El aislamiento de linfocitos de la piel humana para el Análisis y fenotípica<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultivo Celular

Resumen

Describimos un protocolo para aislar eficientemente las células T residentes en la piel de biopsias de piel humana. Este protocolo proporciona un número suficiente de linfocitos residentes viables en la piel humana para el análisis de citometría de flujo y el cultivo ex vivo.

Resumen

La piel humana tiene una función de barrera importante y contiene diversas células inmunes que contribuyen a la homeostasis del tejido y la protección contra los agentes patógenos. A medida que la piel es relativamente fácil acceso, que proporciona una plataforma ideal para estudiar los mecanismos de regulación inmune periférica. células residentes inmunes en sano conducta piel inmunovigilancia, pero también juegan un papel importante en el desarrollo de trastornos inflamatorios de la piel, tales como psoriasis. A pesar de ideas emergentes, nuestra comprensión de la biología subyacente de diversas enfermedades inflamatorias de la piel es aún limitada. Hay una necesidad de una buena calidad de las poblaciones (individual) de células aisladas a partir de muestras de piel biopsia. Hasta ahora, los procedimientos de aislamiento han sido seriamente obstaculizados por la falta de la obtención de un número suficiente de células viables. El aislamiento y el análisis posterior también se han visto afectados por la pérdida de marcadores de linaje de células inmunes, debido a la tensión mecánica y química causada por los procedimientos de disociación actuales para obtenersuspensión de células individuales. A continuación, describimos un método modificado para aislar las células T de la piel humana psoriásica saludable y participar mediante la combinación de disociación mecánica de la piel utilizando un disociador automatizado de tejidos y el tratamiento de colagenasa. Esta metodología conserva la expresión de la mayoría de los marcadores de linaje inmunes tales como CD4, CD8, Foxp3 y CD11c en la preparación de suspensiones de células individuales. Se muestran ejemplos de éxito de aislamiento de células T CD4 ⁺ y la posterior fenotípica y análisis funcional.

Introducción

La piel, como la interfaz principal entre el cuerpo y el medio ambiente, proporciona la primera línea de defensa contra la física externa, químicas y biológicas insultos tales como heridas, la radiación ultravioleta y los microorganismos. Piel comprende dos compartimientos principales, la epidermis y la dermis, y contiene una variedad de células inmunes incluyendo las células de Langerhans, macrófagos, células dendríticas (DC), y cerca de 20 millones de células T de memoria, casi dos veces el número presente en todo el volumen de sangre ^{1 , 2.} Una creciente cantidad de datos apoyan la noción de que la piel tiene funciones inmunológicas esenciales, tanto durante la homeostasis del tejido y en diversas condiciones patológicas. Se cree que las células inmunes residentes en la piel normal para llevar a cabo la inmunovigilancia ³ y se ha demostrado que desempeñan un papel en el desarrollo de trastornos inflamatorios tales como psoriasis ^4. En la piel lesional psoriásica, tanto CD4 ⁺ y CD8 ⁺ se infiltraron las células T eran observed y se demostró que la relación de la CD4 y CD8 varía en función del estado de la enfermedad ^5. Sin embargo, estas poblaciones de células son difíciles de estudiar porque las técnicas actuales permiten el aislamiento de sólo unas pocas células.

Las técnicas actualmente ampliamente utilizados para el aislamiento de células T de la piel humana se combinan disociación mecánica de la piel con tratamiento enzimático. Las biopsias de piel humana son ampliamente picada y se incubaron con enzimas como la tripsina, colagenasa y / o EDTA ^6-8. Teniendo en cuenta que la piel es un tejido de barrera que es altamente resistente a las fuerzas de tracción y desagregación mecánica, los métodos establecidos de aislamiento de células T producen muy pocas células, e incluso un menor número de células viables, lo que hace ex vivo de cultivo de células de estas poblaciones de células difícil y desafiante.

Aquí, se presenta un método modificado para aislar los linfocitos de la piel humana psoriásica saludable y participar mediante la combinación de mechandisociación ical de la piel usando un disociador de tejido automatizado en lugar del método establecido de picado ampliamente, junto con la digestión enzimática usando colagenasa. Se observaron varios subconjuntos de células inmunes viables, incluyendo países en desarrollo y las células T después de la preparación de una suspensión de una sola célula. Es importante destacar que la expresión de los marcadores de superficie CD3, CD4 y CD8 se conservó bien. Las células preparadas de este modo, están listos para su uso en cultivos de células ex vivo o análisis de citometría de flujo. Este protocolo se ha empleado con éxito para el análisis de biopsias de piel individuales (4 mm) derivadas de la piel lesional de pacientes con psoriasis. Los resultados mostraron que las células T de la piel del paciente residente producen citoquinas inflamatorias como la más IL-17 y IFN en comparación con voluntarios sanos ^9.

Protocolo

NOTA: Las biopsias de piel de individuos sanos se obtuvieron a partir de restos de piel abdominal de los individuos sometidos a cirugía plástica electiva tras el consentimiento informado por escrito o por vía oral para uso científico. El uso de piel humana fue aprobado y de acuerdo con las normas establecidas por los comités de ética médica para la investigación humana del centro médico de la Universidad Radboud, Nijmegen, Países Bajos y la Universidad de Essen, Alemania.

1. Preparación de suspensiones de células individuales de la piel humana (Trabajo estéril en un gabinete de flujo si el cultivo celular subsiguiente es obligatorio)

1. Preparar medio de cultivo celular: RPMI 1640 + penicilina / estreptomicina (concentraciones finales de 100 unidades / ml y 100 mg / ml, respectivamente) + piruvato (0,02 mM) y glutamax (0,02 mM), sin suero añadido.
2. Para preparar el medio de cultivo completo: medio de cultivo preparado en el paso 1.1 + 10% de suero humano agrupado (HPS); almacenar a 4 ° C. Llevar medio a 20 ° C ± 2 frente a nosotrosEn g.
3. Obtener la biopsia de la piel utilizando un instrumento de biopsia por punción redonda de 4 mm y mantenerlo en medio de cultivo completo RPMI 1640 a 20 ° C ± 2 para un máximo de 4 horas oa 4 ° C ON. Procesar la biopsia tan pronto como sea posible a su llegada al laboratorio.
   NOTA: más largo de almacenamiento de la piel influirá en el rendimiento de células y la viabilidad celular.
4. Etiquetar un tubo de disociación con tapa azul y añadir 5 ml de medio de cultivo completo en el tubo etiquetado.
5. Añadir 2 ml de medio de cultivo completo en cada pocillo (un total de 3 pocillos) de una placa de cultivo estéril de 6 pocillos. Utilice herramientas estériles para colocar la biopsia en un solo pozo, enjuague, moverlo hacia un segundo pozo y repetir este paso una vez más, logrando así un total de tres enjuagues.
6. Transferir la biopsia de la piel bien enjuagado a una placa de Petri estéril, añadir 100 l de medio de cultivo completo en la parte superior de la biopsia, y cuidadosamente raspar el tejido graso subcutáneo utilizando un acero inoxidable desechable bisturí estéril.
   NOTA: Jes que es un paso crítico.
7. Cortar cada biopsia de piel en 4 trozos más pequeños en una placa de Petri estéril. Transferir las muestras (hasta cuatro de las biopsias de 4 mm por tubo) en el tubo de disociación preparado que contiene 5 ml de medio de cultivo completo.
8. Cerrar herméticamente los tubos con la tapa y coloque boca abajo a la camisa del disociador automatizado de tejidos. Asegúrese de que todo el material de muestra se encuentra en la zona del rotor.
9. Iniciar el proceso de disociación mediante la ejecución del "_01 m_spleen programa" (un programa predefinido proporcionada por la memoria interna del instrumento o de la tarjeta de programa acompañada) para disociar la biopsia a la velocidad de rotación apropiada para 56 seg.
10. Después del procesamiento, separar el tubo de la disociación del disociador y asegurarse de que todo el material disociado se recoge en la parte inferior del tubo.
11. Añadir 150 l de colagenasa IA (80 mg / ml) en el tubo de disociación e incubar la muestra en un baño de agua con agitación a 37° C durante 60 min. Añadir 100 l de DNasa I (5 MU / ml) en tubo de thedissociation, mezclar bien.
    NOTA: Mayor concentración de colagenasa o el tiempo de incubación más largo va a alterar la viabilidad celular.
12. Una el tubo de disociación para la manga de la disociador tejido automatizado y ejecutar el "m_ programa bazo _01" para disociar la biopsia una vez más.
13. Colocar un filtro de células de nylon 70 M en la parte superior de un tubo Falcon 50 ml. Aplicar materiales de muestra disociadas a este filtro de células para eliminar grupos de células / restos de tejido.
14. Lavar filtro de células una vez con 5 ml de medio de cultivo completo. Centrifugar a 20 ° C ± 2, 450 xg durante 10 min y el sobrenadante aspirado.
15. Repita el paso de lavado una vez más. Volver a suspender los sedimentos celulares en 300 l de medio de cultivo completo. una sola célula suspensiones están listos para su posterior análisis; continuar con protocolos para el cultivo de células ex vivo o citometría de flujo análisis.
16. En caso de un nuevo itinción de citocinas ntracellular, estimular las células con PMA (12,5 ng / ml), ionomicina (500 ng / ml) y Brefeldine A (5 g / ml) durante 4 horas a 37 ° C, 5% de CO ₂ incubadora durante 4 h antes de la realización de flujo El análisis de citometría.

2. policlonal activación de células T cutáneas Residentes (Ex Vivo Cultura de la célula)

1. Alícuota de 100 l suspensiones unicelulares (preparado en la etapa 1.15) en una placa de fondo redondo de 96 pocillos.
   NOTA: Para cada uno de 4 mm biopsia de la piel, las suspensiones de una sola célula adquiridos se pueden dividir en al menos dos pocillos de una placa de 96 pocillos.
2. Añadir anti-CD3 / anti-CD28 microperlas recubiertas con mAb (25.000 cuentas por pocillo), recombinante humana de citoquinas rIL-2 (concentración final 25 U / ml) y rIL-1ß (concentración final 50 ng / ml).
3. Cubrir la placa de cultivo con una tapa de placa de marcado, se incuban en 5% de CO _{2, el} 100% de humedad, 37 ° C incubadora. Cambie medio cuando el color medio se pone en amarillo.
   NOTA: Una colonia de células claras se puede observar a partir de día 8 de cultivo celular.

3. Análisis de citometría de flujo de células de la piel primaria / Residentes T cultivadas

1. Preparar tampón FACS: PBS + BSA al 0,2%.
2. Transferencia de células de interés en una placa de 96 pocillos de fondo en v. Centrifugar a 20 ° C ± 2, 450 xg durante 2 min, y el sobrenadante aspirado.
3. Resuspender el precipitado en 100 l de PBS. Centrifugar a 20 ° C ± 2, 450 xg durante 2 min, y el sobrenadante aspirado.
4. Las células se tiñen con 100 l de eFluorescence780 preparados conjugados colorante de viabilidad corregible (1: 1000 dilución utilizando PBS) a 4 ° C durante 30 min. Añadir 100 l de tampón de FACS, se centrifuga a 20 ° C ± 2, 450 xg durante 2 min, y el sobrenadante aspirado.
5. Seleccionar mAbs requeridos marcador de superficie celular, por ejemplo: CD45-BV421 (HI30, 01:20), CD3-ECD (UCHT1, 1:50), CD4-PC5.5 (1388,2, 1: 200), CD8-APC-AlexFluo700 (B9.11, 1: 400), CD14-FITC (TUK4, 01:50), CD19-APC-AlexFluo750 (13-119, 1:50), CD56-PE (MEM-188, 1:50), CD25-PeCy7 (FC96, 1:50), CD11c-PeCy7 (BU15, 1:10), y CD1c-APC (AD5-8E7, 01:10), preparar los mAbs mezcla usando tampón de FACS en función de cada factor de dilución mAb probado. Definir ajustes de la compuerta utilizando control de isotipo de anticuerpo junto con la muestra no mancha.
6. Añadir 25 l de preparado mAbs-mezcla en cada pocillo. Incubar 20 minutos a 20 ° C ± 2, protegerlo de la luz.
7. Añadir 100 l de tampón de FACS, se centrifuga a 20 ° C ± 2, 450 xg durante 2 min, y el sobrenadante aspirado.
8. Para las muestras que sólo requieren tinción de la superficie celular, continúe con el paso 3.16.
9. En el caso de la tinción de Foxp3 intra-celular:
   1. Preparar la fijación y permeabilización de amortiguación mediante la mezcla de una parte de concentrado con 3 partes de diluyentes.
   2. Preparar tampón de permeabilización 1x: 1 parte de tampón de permeabilización 10x + 9 partes de H ₂ O. esterilizada
10. pellets de resuspender en 100 l de fijación y permeabilición tampón, mezclar bien e incubar a 4 ° C durante 30 min.
11. Añadir 100 l de tampón de permeabilización a cada pocillo, se centrifuga a 450 xg a TA durante 2 min, y el sobrenadante aspirado.
12. Lavar las células con tampón de permeabilización una vez más.
13. Seleccionar mAbs intracelulares necesarias, por ejemplo, Foxp3-eFluo450 (PCH101, 01:50), IL-17A-AlexFluo488 (eBio64DEC1, 01:50) y IFN-PeCy7 (4S.B3, 1: 400). Preparar la mezcla de anticuerpos monoclonales usando tampón de permeabilización que contenía suero de rata normal 2% de acuerdo a cada factor de dilución del AcMo probado. Definir ajustes de la compuerta utilizando control de isotipo de anticuerpo junto con la muestra no mancha.
14. Añadir 20 l de preparado mAb-mezcla en cada pocillo. Incubar a 4 ° C durante 30 minutos, protegerlo de la luz.
15. Después de 30 min de incubación, añadir 100 l de tampón de permeabilización en cada pocillo. Centrifugar a 20 ° C ± 2, 450 xg durante 2 min, y el sobrenadante aspirado.
16. Lavar las células con buffe permeabilizaciónr una vez más. sedimento se vuelve a suspender en 110 l de tampón FACS, y las suspensiones de células en un tubo de transferencia de microFACS.
    NOTA: La muestra está lista para medición mediante citometría de flujo 10-color.
17. En el caso del número de células exacta requerida, añadir 10 l de suspensión uniforme bien mezclada de fluoroesferas en cada muestra inmediatamente antes de realizar las mediciones de citometría de flujo.

Resultados

El protocolo que aquí se presenta producirá entre 2.200 ± 615 (media ± SEM, piel de voluntarios sanos) hasta 178.000 ± 760 (media ± SEM, piel lesionada de pacientes con psoriasis) linfocitos viables de la piel humana cuando se utiliza una sola biopsia de piel de 4 mm.

Se identificaron diferentes tipos de células CD45 ⁺ en una sola célula suspensiones derivadas de la piel de individuos sanos, incluyendo las células T CD4 ⁺ (~ 45%), las células T CD8 ⁺ (~ 30%),...

Discusión

A continuación, se presenta un protocolo para aislar eficazmente las células T residentes de la piel a partir de biopsias de piel humana. La ventaja de este protocolo es el aislamiento de un número relativamente alto de linfocitos viables, y la expresión de marcadores de superficie correspondientes. Los subconjuntos de células identificadas fueron:, células CD4 ⁺ y linfocitos T CD8 ⁺ y CD25 ⁺ Foxp3 ⁺ CD11c ⁺ DCS. Es importante destacar que la cultura ex vivo

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Punch de biopsia desechable	Kai Europe	BP-40F	4 mm
Bisturíes estériles desechables	Dalhausen 1100000510
gentleMACS Tubo C	Miltenyi Biotech	130-093-237	Con tapa azul, utilizado como tubo de disociación.
gentleMACS Disociator	Miltenyi Biotech	130-093-235	Disociador de tejidos automatizado. Uso del "programa spleen_01" para la disociación de la biopsia de piel.
Colador de células	BD	352350	70 y micro; m nylon
Placa inferior en U de 96 pocillos	Greiner Bio-One	650180
RPMI 1640	Life Technologies	22409-015
Piruvato de sodio	Life Technologies	11360-039
GlutaMAX	Life Technologies	35050-061
Penicilina/estreptomicina	Life Technologies	15140-122
Humano Suero agrupado (HPS)	preparado
Colagenasa I	Sigma-Aldrich	C2674	Tipo 1-A, adecuado para cultivo celular
DNasa I	Calbiochem	260913
PBS	B Braun 3623140
BSA	Sigma-Aldrich	A4503-500G
Colorante de viabilidad fijable (FVD) APC-eFluo780	eBioscience	65-0865-18	Teñir las células muertas antes de la fijación celular; diluir con PBS a 1:1.000
Concentrado de fijación/permeabilización	eBioscience	00-5123-43
Diluyente de fijación/permeabilización	eBioscience	00-5223-56
Tampón de permeabilización (10x)	eBioscience	00-8333-56
BV421 Ratón anti-humano CD45	BD		563879 Clon: HI30; factor de dilución 1:50
FITC Ratón anti-humano CD14	Dako	T0844	Clon: TUK4; factor de dilución 1:50
PE Ratón anti-humano CD56	Dako	R7127	Clon: MOC-1; factor de dilución 1:50
ECD Ratón anti-humano CD3	Beckman - Coulter	A07748	Clon: UCHT1; factor de dilución 1:50 para la tinción superficial; factor de dilución 1:25 para la tinción intracelular.
PC5.5 Ratón anti-humano CD4	Beckman - Coulter	B16491	Clon: 13B8.2; factor de dilución 1:200
PeCy7 Ratón anti-humano CD11c	Beckman - Coulter	A80249	Clon: BU15; factor de dilución 1:50
APC Ratón anti-humano CD1c	Miltenyi Biotech	130-090-903	Clon: AD5-8E7; factor de dilución 1:10
APC-AlexFluo700 Ratón anti-humano CD8	Beckman - Coulter	A66332	Clon: B9.11; factor de dilución 1:400
APC-AlexFluo750 Ratón antihumano CD19	Beckman - Coulter	A94681	Clon: J3-119; factor de dilución 1:50
PeCy7 Ratón antihumano CD25	eBioscience	AD5-8E7	Clon: BC96; factor de dilución 1:50
Rata PE anti-humana CLA	Miltenyi Biotech	130-091-635	clon: HECA-452; factor de dilución 1:
eFluo450 Rata anti-humana Foxp3	eBIoscience	48-4776-42	Clon: PCH101; tinción intracelular; factor de dilución 1:50
AlexFluo488 Ratón anti-humano IL-17A	eBioscience	53-7179-42	Clon: eBio64DEC17; tinción intracelular; factor de dilución 1:50
PeCy7 Ratón anti-humano IFNg	eBioscience	25-7319-41	Clon: 4S. B3; tinción intracelular; factor de dilución 1:400
fluorosferas de recuento de flujo	Beckman - Coulter	7547053	Cuentas de conteo, para citometría de flujo

internamente