano. Genes de parásitos importantes para la resistencia a los mediadores de la inmunidad celular autónoma también pueden ser importantes para la supervivencia durante taquizoíto a bradizoíto conversión que también puede ser provocada por respuestas inmunitarias del huésped. Por ejemplo, el óxido nítrico a niveles altos puede suprimir la replicación del parásito en los macrófagos infectados pero también puede estimular a bradyzoite de taquizoitos de conversión resultante en la producción de quiste 30-32.

ToxoDB es una base de datos genómica funcional para T. gondii que funciona como un recurso crítico para el campo en términos de proporcionar información de la secuencia para el genoma del parásito y el acceso a los datos publicados y no publicados escala genómica incluyendo anotaciones de la comunidad, exp gen resión y proteómica de datos 33. Similar a muchos patógenos protozoarios, la mayoría del genoma consiste en genes hipotéticos con información no disponible sobre la base de homología genética para dar una idea de sus funciones potenciales. Por lo tanto, la genética hacia adelante es una poderosa herramienta para identificar nuevos genes de parásitos importantes para la evasión inmune, la conversión quiste y otras funciones críticas para la patogénesis del parásito, así como para la conversión entre las etapas de desarrollo distintas. Una fuerza adicional de la genética hacia adelante es que puede ser utilizado como un enfoque relativamente no sesgada para interrogar el parásito en cuanto a los genes que son importantes para tareas específicas en la patogénesis, incluyendo la evasión inmune y la formación de quistes. Los últimos avances en la secuenciación de próxima generación para el perfil mutacional han convertido en un método de elección para la identificación de los genes del parásito responsable de los estudios de genética hacia adelante usando mutagénesis química y de inserción 34-37.

ntent "> Es importante identificar las vulnerabilidades de T. gondii que pueden ser explotados para mejorar la eficacia de los mecanismos inmunes celulares autónomas contra el parásito en particular los que también pueden ser activos frente a la etapa de quiste resistente. Con este objetivo, un in vitro murino infección de los macrófagos y modelo de activación fue desarrollado para identificar las mutaciones en el parásito que perjudica específicamente T. gondii gimnasio después de la activación de los macrófagos infectados, pero no en los macrófagos ingenuos. Se utilizó Esta pantalla macrófagos para interrogar a una biblioteca de T. gondii mutantes de inserción con el fin de, en última instancia identificar los genes de T. gondii importantes para la resistencia al óxido nítrico 27,28. El aislamiento de un panel de mutantes de T. gondii con una alteración de la resistencia a la activación de macrófagos infectados, en particular una marcada sensibilidad a la óxido nítrico, ha demostrado la utilidad de la pantalla para identificar genes de parásitos importantes para la resistenciaa los mediadores de la inmunidad celular autónoma distinta de los mecanismos de resistencia descritas para los IRGs murinos 28. Mutagénesis de inserción tiene ventajas sobre mutagénesis química en términos de generar un número limitado de mutaciones aleatorias en cada clon parásito y, en teoría, más fácil identificación del sitio de la mutación. Sin embargo, identificar el sitio genómico de la inserción del plásmido en T. mutantes de inserción gondii, en la práctica, ha sido sorprendentemente difícil en muchos casos 37. La inserción de un plásmido en un gen también es probable que interrumpir la función de un gen en contraste a mutagénesis química que típicamente resulta en cambios de nucleótidos individuales. Sin embargo, mutagénesis química, ya sea con-N-nitrosourea N-etil (ENU) o sulfonato de etilmetano (EMS) puede ofrecer una mayor capacidad para analizar una porción más grande del genoma del parásito, en comparación con la mutagénesis de inserción, ya que crea múltiples polimorfismos de nucleótido único ( estimado en 10 -100) por 34 mutante, De 38 años. Por otra parte, los recientes avances en toda genoma de perfiles ha hecho posible el uso de la secuenciación de próxima generación para identificar los genes candidato más probable responsable del fenotipo identificado de un parásito mutado 34,38. Independientemente del enfoque de mutagénesis, la confirmación de la función del gen parásito en la resistencia a la activación de los macrófagos en última instancia requiere eliminación y complementación génica para cumplir los postulados de Koch molecular.

La capacidad para diseccionar la función de un gen mediante la manipulación genética de tanto el parásito y el macrófago es importante ya que muchos de los genes identificados a través de la genética hacia adelante en T. gondii, así como otros patógenos, todavía se caracterizan como genes hipotéticos con poca o ninguna homología de secuencia con otras proteínas con funciones conocidas. El presente documento describe un enfoque general que se puede utilizar para identificar si el gen alterado en un mutante es importante para la resistencia a un conocido odesconocido mediador de la inmunidad celular autónoma. El análisis inicial de los factores antimicrobianos de acogida se realiza mediante la evaluación de la supervivencia de tipo salvaje y parásitos mutantes en los macrófagos de ratones de tipo salvaje frente a aquellos con deleciones de genes específicos en óxido nítrico sintasa inducible (iNOS), gp-91 phox (NADPH oxidasa), y inmunidad relacionada GTPasas específicos (IRGs). Esto determinará si los genes del parásito identificados son importantes para la resistencia al óxido nítrico, intermediarios reactivos del oxígeno o relativas a la seguridad GTPasas 28, respectivamente, o si un mecanismo inmunológico desconocido se tratara. La activación de los macrófagos infectados tanto con IFN-γ y LPS, descritos en el protocolo actual, resulta principalmente en el aislamiento de genes de parásitos importantes para la resistencia al óxido nítrico 28. El uso de agentes farmacológicos que inducen la óxido nítrico en la ausencia de la activación de macrófagos (donantes de óxido nítrico) confirmó que la mayoría de los genes identificados eran importantes para reresistencia al óxido nítrico en lugar de óxido nítrico en concierto con mediadores adicionales asociados con la activación de los macrófagos 28.

Paso uno y dos describen una pantalla genética adelante diseñada para aislar mutantes parásito con un defecto físico después de la activación de los macrófagos derivados de médula ósea infectadas in vitro. Paso uno describe un análisis de ajuste de la dosis para determinar empíricamente una dosis de γ y LPS IFN utilizar para la activación de los macrófagos, que reduce la replicación del parásito pero no inhibe completamente la replicación de tipo salvaje T. cepa parental gondii que se utiliza para la creación de la biblioteca de mutantes de parásitos. Paso dos describe la pantalla hacia delante genética de los clones mutantes en los macrófagos en placas de 96 pocillos. Paso tres describe un enfoque para confirmar el fenotipo de cada mutante identificado en la pantalla de las placas de 96 pocillos y para evaluar si el defecto en cada mutante afecta a la supervivencia del parásito, la replicación,o la producción quiste en respuesta a la activación de macrófagos. Paso cuatro describe el uso de macrófagos derivados de médula ósea de ratones con deleciones en las vías de antimicrobianos específicos para identificar los mediadores inmunes a la que el mutante parásito es específicamente susceptible. Paso cinco describe un enfoque para determinar si un mutante parásito también se ve comprometida para la patogénesis in vivo según se evaluó por la producción de quistes en los cerebros de los ratones infectados.

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Protocolo

NOTA: Todos los protocolos que implican el uso de animales se realizaron de acuerdo con las directrices y normas establecidas por el Cuidado de Animales del Medical College de Nueva York y el empleo.
NOTA: Detallado protocolos para mutagénesis química 38, el aislamiento de los parásitos mediante dilución limitante 38, el aislamiento de los macrófagos murinos derivados de la médula ósea 39, el crecimiento de T. gondii en fibroblastos de prepucio humano (HFF) las células y la producción de quistes en los macrófagos y análisis básico de inmunofluorescencia (IFA) 32 están referenciados. Llevar a cabo todas cultivo celular a 37 ° C en 5% de CO 2 en los medios de D10 (de Dulbecco Modificado de alta glucosa Medio Eagle suplementado con 10% de suero de ternera fetal, 2 mM L-glutamina, 100 U / ml de penicilina y 100 mg / ml de estreptomicina) . Mantenga todos los reactivos estériles en todo aislamientos de células y cultivos celulares.

1. Titulación de la dosis de IFN-γ y LPS para determinar la Concentrciones utilizar para activar los macrófagos infectados por la pantalla hacia delante Genética

  1. Macrófagos derivados de médula ósea murina Cultura O / N en ocho portaobjetos de vidrio cámara a una concentración de 3 × 10 5 células / ml en 250 l de los medios de comunicación D10 por cámara. Utilice macrófagos uno a dos semanas después del aislamiento de la médula ósea.
    NOTA: la cámara de diapositivas se compran que tienen un crecimiento mejoran RS lavar.
  2. Use un hemocitómetro contar parásitos de tipo salvaje cosechadas a partir de células de fibroblastos de prepucio humano (HFF) obtenidas en un frasco de cultivo de tejido T25. Resuspender parásitos a una concentración de 5 x 10 5 parásitos de tipo salvaje por ml en medio D10. Esta concentración dará lugar a una multiplicidad de infección de aproximadamente 1: 1 como los macrófagos se han proliferado O / N. Utilice tubos de poliestireno o PET para todas las manipulaciones con parásitos como los palos de parásitos a polipropileno.
  3. Retire el papel D10 en las cámara de diapositivas y reemplazar con 250 l de lasuspensión de parásitos de tipo salvaje. Añadir con cuidado la suspensión parásito a cada cámara de la diapositiva al permitir que fluya por la cara interior de cada cámara. No permitir que los macrófagos se sequen en cualquier punto durante el protocolo.
  4. Cámara de diapositivas Cubra infectados con parásitos con la tapa deslizante y cámara de lugar en una incubadora a 37 ° C en el 5% de CO 2 durante 4 horas para dar tiempo a que el parásito para invadir y establecer un PV.
  5. Hacer diluciones de LPS e IFN-γ en 1 ml de medio D10 en tubos estériles para la titulación de dosis. Para la dosis titulaciones LPS o mantener constante la concentración de IFN-y varían el otro estímulo 40.
    1. Por ejemplo, mantener constante a LPS LPS 10 ng por ml y variar la concentración de IFN-γ (0, 1 unidad / ml, 10 unidades / ml, 100 unidades / ml, 1.000 unidades / ml). Mantener IFN-γ constante a 100 unidades / ml y se puede variar la concentración de LPS (0, 0,1 ng / ml, 1 ng / ml, 10 ng / ml, 100 ng / ml). Tratar brevemente con ultrasonidos LPS de stock para 2 min sincalentamiento en un baño de ultrasonido (no con un sonicador de punta) antes de la dilución.
      NOTA: La sonicación se recomienda interrumpir agregados de micelas formadas por LPS que no puede unirse adecuadamente a las células huésped.
  6. 4 horas después del inicio del co-cultivo entre los parásitos y macrófagos adherentes en la diapositiva cámara, deseche los medios D10 en cada cámara y reemplazarlo con 300 l de las diluciones apropiadas de γ y LPS IFN en medios D10. Incluir un control con solamente medios D10 para evaluar la replicación del parásito en ausencia de activación de los macrófagos.
  7. Diapositivas Re-cubierta de la cámara con la tapa deslizante y cámara de lugar en una incubadora a 37 ° C en el 5% de CO2 durante 24 a 30 h adicionales.
    NOTA: El tiempo de incubación depende del tiempo de duplicación de la cepa de tipo salvaje parásito que puede variar desde 6 hasta 12 horas dependiendo de la cepa del parásito. Un punto de tiempo se elige antes de parásito lisis de los macrófagos ingenuos pero lo suficiente como para permitir al menos 3-4 douveces bling.
  8. Hacer una solución de formaldehído 2,5% en tampón fosfato salino de Dulbecco (PBS). Deseche los medios de comunicación en la diapositiva cámara y reemplazar con 300 l de la solución al 2,5% de formaldehído. Arreglo para 20 min a TA.
  9. Diapositiva (s) Enjuagar dos veces con 300 l de PBS por cámara. Para cada enjuague, desechar la PBS en la diapositiva y añadir nueva PBS suavemente por la cara interior de cada cámara de diapositivas para no perturbar los macrófagos adheridos a la diapositiva. Añadir 300 l de PBS por cámara y el lugar cubierta de la diapositiva cámara para evitar que las diapositivas se sequen antes de la tinción.
    NOTA: Las diapositivas se pueden colocar a 4 ° C durante un máximo de 3 días en este punto antes de la tinción.
  10. Protocolo de tinción para T. detección gondii por microscopía de inmunofluorescencia (IFA).
    1. Hacer una solución de Triton X-100 0,2% en PBS (tampón de permeabilización). Colocar la solución en un tubo en un 37 ° C baño de agua y brevemente vórtice para asegurar la Triton X-100 entra en solución. Deseche elPBS en las cámara de diapositivas y reemplazar con 300 l de la permeabilización de amortiguación. Deja a temperatura ambiente durante 30 min.
    2. Hacer una solución de 10% de suero de cabra en PBS (solución de bloqueo). Deseche la permeabilización de amortiguación en la diapositiva y reemplazar con 300 l de solución de bloqueo por cámara. Deja a temperatura ambiente durante 30 min.
      NOTA: suero de ternera fetal puede ser sustituido por suero de cabra en todos los protocolos de tinción.
    3. Para un protocolo de tinción IFA un paso, hacer una dilución 1: 1000 de un anticuerpo conjugado con fluorescencia a T. gondii en solución de bloqueo. Eliminar la solución de bloqueo de diapositivas y añadir 150 ml de solución de anticuerpos por cámara. Sustituya la cubierta deslizante en la diapositiva cámara para evitar que las células se sequen. Incubar durante 1 hora a RT.
      NOTA: La concentración de anticuerpo se debe determinar empíricamente dependiendo de la fuente. El anticuerpo se compra directamente conjugado con un fluorocromo o conjugado a un fluorocromo por el usuario.
      1. Para una tinción IFA de dos pasosprotocolo con un anticuerpo conjugado a T. gondii y un anticuerpo secundario conjugado con fluorescencia, las diapositivas de manchas con 150 l de anticuerpo primario no conjugada contra T. gondii en tampón de bloqueo durante 1 hora a RT. Enjuagar 3 veces con 300 l de PBS más 1% de suero de cabra (tampón de lavado).
      2. Añadir 150 l de anticuerpo secundario conjugado con fluorescencia específicos para la especie de origen de la primaria de anticuerpos. Sustituya la cubierta deslizante en la diapositiva cámara para evitar que las células se sequen. Incubar durante 1 hora a RT.
    4. Portaobjetos Lavar 3 veces con PBS más 1% de suero de cabra (tampón de lavado). Para cada enjuague, quite la solución en los portaobjetos de cámara por volcar sus contenidos y reemplazar con 300 l de tampón de lavado.
    5. Lavar los portaobjetos 2 veces con 300 l de PBS.
    6. Retire la cámara de la diapositiva cámara según las instrucciones del fabricante.
    7. Monte desliza con medios que contienen DAPI de montaje (4'6-diamidino-2-fenilindol, dilactato) y un 22 mm x 50 mm cubreobjetos.
  11. Examinar los portaobjetos utilizando contraste de fases y microscopía de fluorescencia. Determinar el número medio de parásitos por vacuola mediante el examen de un mínimo de 100 PVs por cámara así. La dosis elegida de IFN-γ y LPS de la pantalla debe ser suficiente para suprimir, pero no impide, la replicación de los parásitos de tipo salvaje (véase la Figura 1).

2. El aislamiento del parásito Mutantes con gimnasio Defecto después de la activación de los macrófagos infectados

NOTA: Una biblioteca de T. azar mutantes gondii se requiere para la pantalla de la genética hacia adelante. La mutagénesis aleatoria de T. gondii se puede realizar por medios químicos (ENU / EMS) o mutagénesis de inserción 27,28,38. Después de la mutagénesis, los parásitos de clones mediante dilución limitante y crecer clones individuales en placas de 96 pocillos que contienen células HFF adherentes en un volumen de 200 l de los medios de comunicación D10 32,38.Es crítico que las placas de 96 pocillos para la detección de parásitos en macrófagos por microscopía tienen fondos ópticas para permitir la detección microscópica. De contraste de fases y microscopía de fluorescencia para la detección tiñeron placas de 96 pocillos requiere un microscopio de fluorescencia invertido con contraste de fase 4, 10, 20 u objetivo 40X equipado para distancias de trabajo largas. Un objetivo 4X es útil para ver todo el bien pero mejor resolución de los parásitos se consigue con el objetivo 20X.

  1. Transferencia de 50 l de mutantes de taquizoitos cultivadas en células HFF confluentes en placas de cultivo de tejido de 96 pocillos en dos replican placas de 96 pocillos que contienen los macrófagos derivados de médula ósea murina (1-2 semanas después del aislamiento) en 100 l de los medios de comunicación D10.
    NOTA: Realice la pantalla inicial en placas de 96 pocillos del parásito sobre la base de volumen de cultivo de parásitos para evitar tener que contar el número de parásitos transferidos por cada pocillo. Así, el análisis de microscopía en 2.6 se basa cualitativamente en whether parásitos generalmente han replicado o no replicado. Paso 3 describe el enfoque para confirmar el fenotipo de los mutantes en la cámara de diapositivas usando números iguales de tipo salvaje o parásitos mutantes para infectar los macrófagos.
    1. Añadir directamente los parásitos a los medios de D10 ya en cada pocillo. Infect dos pozos con taquizoitos de tipo salvaje como control positivo para la replicación del parásito.
  2. Colocar las células infectadas en una incubadora (37 ° C y 5% de CO 2) durante 4 horas para permitir que los parásitos tiempo para invadir las células y crear su PV.
  3. Retire el medio de una placa por el vertido del contenido de la placa. Utilice una sola cara de la muñeca para volcar los medios de comunicación en la placa en una cuenca de descarte que contiene un detergente bactericida para los parásitos.
    1. Añadir 100 l de "medios activación de los macrófagos" usando una cubeta estéril para los medios de comunicación y una pipeta multicanal. Utilice la concentración óptima de LPS e IFN-γ determinada de la Etapa 1 del macmedios de activación rophage. Del mismo modo los medios de eliminar la placa de control duplicado y reemplazar con 100 l de los medios de comunicación D10.
  4. Colocar las células infectadas en una incubadora (37 ° C y 5% de CO 2) para un 24-30 h adicionales.
  5. Protocolo de tinción para placas de 96 pocillos para IFA.
    1. Deseche los medios de comunicación en la placa y reemplazar con 100 l de formaldehído al 2,5% en PBS. Incubar durante 20 min a TA. Utilice un recipiente estéril para el formaldehído y una pipeta multicanal.
    2. Deseche la solución de formaldehído en el plato y añadir 100 l de PBS para enjuagar el formaldehído de la placa.
    3. Descartar la solución en la placa y añadir 100 l de tampón de permeabilización (PBS con 0,2% Triton X-100) a cada pocillo. Incubar durante 30 min a TA.
    4. Descartar la solución en la placa y añadir 100 l de solución de bloqueo (PBS con 10% de suero de cabra) a cada pocillo. Incubar durante 30 min a TA.
    5. Deseche la solución en el ptarde. Añadir 50 l / pocillo de una T. anti-conjugado con fluorescencia gondii anticuerpo diluido 1: 1000 en PBS más un 1% de suero de cabra. Incubar durante 1 hr a RT con la cubierta de la placa en y en un eje de balancín.
      1. Alternativamente, puede utilizar un anticuerpo primario no conjugada contra T. gondii seguido de tinción con un anticuerpo secundario conjugado con fluorescencia como se describe en 1.10.3.1.
    6. Deseche la solución de anticuerpo en la placa y reemplazar con 100 l / pocillo de PBS más 1% de suero de cabra. Realice este 3x enjuague seguido de 2 lavados adicionales con PBS solo. Deja 200 l de PBS en cada pocillo y colocar la cubierta en la placa de 96 pocillos para evitar que los pozos de secado.
      NOTA: La placa con la tapa puede ser envuelto en parafina y se coloca a 4 ° C durante un máximo de 3 días antes del análisis por microscopía.
  6. Examine las células bajo un microscopio de fluorescencia invertida utilizando un objetivo 20-40X. Seleccione mutantes que se replican en el na y# 239; ve placa macrófagos pero predominantemente no logran replicar más de un parásito / vacuola en "macrófagos activados" o que aparecen amorfo o degradado en "macrófagos activados".
    NOTA: El número de parásitos de tipo salvaje por vacuola dependerá de la dosis de IFN-γ y LPS utilizados pero lo ideal es de alrededor de 4 parásitos por vacuola; un número que refleja la supresión del crecimiento, pero no la inhibición completa de la replicación por el estímulo de activación.

3. Evaluar los mutantes para determinar si el defecto está en el nivel de supervivencia del parásito o de replicación después de la activación de los macrófagos infectados

  1. Transferencia selecciona mutantes de parásitos a partir de placas de 96 pocillos (contenido de todo bien) a T25s que contienen células HFF y permitir la replicación.
  2. Cultivo de médula ósea macrófagos derivados de O / N en 8 portaobjetos de vidrio cámara a una concentración de 3 × 10 5 células / ml en 250 l de los medios de comunicación D10. Prepare una diapositiva a comparar pareplicación rasite en macrófagos ingenuos y una diapositiva adicional para comparar la replicación del parásito después de la activación de los macrófagos infectados.
  3. Parásitos y tachyzoite Cosecha cuentan en un hemocitómetro. Añadir 5 × 10 4 T. gondii parásitos a una cámara de pozo que contiene los macrófagos en los medios de comunicación D10 y la cultura durante 4 horas. Incluya un pocillo con tipo salvaje parásitos de los padres como un control. Inocular una diapositiva replicación idéntica con el mismo clon parásito que no recibirán los medios de activación con el fin de supervisar la replicación de los parásitos en macrófagos no tratados previamente.
  4. Deseche medios D10 de 1 de las cámara de diapositivas duplicadas y reemplazar con 250 l de "medios de activación". Deseche medios D10 de la otra diapositiva cámara de réplica y reemplazar con 250 l de los medios de comunicación D10. Incubar tanto el "activado" y "ingenuo" slide macrófagos con la tapa deslizante en cámara a 37 ° C y 5% de CO2 durante un additional 24-30 h.
  5. Fix, permeabilizar, y se desliza de bloques para la tinción y el análisis de los parásitos IFA como se describe en el Paso 1. Realizar tinción IFA con las cámaras intactas.
    1. Células Co-manchas con un anticuerpo para lisosomales membrana 1 asociado (LAMP1) o Lysotracker y el anticuerpo a T. gondii para evaluar si la activación de los macrófagos infectados está provocando la fusión de los PVs mutantes con los lisosomas (Figura 4).
    2. Utilice anticuerpos contra compartimentos / orgánulos específicos dentro del parásito / PV para la tinción por IFA para identificar alteraciones en el mutante de parásitos que son evidentes temprano después de la activación de los macrófagos 28.
      NOTA: Estas alteraciones pueden proporcionar información sobre el mecanismo que subyace a la deficiente supervivencia / replicación del mutante después de la activación de los macrófagos.
  6. Examinar los portaobjetos utilizando un aceite de fase de 100X microscopía de objetivo y de fluorescencia.
    1. Evaluar la replicación del parásito mediante la determinación de lanúmero de parásitos por PV en 100 vacuolas aleatorios. Realizar al menos 2 cargos de 100 vacuolas cada uno para el análisis estadístico.
    2. Evaluar la morfología del parásito general utilizando tanto análisis de fluorescencia, así como microscopía de contraste de fase. Ver parásitos correspondientes a la fase objetivo 100x. Parásitos sanos han parásitos herméticamente encerrado dentro de una vacuola ceñida. Los parásitos que tienen amplias vacuolas amorfos con llantas de fase densa o parásitos amorfos sugieren la muerte del parásito en lugar de sólo un defecto en la replicación (Figuras 1 y 3).

4. Evaluar si la susceptibilidad de Mutant parásitos a la activación de los macrófagos infectados se asocia con conocidos mediadores anti-microbianas

  1. Aislar los macrófagos derivados de médula ósea de tipo salvaje ratones C57 / BL6, iNOS - / -, gp91-phox - / - o Irgm1 / Irgm3 - / - ratones 32.
  2. Mac Cultura médula ósea respectivo derivadorophages O / N en 8 portaobjetos de vidrio cámara a una concentración de 3 × 10 5 células / ml en 250 l de los medios de comunicación D10.
  3. Proceda con desafío parásito, tinción IFA, y el análisis como se describe en el paso 3.
  4. Determinar si la capacidad de los parásitos mutantes para sobrevivir y replicarse después de la activación de los macrófagos infectados se restaura en la ausencia de oxígeno reactivo o las especies de nitrógeno o inmunidad específica GTPasas 28 relacionados.
  5. Utilice agentes farmacológicos, tales como donantes de óxido nítrico, para evaluar si los mediadores anti-microbianos específicos son suficientes por sí mismos para deteriorar parásitos mutantes en células HFF o macrófagos tratados previamente o si sólo actúan en concierto con otros mediadores de la activación de los macrófagos 28.

5. Evaluar si el defecto en la infección crónica Mutant Parásito Compromisos

  1. Aislar taquizoitos de tipo salvaje, mutante o genes suprimido dirigidos parásitos crecido en T25s containing células HFF. Los parásitos deben estar recién zadas a partir de cultivos HFF.
  2. Cuente parásitos utilizando un hemocitómetro. Parásitos resuspender en solución de Hanks equilibrada de sal (HBSS) a una concentración por ml apropiado para una dosis sub-letal del parásito entregado en 200 l por inyección intraperitoneal (IP).
  3. Utilice una jeringa de tuberculina de 1 ml y 25 G aguja para inyectar parásitos con un volumen de 200 l por vía intraperitoneal (IP). La dosis depende de la cepa de tipo salvaje del parásito y el genotipo del ratón.
    NOTA: Tipo I genotipos del parásito son letales para los ratones durante la etapa aguda de la infección, independientemente de la dosis de parásito y no son apropiados para los estudios de la infección crónica en ausencia de quimioterapia para T. gondii para suprimir la replicación del parásito.
  4. Treinta días después de la exposición parásito, sacrificar los ratones por inhalación de CO 2 de un tanque a presión en una cámara con poca gente (una jaula estándar tamaño del ratón puede contener no más de 5 mde hielo), seguido por dislocación cervical.
  5. Aislar el cerebro del ratón usando procedimientos establecidos 41-43.
    1. Coloque el ratón en su lado frontal. Pulverizar la cabeza con etanol al 70% para esterilizar la zona.
    2. Use tijeras afiladas para cortar el tronco cerebral. Utilice tijeras de disección para hacer un corte superficial lateralmente alrededor de la derecha y luego el lado izquierdo del cráneo a partir de la base del tallo cerebral. Utilice pinzas para pelar suavemente el cráneo para exponer el cerebro.
    3. Levante suavemente las tijeras del cerebro y colocar entre el cerebro y la base del cráneo para cortar el nervio olfativo para liberar al cerebro. Saque el cerebro con una pinza estéril o una espátula y colocar en una placa de Petri bacteriológica que contiene 10 ml de PBS estéril.
  6. Cortar el cerebro por la mitad con un bisturí estéril a través del centro entre los hemisferios derecho e izquierdo.
  7. Añadir medio del cerebro a un pequeño mortero que contiene 1 ml de PBS. Use el mortero parahacer una suspensión de tejido fino del cerebro que puede pasar a través de un gran calibre 20-200 l punta de la pipeta.
    NOTA: La otra mitad del cerebro debe fijarse en el 2,5% de formaldehído durante 1 hora si es necesario realizar cortes de tejidos para histopatología.
  8. Coloque 100 l de lisado cerebral en un tubo de microcentrífuga de 1,7 ml. Añadir 1 ml de 2,5% de formaldehído en PBS en el tubo que contiene el lisado de cerebro para fijar la suspensión de cerebro para la tinción. Incubar a TA durante 30 min.
  9. Centrifugar el lisado a 8.000 xg durante 5 min en una microcentrífuga y desechar cuidadosamente el sobrenadante.
  10. Añadir 1 ml de tampón de permeabilización / bloqueo para el lisado (10% de suero de cabra, 0,2% Triton X-100 en PBS). Incubar a TA durante 30 min.
  11. Centrifugar a lisado 8000 xg durante 5 min y retirar el sobrenadante.
  12. Añadir 200 l de FITC-conjugado dolichos biflorus agglutin (DBA). Utilice una dilución 1: 100 de la lectina en PBS más 10% de suero de cabra. Resuspender el lisado con la pipeta. Incubardurante 1 hora a RT.
    NOTA: DBA es un ligando que se une a CST1 en la pared del quiste parásito.
  13. Centrifugar a lisado 8000 xg durante 5 minutos y desechar el sobrenadante. Añadir 1 ml de PBS al sedimento. Incubar a temperatura ambiente durante 5 min. Repita PBS lavado 3x. Eliminar el sobrenadante tras el lavado final con una pipeta.
  14. Utilice un gran calibre 20-200 punta l pipeta para elaborar 5 l de lisado cerebro manchado y el lugar en un portaobjetos de microscopio. Montar la diapositiva con un mm cubreobjetos de 25 x 25 para crear una preparación en fresco del lisado cerebral. Haga 3 diapositivas repetir utilizando 5 l de lisado de cada cerebro.
  15. Cuente el número de quistes por cada alícuota de 5 l por microscopía de fluorescencia utilizando un objetivo de 10 aumentos (Figura 6).
    NOTA: Algunos quistes son grandes (8 o más parásitos aproximadamente), mientras que algunos son muy pequeños (1-2 parásitos por quiste). Contar el número total de quistes por cada diapositiva, pero el número de documento de gran función del número de pequeños quistes.
  16. Añadir el número de quistes deteja en los tres diferentes alícuotas 5 ly se multiplican por el factor de dilución total x 2 (sólo la mitad del cerebro se convirtió en un lisado) para estimar el número de quistes totales por cerebro.

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Resultados

Toxoplasma gondii replica libremente en macrófagos no tratados previamente y tiene un tiempo de duplicación entre 6-12 hr dependiendo de la cepa del parásito. La figura 1 muestra parásitos representativos en ingenuo frente a macrófagos derivados de médula ósea activados. Figura 2 muestra la morfología general de parásitos en HFF las células huésped a las 2, 4, 8, 16 y 32 parásitos / PV. En el protocolo actual, se permite que el parásito para invadir los macrófagos tratados prev...

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Discusión

El protocolo descrito proporciona un enfoque no sesgado que utiliza la activación de los macrófagos murinos derivadas de médula ósea y genética directa para aislar T. mutantes gondii con un defecto en su capacidad para sobrevivir activación de los macrófagos infectados. El fenotipo de la siguiente activación de los macrófagos mutantes normalmente cae en una de dos categorías: 1) Los parásitos aparecen intactos, pero no logran replicar más allá de 1 parásito por PV; 2) Los parásitos aparecer degradadas ...

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Divulgaciones

Los autores no tienen intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

Un agradecimiento especial al Dr. Peter Bradley por el anticuerpo para detectar las mitocondrias de T. gondii. El trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Salud Grants AI072028 y AI107431 a D.G.M y una generosa donación al Colegio Médico de Nueva York para el estudio de la medicina tropical.

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