Waiting
Procesando inicio de sesión ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

प्ररूपी विश्लेषण और के लिए मानव त्वचा से लिम्फोसाइट अलगाव Published: April 8, 2016 doi: 10.3791/52564
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1
1Laboratory of Medical Immunology, Department of Laboratory Medicine, Radboud University Medical Centre, 2Department of Dermatology, Radboud University Medical Centre

Abstract

मानव त्वचा के एक महत्वपूर्ण बाधा समारोह है और विभिन्न प्रतिरक्षा कोशिकाओं है कि ऊतक homeostasis और रोगाणुओं से संरक्षण के लिए योगदान होता है। के रूप में त्वचा का उपयोग करने के लिए अपेक्षाकृत आसान है, यह परिधीय प्रतिरक्षा नियामक तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक आदर्श मंच प्रदान करता है। स्वस्थ त्वचा के आचरण immunosurveillance में प्रतिरक्षा कोशिकाओं के निवासी, लेकिन यह भी इस तरह के सोरायसिस के रूप में भड़काऊ त्वचा रोग, के विकास में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। उभरते अंतर्दृष्टि के बावजूद, जीव विज्ञान विभिन्न भड़काऊ त्वचा रोगों अंतर्निहित के बारे में हमारी समझ अभी भी सीमित है। अच्छी गुणवत्ता (एकल) सेल biopsied त्वचा के नमूनों से पृथक आबादी के लिए एक की जरूरत है। अब तक, अलगाव प्रक्रियाओं को गंभीरता से व्यवहार्य कोशिकाओं के लिए पर्याप्त संख्या में प्राप्त की कमी के द्वारा बाधा उत्पन्न किया गया है। अलगाव और बाद के विश्लेषण भी वर्तमान हदबंदी प्रक्रियाओं की वजह से प्राप्त करने के लिए यांत्रिक और रासायनिक तनाव के कारण, प्रतिरक्षा सेल वंश मार्कर के नुकसान से प्रभावित किया गया हैएकल कक्ष निलंबन। यहाँ, हम यांत्रिक त्वचा हदबंदी के संयोजन एक स्वचालित ऊतक dissociator और collagenase उपचार का उपयोग करके दोनों स्वस्थ है और इसमें शामिल psoriatic मानव त्वचा से टी कोशिकाओं को अलग-थलग करने के लिए एक संशोधित विधि का वर्णन है। इस पद्धति एकल कक्ष निलंबन की तैयारी पर ऐसी सीडी 4, सीडी 8, Foxp3 और CD11c के रूप में सबसे प्रतिरक्षा वंश मार्करों की अभिव्यक्ति को बरकरार रखता है। सफल सीडी 4+ टी सेल अलगाव और बाद में प्ररूपी और कार्यात्मक विश्लेषण के उदाहरण दिखाए जाते हैं।

Introduction

त्वचा, शरीर और पर्यावरण के बीच प्राथमिक इंटरफेस के रूप में, बाहरी भौतिक, रासायनिक और ऐसे लोग घायल हो गए, पराबैंगनी विकिरण और सूक्ष्म जीवों के रूप में जैविक अपमान के खिलाफ रक्षा की पहली पंक्ति प्रदान करता है। त्वचा की दो मुख्य डिब्बों, एपिडर्मिस और डर्मिस शामिल हैं, और Langerhans कोशिकाओं, मैक्रोफेज, वृक्ष के समान कोशिकाओं (डीसी), और लगभग 20 अरब स्मृति टी कोशिकाओं सहित प्रतिरक्षा कोशिकाओं की एक किस्म है, लगभग दो बार पूरे रक्त की मात्रा 1 में नंबर उपस्थित होता है 2। डेटा के एक बढ़ती शरीर धारणा है कि त्वचा, आवश्यक प्रतिरक्षा कार्य किया है दोनों ऊतक homeostasis के दौरान और विभिन्न रोग की स्थिति में समर्थन करता है। इम्यून सामान्य त्वचा में निवासी कोशिकाओं immunosurveillance 3 संचालन करने के लिए लगा रहे हैं और इस तरह के सोरायसिस 4 के रूप में भड़काऊ विकारों के विकास में एक भूमिका निभाने के लिए दिखाया गया है। Psoriatic lesional त्वचा में, दोनों सीडी 4 + और ​​सीडी 8 + घुसपैठ की टी कोशिकाओं OBS थेerved और यह दिखाया गया था कि सीडी 4 और सीडी 8 के अनुपात से रोग की स्थिति 5 पर निर्भर करता है। हालांकि, कोशिकाओं की इन आबादियों अध्ययन करने के लिए है, क्योंकि मौजूदा तकनीक केवल कुछ कोशिकाओं के अलगाव की अनुमति मुश्किल हो जाता है।

मानव त्वचा से टी सेल अलगाव के लिए वर्तमान में व्यापक रूप से इस्तेमाल की तकनीक enzymatic उपचार के साथ यांत्रिक त्वचा हदबंदी गठबंधन। मानव त्वचा बायोप्सी बड़े पैमाने पर कीमा और trypsin, collagenase और / या EDTA 6-8 की तरह एंजाइमों के साथ incubated हैं। यह देखते हुए कि त्वचा एक बाधा ऊतक जो उच्च तन्यता बलों और मैकेनिकल disaggregation के लिए प्रतिरोधी है, टी सेल अलगाव के तरीकों की स्थापना बहुत कुछ कोशिकाओं, और व्यवहार्य कोशिकाओं की भी कम संख्या है, जो इन सेल आबादी के पूर्व vivo सेल संस्कृति बनाता है कठिन और उत्पादन चुनौतीपूर्ण।

यहाँ, हम mechan के संयोजन से दोनों स्वस्थ है और इसमें शामिल psoriatic मानव त्वचा से लिम्फोसाइट अलग करने के लिए एक संशोधित विधि रिपोर्टत्वचा की राजनैतिक हदबंदी, एक स्वचालित ऊतक dissociator के बजाय बड़े पैमाने पर नख़रेबाज़ की स्थापना की विधि का उपयोग enzymatic पाचन कोलैजिनेज़ उपयोग करने के साथ एक साथ। विभिन्न व्यवहार्य प्रतिरक्षा सेल डीसी और टी कोशिकाओं सहित सबसेट एक एकल कोशिका निलंबन की तैयारी के बाद मनाया गया। महत्वपूर्ण बात सतह मार्कर CD3, सीडी 4 और सीडी 8 की अभिव्यक्ति अच्छी तरह से संरक्षित किया गया था। कोशिकाओं को इस तरह से तैयार है, पूर्व vivo सेल संस्कृतियों या प्रवाह cytometric विश्लेषण में इस्तेमाल के लिए तैयार हैं। इस प्रोटोकॉल सफलतापूर्वक एकल त्वचा बायोप्सी (4 मिमी) सोरायसिस के मरीजों की lesional त्वचा से ली गई है के विश्लेषण के लिए नियोजित किया गया है। नतीजे बताते हैं कि त्वचा निवासी रोगी टी कोशिकाओं को स्वस्थ स्वयंसेवकों से 9 आईएल -17 और IFNγ की तरह अधिक भड़काऊ साइटोकिन्स उत्पादन की तुलना में।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

नोट: स्वस्थ व्यक्तियों से त्वचा बायोप्सी वैज्ञानिक प्रयोग के लिए मौखिक या लिखित सूचित सहमति के बाद वैकल्पिक प्लास्टिक सर्जरी के दौर से गुजर व्यक्तियों के पेट की त्वचा बचे हुए से प्राप्त किया गया। मानव त्वचा के उपयोग को मंजूरी गया था और नियमों Radboud विश्वविद्यालय के मेडिकल सेंटर, Nijmegen, नीदरलैंड और Essen, जर्मनी के विश्वविद्यालय के मानव अनुसंधान के लिए मेडिकल नैतिक समितियों द्वारा निर्धारित मानकों के अनुसार।

1. मानव त्वचा से एकल कक्ष निलंबन की तैयारी (एक प्रवाह कैबिनेट में काम बाँझ यदि इसके बाद सेल संस्कृति है आवश्यक)

  1. सेल संस्कृति के माध्यम से तैयार: RPMI 1640 + पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (अंतिम सांद्रता 100 इकाइयों / एमएल और 100 माइक्रोग्राम / एमएल, क्रमशः) + पाइरूवेट (0.02 मिमी) और Glutamax (0.02 मिमी), कोई सीरम के साथ जोड़ा जाता है।
  2. पूरी संस्कृति के माध्यम से तैयार: संस्कृति के माध्यम से कदम 1.1 + 10% मानव जमा सीरम (एचपीएस) में तैयार; 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर। हमारे सामने 20 डिग्री सेल्सियस ± 2 के लिए मध्यम लाओआईएनजी।
  3. एक 4 मिमी दौर बायोप्सी पंच साधन का उपयोग कर त्वचा बायोप्सी प्राप्त करें और अप करने के लिए 4 घंटे के लिए या 4 डिग्री सेल्सियस पर कम से 20 डिग्री सेल्सियस ± 2 पर RPMI1640 पूरा मध्यम संस्कृति में इसे रख लो। प्रयोगशाला में आगमन पर जितनी जल्दी हो सके बायोप्सी प्रक्रिया।
    नोट: त्वचा के लंबे समय तक भंडारण सेल उपज और सेल व्यवहार्यता को प्रभावित करती है।
  4. एक नीले रंग की छाया हुआ हदबंदी ट्यूब लेबल और लेबल ट्यूब में 5 मिलीलीटर पूरी संस्कृति के माध्यम जोड़ें।
  5. पूरी संस्कृति के माध्यम से 2 मिलीलीटर प्रत्येक में अच्छी तरह से एक बाँझ 6 अच्छी तरह से संस्कृति की थाली के (कुल 3 कुओं में) जोड़ें। बाँझ उपकरणों का उपयोग एक ही अच्छी तरह से में बायोप्सी के लिए जगह, कुल्ला, यह एक दूसरे को अच्छी तरह से खत्म करने के लिए कदम है और इस कदम को एक बार और दोहराने के लिए, इस प्रकार तीन rinses की कुल प्राप्त करने।
  6. एक बाँझ पेट्री डिश के लिए अच्छी तरह से rinsed त्वचा बायोप्सी स्थानांतरण बायोप्सी के शीर्ष पर पूरी संस्कृति के माध्यम से 100 μl जोड़ने के लिए, और ध्यान से एक स्टेनलेस स्टील डिस्पोजेबल बाँझ स्केलपेल का उपयोग वसा ऊतक परिमार्जन।
    नोट: गुएक महत्वपूर्ण कदम है।
  7. एक बाँझ पेट्री डिश पर 4 छोटे टुकड़ों में प्रत्येक त्वचा बायोप्सी कट। स्थानांतरण के नमूने (अप ट्यूब प्रति 4 मिमी बायोप्सी के चार करने के लिए) पूरी संस्कृति के माध्यम से 5 मिलीग्राम से युक्त तैयार हदबंदी ट्यूब करने के लिए।
  8. कसकर टोपी के साथ ट्यूब बंद करें, और स्वचालित ऊतक dissociator की आस्तीन को उल्टा देते हैं। सुनिश्चित करें कि सभी नमूना सामग्री रोटर के क्षेत्र में स्थित है बनाओ।
  9. "कार्यक्रम m_spleen _01" (साधन के आंतरिक स्मृति द्वारा या के साथ कार्यक्रम कार्ड द्वारा प्रदान की एक पूर्व निर्धारित कार्यक्रम) 56 सेकंड के लिए उचित घूर्णन गति पर बायोप्सी अलग कर देना चलाने के द्वारा पृथक्करण की प्रक्रिया शुरू करें।
  10. प्रसंस्करण के बाद, dissociator से हदबंदी ट्यूब अलग करें और सुनिश्चित करें कि सभी अलग सामग्री ट्यूब के नीचे एकत्र किया जाता है बनाते हैं।
  11. 150 37 पर एक मिलाते हुए पानी के स्नान में हदबंदी ट्यूब में कोलैजिनेज़ आइए (80 मिलीग्राम / एमएल) μl जोड़ें और नमूना सेते60 मिनट के लिए सें। thedissociation ट्यूब में DNase मैं के 100 μl (5 म्यू / एमएल) जोड़ें, मिश्रण अच्छी तरह से।
    नोट: कोलैजिनेज़ या उससे अधिक समय ऊष्मायन समय सेल व्यवहार्यता बदल जाएगा के उच्च एकाग्रता।
  12. स्वचालित ऊतक dissociator की आस्तीन के लिए हदबंदी ट्यूब देते हैं और बायोप्सी एक बार और अलग कर देना "कार्यक्रम m_ तिल्ली _01" चलाते हैं।
  13. एक 50 मिलीलीटर फाल्कन ट्यूब के शीर्ष पर एक 70 माइक्रोन नायलॉन सेल झरनी रखें। इस सेल झरनी के लिए अलग नमूना सामग्री लागू सेल clumps / ऊतक मलबे को हटाने के लिए।
  14. पूरी संस्कृति के माध्यम से 5 मिलीलीटर के साथ एक बार सेल झरनी धो लें। 20 डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्रित्र ± 2, 10 मिनट और महाप्राण सतह पर तैरनेवाला के लिए 450 XG।
  15. धोने कदम दोहराएँ एक बार और। पूरी संस्कृति के माध्यम से 300 μl में Resuspend सेल छर्रों। एकल कोशिका निलंबन आगे विश्लेषण के लिए तैयार कर रहे हैं; पूर्व vivo सेल संस्कृति के लिए प्रोटोकॉल के साथ जारी रखने या प्रवाह cytometry विश्लेषण।
  16. आगे मैं के मामले मेंntracellular साइटोकाइन धुंधला, 37 डिग्री सेल्सियस से कम 4 घंटे के लिए पीएमए (12.5 एनजी / एमएल), Ionomycin (500 एनजी / एमएल) और Brefeldine ए (5 माइक्रोग्राम / एमएल) के साथ कोशिकाओं को उत्तेजित, 5% सीओ 2 प्रवाह के प्रदर्शन से पहले 4 घंटे के लिए इनक्यूबेटर cytometry विश्लेषण।

2. त्वचा निवासी टी कोशिकाओं की पॉलीक्लोनल सक्रियण (पूर्व vivo सेल संस्कृति)

  1. अशेष 100 μl एकल कोशिका निलंबन (कदम 1.15 में तैयार) एक दौर नीचे 96 अच्छी तरह से थाली में।
    नोट: 4 मिमी त्वचा बायोप्सी से प्रत्येक के लिए, का अधिग्रहण एकल कोशिका निलंबन एक 96 अच्छी तरह से थाली में कम से कम दो कुओं में विभाजित किया जा सकता है।
  2. विरोधी CD3 / विरोधी CD28 एमएबी लेपित microbeads (अच्छी तरह से प्रति 25,000 मोती), पुनः संयोजक मानव साइटोकाइन आरआईएल -2 (अंतिम एकाग्रता 25 यू / एमएल) और आरआईएल-1β (अंतिम एकाग्रता 50 एनजी / एमएल) जोड़ें।
  3. एक अच्छी तरह से लेबल प्लेट ढक्कन के साथ संस्कृति की थाली कवर, 5% में सेते सीओ 2, 100% नमी 37 सी इनक्यूबेटर °। मध्यम बदलें जब मध्यम रंग पीला करने के लिए बदल जाता है।

3. प्राथमिक के फ्लो का विश्लेषण / संवर्धित त्वचा निवासी टी कोशिकाओं

  1. पीबीएस + 0.2% बीएसए: FACS बफर तैयार करें।
  2. एक वि नीचे 96 अच्छी तरह से थाली में ब्याज की कोशिकाओं स्थानांतरण। 20 डिग्री सेल्सियस ± 2, 2 मिनट के लिए 450 XG पर अपकेंद्रित्र, और महाप्राण सतह पर तैरनेवाला।
  3. पीबीएस के 100 μl में गोली Resuspend। 20 डिग्री सेल्सियस ± 2, 2 मिनट के लिए 450 XG पर अपकेंद्रित्र, और महाप्राण सतह पर तैरनेवाला।
  4. 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर: (1,000 कमजोर पड़ने पीबीएस का उपयोग 1) 100 संयुग्मित फिक्स व्यवहार्यता डाई तैयार eFluorescence780 की μl के साथ दाग कोशिकाओं। 20 डिग्री सेल्सियस ± 2, 2 मिनट के लिए 450 XG, और महाप्राण सतह पर तैरनेवाला पर FACS बफर, सेंट्रीफ्यूज के 100 μl जोड़ें।
  5. उदाहरण के लिए, आवश्यक कोशिका की सतह मार्कर MABS चयन करें: CD45-BV421 (HI30, 1:20), CD3-ईसीडी (UCHT1, 1:50), सीडी 4-PC5.5 (1388.2, 1: 200), सीडी 8 एपीसी-AlexFluo700 (B9.11, 1: 400), CD14-FITC (TUK4, 1:50), CD19 एपीसी-AlexFluo750 (13-119, 1:50), CD56 पीई (सदस्य-188, 1:50), CD25-PeCy7 (BC96, 1:50), CD11c-PeCy7 (BU15, 1:10), और CD1c एपीसी (AD5-8E7, 1:10), प्रत्येक एमएबी कमजोर पड़ने कारक का परीक्षण के अनुसार FACS बफर का उपयोग MABS-मिश्रण तैयार करते हैं। एक साथ एंटीबॉडी के निर्धारण नियंत्रण का उपयोग गैर दाग नमूने के साथ गेट सेटिंग्स को परिभाषित करें।
  6. प्रत्येक कुएं में तैयार MABS-मिश्रण के 25 μl जोड़ें। 20 डिग्री सेल्सियस ± 2 पर 20 मिनट सेते हैं, प्रकाश से बचाने के।
  7. 20 डिग्री सेल्सियस ± 2, 2 मिनट के लिए 450 XG, और महाप्राण सतह पर तैरनेवाला पर FACS बफर, सेंट्रीफ्यूज के 100 μl जोड़ें।
  8. नमूने है कि केवल कोशिका की सतह धुंधला की आवश्यकता के लिए, चरण 3.16 के साथ जारी है।
  9. अंतर सेलुलर Foxp3 धुंधला के मामले में:
    1. diluents के 3 भागों के साथ ध्यान केंद्रित करने के एक भाग के मिश्रण से निर्धारण और permeabilization बफर तैयार करें।
    2. 1x permeabilization बफर तैयार: 1 10x का हिस्सा permeabilization बफर + 9 निष्फल एच 2 ओ के कुछ हिस्सों
  10. निर्धारण और permeabili के 100 μl में Resuspend छर्रोंzation बफर, मिश्रण अच्छी तरह से, और 4 पर सेते 30 मिनट के लिए सें।
  11. 2 मिनट के लिए आरटी पर 450 XG, और महाप्राण सतह पर तैरनेवाला पर प्रत्येक अच्छी तरह से, सेंट्रीफ्यूज के लिए 100 μl permeabilization बफर जोड़ें।
  12. permeabilization बफर एक और अधिक समय के साथ कोशिकाओं को धो लें।
  13. आवश्यक intracellular MABS, उदाहरण के लिए चयन करें, Foxp3-eFluo450 (PCH101, 1:50), आईएल 17A-AlexFluo488 (eBio64DEC1, 1:50) और IFNγ-PeCy7 (4S.B3, 1: 400)। permeabilization प्रत्येक एमएबी कमजोर पड़ने कारक का परीक्षण के अनुसार 2% सामान्य चूहे सीरम युक्त बफर का उपयोग Mabs मिश्रण तैयार करें। एक साथ एंटीबॉडी के निर्धारण नियंत्रण का उपयोग गैर दाग नमूने के साथ गेट सेटिंग्स को परिभाषित करें।
  14. प्रत्येक कुएं में तैयार एमएबी-मिश्रण के 20 μl जोड़ें। 4 पर सेते 30 मिनट के लिए डिग्री सेल्सियस, प्रकाश से बचाने के।
  15. के बाद 30 मिनट ऊष्मायन, प्रत्येक कुएं में permeabilization बफर के 100 μl जोड़ें। 20 डिग्री सेल्सियस ± 2, 2 मिनट के लिए 450 XG पर अपकेंद्रित्र, और महाप्राण सतह पर तैरनेवाला।
  16. permeabilization buffe के साथ कोशिकाओं को धो लेंआर एक बार और। microFACS ट्यूब में FACS बफर के 110 μl, और हस्तांतरण सेल निलंबन में resuspend गोली।
    नोट: नमूना 10-रंग प्रवाह cytometry का उपयोग माप के लिए तैयार है।
  17. सटीक सेल अपेक्षित संख्या के मामले में तुरंत प्रवाह cytometry का उपयोग माप के प्रदर्शन से पहले प्रत्येक नमूने में fluorospheres की अच्छी तरह से मिश्रित वर्दी निलंबन के 10 μl जोड़ें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल निकलेगा जब एक भी 4 मिमी त्वचा बायोप्सी का उपयोग कर 2200 ± 615 (मतलब ± SEM, स्वस्थ स्वयंसेवकों की त्वचा) अप करने के लिए 178,000 760 के बीच ± मानव त्वचा से व्यवहार्य लिम्फोसाइटों (± SEM, सोरायसिस के मरीजों की त्वचा lesional मतलब है)।

CD45 + कोशिकाओं के विभिन्न प्रकार सीडी 4+ टी कोशिकाओं (~ 45%), सीडी 8 + टी कोशिकाओं (~ 30%) सहित स्वस्थ व्यक्तियों की त्वचा से ली गई एकल कोशिका निलंबन में पहचान की गई है, और CD11c + DCS (~ 5% ), जबकि कुछ बी कोशिकाओं (CD19 +), एन.के. कोशिकाओं (CD56 + CD3 -), या monocytes / मैक्रोफेज (CD14 + या CD1c +) मनाया गया (चित्रा 1 ए)। कार्यप्रणाली भी मानव त्वचा बायोप्सी में सीडी 4 + CD25 + Foxp3 + कोशिकाओं के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है। फिक्सिंग और permeabilization के बाद अंतर सेलुलर धुंधला का उपयोग करके, यह प्रतिलेखन कारकों की अभिव्यक्ति को प्रदर्शित करने के लिए संभव हैCD25 + टी कोशिकाओं में टो Foxp3 (चित्रा 1 ए)।

मानव त्वचा बायोप्सी से प्राप्त होता एकल कोशिका निलंबन FL1 (FITC), FL2 (पीई), FL3 (ईसीडी), FL9 (प्रशांत नीला) और FL10 (क्रोम नारंगी) एक कोशिकामापी का उपयोग कर चैनलों में एक उच्च autofluorescence पृष्ठभूमि से पता चला है (डेटा नहीं दिखाया गया है) । लिम्फोसाइट आबादी के समुचित विश्लेषण के लिए, इसलिए हम एक विरोधी मानव CD45 एमएबी के उपयोग लिम्फोसाइट आबादी और autofluorescent सेल की आबादी (चित्रा 1 बी) के बहिष्कार के gating के लिए एक शानदार वायलेट 421 fluorochrome साथ संयुग्मित सलाह देते हैं। मानव त्वचा में निवासी कोशिकाओं के बहुमत CD3 + टी कोशिकाओं (चित्रा 1 सी) थे। सेल व्यवहार्यता विश्लेषण के लिए यह मृत / मर कोशिकाओं (चित्रा 1 सी) से व्यवहार्य भेद करने के लिए एक फिक्स व्यवहार्यता डाई का उपयोग करने की सिफारिश की है। आमतौर पर 65.3% में इस प्रोटोकॉल परिणाम ± 7.7 (मतलब ± एसडी) व्यवहार्य कोशिकाओं। डेटा प्रवाह cytometry के आगे के विश्लेषण के लिए, यह सलाहकारों हैव्यवहार्य सेल की आबादी पर फाटक, मृत या मर कोशिकाओं के बाद से करने के लिए एड उनकी कोशिका झिल्ली अखंडता खो देते हैं, और गैर विशेष संयुग्मित एंटीबॉडी बाध्य कर सकते हैं, जिससे पृष्ठभूमि धुंधला बढ़ रही है।

इस प्रोटोकॉल से अलग टी कोशिकाओं में अच्छी तरह से आगे कार्यात्मक विश्लेषण के लिए उपयुक्त हैं। सोरायसिस के मरीजों की lesional त्वचा की एक भी 4 मिमी बायोप्सी का उपयोग करके, यह दिखाया गया था कि बायोप्सी ली गई टी कोशिकाओं निम्नलिखित Brefeldin ए की उपस्थिति में पीएमए / ionomycin के साथ 4 घंटा उत्तेजना (चित्रा 2) आईएल 17A और IFNγ का उत्पादन किया।

शामिल psoriatic त्वचा के घावों से हौसले से तैयार एकल कोशिका त्वचा निलंबन आगे पूर्व vivo सेल संस्कृति और बाद में कार्यात्मक विश्लेषण के लिए भी इस्तेमाल किया जा सकता है। समर्थक भड़काऊ साइटोकिन्स आईएल 1β या आईएल 23 8 दिनों के लिए की मौजूदगी में विरोधी CD3 / विरोधी CD28 एमएबी लेपित microbeads के साथ पॉलीक्लोनल उत्तेजना के बाद विस्तार के बाद, कोशिकाओं जैसे उनकी cytok के लिए विश्लेषण किया जा सकताine क्षमता (चित्रा 3) का निर्माण किया। ऐसा करके, स्वस्थ और psoriatic व्यक्तियों की त्वचा से ली गई कोशिकाओं के साइटोकाइन उत्पादन क्षमता के बीच एक स्पष्ट अंतर मनाया गया। psoriatic व्यक्तियों से टी कोशिकाओं में एक बहुत उच्च सोरायसिस जुड़े साइटोकिन्स IL17A और IFNγ का उत्पादन करने की क्षमता से पता चला है। इसका मतलब है कि पूर्व vivo संस्कृति के बाद भी एक prototypic सोरायसिस साइटोकाइन phenotype बनाए रखा है, स्वस्थ नियंत्रण के मामले में अनुपस्थित।

आकृति 1
चित्रा 1:। ल्यूकोसाइट के विभिन्न प्रकार प्रोटोकॉल पाठ में वर्णित का उपयोग कर अलग त्वचा निवासी लिम्फोसाइट स्वस्थ व्यक्तियों की त्वचा से ली गई एकल कोशिका निलंबन में पहचाने जाते हैं ब्याज से अधिक फिक्स व्यवहार्यता डाई की fluorochrome संयुग्मित MABS के साथ दाग थे और तुरंत द्वारा विश्लेषण फ़्लो साइटॉमेट्री। (ए) फ्लो सीवाई, सीडी 4+, सीडी 8 + और ​​CD25 + Foxp3 + त्वचा निवासी लिम्फोसाइट भीतर सबसेट - monocytes (CD14), DCS (CD11c), बी कोशिकाओं (CD19), एन.के. कोशिकाओं (CD56 + CD3) का पता लगाने tometric। एंटी ह्यूमन CD45 / BV421 एमएबी autofluorescent कोशिकाओं से लिम्फोसाइट अलग करता है। Gating CD45 + कोशिकाओं के लिए इस्तेमाल किया रणनीति (बी) में दिखाया गया है। (सी) व्यवहार्य CD45 + CD3 + टी कोशिकाओं अलगाव के बाद का प्रतिशत। संख्या सकारात्मक कोशिकाओं का प्रतिशत दिखाता है। तीन अलग-अलग प्रयोगों / दाताओं के बाहर एक प्रतिनिधि प्रयोग दिखाया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: टी कोशिकाओं सोरायसिस के मरीजों की lesional त्वचा से ली गई produ कर सकते हैंसीई आईएल 17A और IFNγ। एक एकल 4 मिमी त्वचा बायोप्सी मौखिक रूप से पर सोरायसिस रोगी की lesional त्वचा से ली गई है या वैज्ञानिक प्रयोग के लिए सूचित सहमति लिखा गया था। त्वचा निवासी टी कोशिकाओं प्रोटोकॉल पाठ में वर्णित का उपयोग कर अलग कर दिया गया। त्वचा निवासी टी कोशिकाओं द्वारा आईएल 17A और IFNγ का उत्पादन। Brefeldin ए की उपस्थिति में पीएमए / ionomycin के साथ 4 घंटा उत्तेजना के जवाब में साइटोकिन्स के intracellular संचय प्रवाह cytometry द्वारा मापा गया था। साइटोकाइन पॉजिटिव कोशिकाओं का प्रतिशत दिखाया गया है। तीन अलग-अलग रोगियों के डाटा दिखाया जाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: त्वचा निवासी टी कोशिकाओं आईएल 17A और IFNγ निम्नलिखित पूर्व vivo उत्पादन में सक्षम हैं ए) या ​​आईएल -23 (50 एनजी / एमएल, बी) 8 दिनों के लिए साथ प्रेरित किया गया। इसके बाद, कोशिकाओं Brefeldin ए की उपस्थिति में पीएमए / ionomycin के साथ 4 घंटे के लिए प्रेरित कर रहे थे और उसके बाद प्रवाह cytometry द्वारा intracellular साइटोकाइन उत्पादन के लिए विश्लेषण किया। तीन स्वतंत्र प्रयोगों / दाताओं के बाहर एक प्रतिनिधि उदाहरण दिखाया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

यहाँ, हम एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत कुशलता से मानव त्वचा बायोप्सी से त्वचा निवासी टी कोशिकाओं को अलग-थलग करने के लिए। इस प्रोटोकॉल का लाभ व्यवहार्य लिम्फोसाइटों के अपेक्षाकृत उच्च संख्या के अलगाव है, और प्रासंगिक सतह मार्कर व्यक्त। सेल पहचान सबसेट थे: CD11c + डीसी, सीडी 4 + और ​​सीडी 8 + टी कोशिकाओं और Foxp3 + CD25 + कोशिकाओं। महत्वपूर्ण बात है, पूर्व vivo पृथक त्वचा निवासी टी कोशिकाओं की संस्कृति बहुत अच्छी तरह से संभव है और बाद में कार्यात्मक विश्लेषण के लिए अनुमति दी थी।

मानव त्वचा बाह्य आसंजन प्रोटीन है जो ऊतकों की संरचनात्मक अखंडता को बनाए रखने के लिए कार्य के enzymatic गिरावट के साथ यांत्रिक हदबंदी के संयोजन से एकल कक्ष निलंबन में अलग किया जा सकता है। हालांकि एपिडर्मिस और डर्मिस की Dispase आधारित परत जुदाई एक व्यापक रूप से इस्तेमाल विधि इन संबंधित त्वचा की परतों में सेल घुसपैठ का निर्धारण करने के लिए है, हम Dispase उपचार टी नेतृत्व किया है कि देखाOA CD25 और CD27 की कोशिका की सतह अभिव्यक्ति की प्रमुख कमी () नहीं दिखाया। के रूप में इन मार्करों लिम्फोसाइट सबसेट को चिह्नित करने के लिए महत्वपूर्ण हैं, हमें विश्वास है कि Dispase उपचार प्रभावों बाद immunophenotyping। यह संभावना नहीं है कि डर्मिस को हटाने, CD25 या CD27 व्यक्त कोशिकाओं में मनाया कमी के लिए जिम्मेदार है स्वस्थ व्यक्तियों टी कोशिकाओं के बहुमत के डर्मिस में स्थानीय है की त्वचा में के बाद से, जबकि मिनट टी सेल नंबर एपिडर्मिस 10 में मौजूद हैं -12। पृथक केरेटिनकोशिकाओं के प्रसार क्षमता पर Dispase के हानिकारक प्रभाव पहले से 13 सूचित किया गया है। इसलिए, Dispase के विवेकपूर्ण उपयोग करता है, तो सेल समारोह अध्ययन का उद्देश्य है warranted है। हमारे प्रोटोकॉल में हम मैं त्वचा बायोप्सी के एकल कक्ष निलंबन प्राप्त करने के लिए कोलेजिनेस प्रकार का उपयोग किया गया है। हालांकि कोलेजिनेस मैं कोलेजिनेस चतुर्थ की तुलना में उच्च tryptic गतिविधि है और इस प्रकार अधिक कठोर है, हम इस विशेष कोलेजिनेस को चुना है क्योंकि यह ते कर दिया गया हैसेल संस्कृति के लिए अपनी उपयुक्तता के लिए sted। सेल संस्कृति के लिए उपयुक्त है कि एक कोलेजिनेस चतुर्थ के उपयोग के एक कदम और आगे भविष्य में हमारी मौजूदा प्रोटोकॉल अनुकूलन करने के लिए हो सकता है।

अपनी प्रकृति के कारण, त्वचा अत्यधिक तन्य बलों और मैकेनिकल disaggregation के लिए प्रतिरोधी है। अब तक, मानव त्वचा में प्रतिरक्षा कोशिकाओं के लिए एक व्यापक विश्लेषण जब अपेक्षाकृत कठोर पाचन प्रोटोकॉल का उपयोग करने के लिए पर्याप्त सेल नंबर प्राप्त करने में तकनीकी चुनौतियों के द्वारा बाधा उत्पन्न की गई है। एक परिणाम के रूप में, सबसे तारीख को प्रकाशित अध्ययन immunohistochemical विश्लेषण पर भरोसा करते हैं। त्वचा बायोप्सी से सीडी 4+ टी कोशिकाओं की प्रत्यक्ष अलगाव आम तौर पर बोझिल माना जाता है। एक वैकल्पिक त्वचा explant के उपयोग संस्कृतियों 10 बाहर क्रॉल होगा। हालांकि, इन संस्कृति के 2-3 सप्ताह लेने के लिए, और त्वचा explant संस्कृति के माध्यम से एक सेट साइटोकिन्स और chemokines के चयनित है, जो विशेष टी सेल सबसेट से बाहर तरजीही रेंगने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं शामिल हैं। इसके अलावा संस्कृति अवधि affec सकता हैकोशिकाओं के phenotype टी। वर्तमान प्रोटोकॉल जोड़ा साइटोकिन्स या Chemokines, और सीडी 4 (और भी अन्य सेल मार्कर) की अभिव्यक्ति अच्छी तरह से अलगाव के बाद संरक्षित है, दोनों प्ररूपी और सीधे अलगाव के बाद टी सेल आबादी के कार्यात्मक अध्ययन को सक्षम बनाने के लिए उपयोग नहीं करता।

एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध स्वचालित ऊतक dissociator कोलैजिनेज़ के साथ उनके ऊष्मायन, गिरावट बाह्य मैट्रिक्स के लिए आवश्यक पहले त्वचा के टुकड़े की हदबंदी के लिए प्रयोग किया जाता है। बाह्य मैट्रिक्स से कोशिकाओं के बाद रिहाई के लिए, स्वचालित dissociator फिर से प्रयोग किया जाता है। हालांकि त्वचा की व्यापक मैनुअल काटने समान सेल नंबर उपज कर सकते हैं (डेटा नहीं दिखाया गया है), परिणाम कम संगत कर रहे हैं और कलाकार के अनुभव पर अधिक निर्भर हैं। पूर्व निर्धारित प्रक्रिया के साधन के द्वारा की पेशकश का उपयोग कर त्वचा की हदबंदी बहुत अधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम निकलेगा। कि त्वचा दिखा पिछले अध्ययनों के अनुरूप विभिन्न एल शामिलeukocytes सबसेट 2,14, CD11c + डीसी, सीडी 8 + और ​​सीडी 4+ टी कोशिकाओं, और Foxp3 + कोशिकाओं यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल द्वारा तैयार की एकल कोशिका आबादी में मनाया गया। महत्वपूर्ण बात है, प्रोटोकॉल व्यवहार्य लिम्फोसाइट की एक अपेक्षाकृत उच्च उपज अर्जित करता है। प्रोटोकॉल की दक्षता के कारण, यह विशेष रूप से उपयोगी है जब रोगी सामग्री, जहां अक्सर केवल एक ही 4 मिमी त्वचा बायोप्सी प्राप्त किया जा सकता का अध्ययन। विधि का प्रयोग, हम दिखाने के लिए कि सोरायसिस के मरीजों की lesional त्वचा से अलग टी कोशिकाओं के रूप में स्वस्थ त्वचा 9 की तुलना में आईएल 17A और IFNγ निर्माण करने के लिए एक उच्च क्षमता दिखाया सक्षम थे।

अनुसंधान के सवाल पर निर्भर करता है, यह आगे एकल कक्ष निलंबन की तैयारी के बाद कुछ सेल सबसेट को शुद्ध करने के लिए आवश्यक हो सकता है। इस मामले में, त्वचा के बड़े टुकड़े पर्याप्त कोशिकाओं की उपज सुनिश्चित करने के लिए सबसेट विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। जब ऐसा करने से, यकीन है कि त्वचा के छोटे गड़बड़ी में कटौती की जानी चाहिए बनानाअलगाव प्रोटोकॉल शुरू करने से पहले लगभग 2 मिमी x 2 मिमी eces।

अंत में, वर्तमान प्रोटोकॉल एक एकल कोशिका के स्तर पर सार्थक प्ररूपी और कार्यात्मक विश्लेषण की सुविधा है, जिससे त्वचा प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में हमारी अंतर्दृष्टि में सुधार के लिए एक बेहतर तरीका त्वचा निवासी कोशिकाओं को अलग करने के लिए प्रदान करता है।

खासकर जब एक हदबंदी ट्यूब में एक से अधिक बायोप्सी प्रसंस्करण मौजूदा प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम, वसा ऊतक के उचित हटाने और छोटे टुकड़ों में त्वचा की कटौती कर रहे हैं। वसा ऊतकों और / या बड़े ऊतक टुकड़े dissociator अनुचित तरीके से काम करने के लिए, फिर से रन के लिए पूछ कारण होगा। यह गंभीरता से सेल व्यवहार्यता को नुकसान होगा। तकनीक की सीमा यह है कि एक भी 4 मिमी त्वचा बायोप्सी से प्राप्त होता सेल नंबर कोशिकाओं के सबसेट के बाद अलगाव के लिए पर्याप्त नहीं हैं।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

सोरायसिस रोगियों से त्वचा बायोप्सी कृपया डा एंड्रियास Koerber वैज्ञानिक प्रयोग के लिए मौखिक या लिखित सूचित सहमति के बाद (Essen, जर्मनी के विश्वविद्यालय में त्वचा विज्ञान विभाग) द्वारा प्रदान किया गया।

XH भी NSFC 61263039 और 11101321 NSFC द्वारा समर्थित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Disposable Biopsy Punch Kai Europe BP-40F 4 mm
Disposable sterile scalpels Dalhausen 1100000510
gentleMACS C tube Miltenyi Biotech 130-093-237 Blue-capped, used as the dissociation tube.
gentleMACS Dissociator Miltenyi Biotech 130-093-235 Automated tissue dissociator. Using the "program spleen_01" for dissociation of the skin biopsy.
Cell strainer  BD 352350 70 µm nylon
96-well U-bottom plate Greiner Bio-One 650180
RPMI 1640 Life Technologies 22409-015
Sodium pyruvate Life Technologies 11360-039
GlutaMAX Life Technologies 35050-061
Penicillin/Streptomycin Life Technologies 15140-122
Human Pooled Serum (HPS) in house prepared
Collagenase I Sigma-Aldrich C2674 Type 1-A, suitable for cell culture
DNase I Calbiochem 260913
PBS B Braun 3623140
BSA Sigma-Aldrich A4503-500G
Fixable Viability Dye (FVD) APC-eFluo780 eBioscience 65-0865-18 Stain dead cells prior to cell fixation; dilute with PBS at 1:1,000
Fixation/Permeabilization Concentrate eBioscience 00-5123-43
Fixation/Permeabilization Diluent eBioscience 00-5223-56
Permeabilization Buffer (10x) eBioscience 00-8333-56
BV421 Mouse anti-human CD45 BD 563879 Clone: HI30; dilution factor 1:50
FITC Mouse anti-human CD14 Dako T0844 Clone: TUK4; dilution factor 1:50
PE Mouse anti-human CD56 Dako R7127 Clone: MOC-1; dilution factor 1:50
ECD Mouse anti-human CD3 Beckman - Coulter A07748 Clone: UCHT1; dilution factor 1:50 for surface staining; dilution factor 1:25 for intracellular staining.
PC5.5 Mouse anti-human CD4 Beckman - Coulter B16491 Clone: 13B8.2; dilution factor 1:200
PeCy7 Mouse anti-human CD11c Beckman - Coulter A80249 Clone: BU15; dilution factor 1:50
APC Mouse anti-human CD1c Miltenyi Biotech 130-090-903 Clone: AD5-8E7; dilution factor 1:10
APC-AlexFluo700 Mouse anti-human CD8 Beckman - Coulter A66332 Clone: B9.11; dilution factor 1:400
APC-AlexFluo750 Mouse anti-human CD19 Beckman - Coulter A94681 Clone: J3-119; dilution factor 1:50
PeCy7 Mouse anti-human CD25 eBioscience AD5-8E7 Clone: BC96; dilution factor 1:50
 PE Rat anti-human CLA Miltenyi Biotech 130-091-635 clone: HECA-452; dilution factor 1:
eFluo450 Rat anti-human Foxp3 eBIoscience 48-4776-42 Clone: PCH101; intracellular staining; dilution factor 1:50
AlexFluo488 Mouse anti-human IL-17A eBioscience 53-7179-42 Clone: eBio64DEC17; intracellular staining; dilution factor 1:50
PeCy7 Mouse anti-human IFNg eBioscience 25-7319-41 Clone: 4S.B3; intracellular staining; dilution factor 1:400
Flow-Count Fluorospheres Beckman - Coulter 7547053 Counting beads, for flow cytometry

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Clark, R. A., et al. The vast majority of CLA+ T cells are resident in normal skin. J Immunol. 176, 4431-4439 (2006).
  2. Zaba, L. C., Fuentes-Duculan, J., Steinman, R. M., Krueger, J. G., Lowes, M. A. Normal human dermis contains distinct populations of CD11c+BDCA-1+ dendritic cells and CD163+FXIIIA+ macrophages. J Clin Invest. 117, 2517-2525 (2007).
  3. Gebhardt, T., et al. Memory T cells in nonlymphoid tissue that provide enhanced local immunity during infection with herpes simplex virus. Nature Immunol. 10, 524-530 (2009).
  4. Boyman, O., et al. Spontaneous development of psoriasis in a new animal model shows an essential role for resident T cells and tumor necrosis factor-alpha. J Exp Med. 199, 731-736 (2004).
  5. Christophers, E., Mrowietz, U. The inflammatory infiltrate in psoriasis. Clin Dermatol. 13, 131-135 (1995).
  6. Jiang, X., et al. Skin infection generates non-migratory memory CD8+ T(RM) cells providing global skin immunity. Nature. 483, 227-231 (2012).
  7. Havran, W. L., et al. Limited diversity of T-cell receptor gamma-chain expression of murine Thy-1+ dendritic epidermal cells revealed by V gamma 3-specific monoclonal antibody. Proc Natl Acad Sci U S A. 86, 4185-4189 (1989).
  8. Campbell, J. J., et al. CCR7 expression and memory T cell diversity in humans. J Immunol. 166, 877-884 (2001).
  9. He, X., et al. Targeting PKC in human T cells using sotrastaurin (AEB071) preserves regulatory T cells and prevents IL-17 production. J Invest Dermatol. 134, 975-983 (2014).
  10. Clark, R. A., et al. A novel method for the isolation of skin resident T cells from normal and diseased human skin. J Invest Dermatol. 126, 1059-1070 (2006).
  11. Clark, R. A., Kupper, T. S. IL-15 and dermal fibroblasts induce proliferation of natural regulatory T cells isolated from human skin. Blood. 109, 194-202 (2007).
  12. Keijsers, R. R., et al. In vivo induction of cutaneous inflammation results in the accumulation of extracellular trap-forming neutrophils expressing RORgammat and IL-17. J Invest Dermatol. 134, 1276-1284 (2014).
  13. Hybbinette, S., Bostrom, M., Lindberg, K. Enzymatic dissociation of keratinocytes from human skin biopsies for in vitro cell propagation. Experimental dermatology. 8, 30-38 (1999).
  14. Hennino, A., et al. Skin-infiltrating CD8+ T cells initiate atopic dermatitis lesions. J Immunol. 178, 5571-5577 (2007).

Tags

इम्यूनोलॉजी अंक 110 त्वचा बायोप्सी प्रतिरक्षण लिम्फोसाइटों सीडी 4+ सीडी 8 + सोरायसिस Lesional त्वचा सेल संस्कृति प्रवाह cytometry साइटोकिन्स
प्ररूपी विश्लेषण और के लिए मानव त्वचा से लिम्फोसाइट अलगाव<em&gt; पूर्व विवो</em&gt; सेल संस्कृति
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

He, X., de Oliveira, V. L.,… More

He, X., de Oliveira, V. L., Keijsers, R., Joosten, I., Koenen, H. J. Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture. J. Vis. Exp. (110), e52564, doi:10.3791/52564 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter