El objetivo de este protocolo es construir un equivalente de piel tridimensional de espesor completo, que se asemeje a la piel natural. Con un dispositivo de herida automatizado específicamente construido, se pueden generar heridas precisas y reproducibles bajo el mantenimiento de la esterilidad.
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Artículo de método
Generación de una tridimensional grosor de la piel completa y automatizada Equivalente Heridas
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
Los modelos in vitro son una alternativa rentable y ética para estudiar los procesos de cicatrización de heridas cutáneas. Además, al utilizar células humanas, estos modelos reflejan la situación de las heridas humanas mejor que los modelos animales. Aunque los modelos bidimensionales se utilizan ampliamente para investigar procesos como la migración celular y la proliferación, se requieren modelos más complejos para obtener un conocimiento más profundo sobre la cicatrización de heridas. Además de un sistema de modelo adecuado, la generación de heridas precisas y reproducibles es crucial para garantizar resultados comparables entre diferentes series de pruebas. En este estudio se muestra la generación de una piel tridimensional de espesor completo equivalente al estudio de la cicatrización de heridas. La parte dérmica de los modelos está compuesta por fibroblastos dérmicos humanos incrustados en un hidrogel de colágeno tipo I de cola de rata. Tras la inoculación con queratinocitos epidérmicos humanos y el consiguiente cultivo en la interfaz aire-líquido, se forma una epidermis multicapa sobre los modelos. Para estudiar el proceso de cicatrización de heridas, desarrollamos adicionalmente un dispositivo automatizado de heridas, que genera heridas estandarizadas en una atmósfera estéril.
Introducción
La piel es el órgano más grande del cuerpo. Se crea una barrera entre el entorno exterior y los órganos internos. Por otra parte, la piel protege el cuerpo de la pérdida de líquidos, las influencias ambientales, las lesiones y las infecciones y ayuda a regular la temperatura corporal 1. Debido a su ubicación a la vista, la piel es a menudo afectada por los traumatismos mecánicos, térmicos o químicos. Aunque la piel es generalmente capaz de auto-reparación, múltiples factores locales como la infección, la oxigenación y la suficiencia venosa pueden conducir a problemas de cicatrización de la herida. La cicatrización de heridas también puede ser interferido p....
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Protocolo
NOTA: El protocolo está diseñado para la producción de 24 equivalentes de piel de espesor completo. Fibroblastos dérmicos y queratinocitos epidérmicos humanos fueron aisladas de biopsias de piel de acuerdo con un protocolo previamente publicado. 21,22 consentimiento informado se obtuvo de antemano y el estudio fue aprobado por el comité de ética institucional en la investigación humana de las Julius-Maximilians-Universität Würzburg (voto 182 / 10).
1. Producción de Dérmica Componente
- Disolver colágeno con ácido acético al 0,1% a una concentración final de 6 mg / ml. Para la solución de neutralización gel, mezclar 232....
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Resultados
El HDF y HEK aislado difieren tanto en la morfología y en la expresión de marcadores típicos. El HDF mostró morfología típica de husillo-forma, mientras que la morfología de células HEK puede ser descrita por una morfología de adoquines. Las células se caracterizan por tinción inmunohistoquímica (Figura 1) antes de utilizarlas por FTSE. El HDF son positivas para vimentina (Figura 1A), un marcador de los fibroblastos. HEK primaria expresar la proteína altamente temprana diferenciación de.......
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Discusión
En las células in vitro generalmente se expanden en cultivos celulares bidimensionales, en el que las células se adhieren a las superficies de plástico. Sin embargo, estas condiciones de cultivo no reflejan las condiciones en tres dimensiones fisiológicas en las que las células crecen in vivo. En condiciones tridimensionales, las células pueden formar adjuntos célula-célula y célula-matriz naturales y migrar en tres dimensiones. Especialmente en la herida cutánea sanar el parecido de la
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores agradecen al Fraunhofer ISC por la colaboración en la construcción del dispositivo automatizado de heridas. El proyecto fue fundado por el proyecto interno de Fraunhofer "Märkte von Übermorgen" (SkinHeal).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Tripsina EDTA (1:250) 0,5% en DPBS | PAA | L11-003 | 0,05% |
| Dulbecco' s Solución salina tamponada con fosfato | Sigma | D8537 | |
| Colágeno (6 mg/ml en ácido acético al 0,1%) | Producido internamente | ||
| Fibronectina Proteína humana, plasma (50 y micro; g/ml) | Life Technologies | 33016-015 | |
| Insertos | Nunc | 140627 | |
| placa de 6 pocillos | Nunc | 140685 | |
| placa de 24 pocillos | Nunc | 142485 | |
| Portaobjetos de microscopio | R. Langenbrinck | 03-0070 | |
| Cultivo de fibroblastos (500 ml): | |||
| DMEM, alta glucosa | Life Technologies | 11965-092 | 89% (445 ml) |
| Suero fetal bovino | Bio & Vender | FCS. ADD.0500 | 10% (50 ml) |
| Penicilina-Estreptomicina (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | 1% (5 ml) |
| Medio de cultivo de queratinozyten (500 ml): | |||
| Medio de crecimiento de queratinocitos 2 | Promocell | C-20111 | 89% (445 ml) |
| Medio de Crecimiento de Queratinocitos 2 SuplementoPack | Promocell | C-39011 | |
| Penicilina-Estreptomicina (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | 1% (5 ml) |
| solución de neutralización en gel (250 ml): | |||
| Dulbecco' s Modified Eagle Medium, alto Glucosa en polvo con L-Glutamina | PAA | G0001,3010 | 93% (232.5 ml) |
| Sulfato de condroitina sal de sodio de cartílago de tiburón | Sigma | C4384-1g | 1% (2.5 ml) |
| Suero fetal bovino | Bio & Vender | FCS. ADD.0500 | 3% (7.5 ml) |
| HEPES | Sigma | H3375-1kg | 3% (7.5 ml) |
| Skin model submerges medium (500 ml): | |||
| Medio de crecimiento de queratinocitos 2 | Promocell | C-20111 | |
| Medio de Crecimiento de Queratinocitos 2 Suplemento | Promocell | C-39011 | |
| Suero fetal para terneros | Bio & Vender | FCS. ADD.0500 | 5%-2% (25 ml-10 ml) |
| Penicilina-estreptomicina (10.000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | 1% (5 ml) |
| Skin model air-liquid interface medium (500 ml): | |||
| Keratinocyto Growth Medium 2 | |||
| Growth Medium 2 Supplement Pack | Promocell | C-39011 | añadiendo solo suplementos: insulina, hidrocortisona, epinefrina, transferrina, CaCl2 |
| Penicilina-Estreptomicina (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | 1% (5 ml) |
| CaCl2 (300 mM) | Sigma | C7902-500g | 0.62% (3.1 ml) |
| Histología: | |||
| IHC-Kit DCS SuperVision 2 HRP DCS | PD000KIT | ||
| Anticuerpo Vimentina | Abcam | ab92547 | |
| CK14 anticuerpo | Sigma | HPA023040-100 y micro; l | |
| CK10 anticuerpo | Dako | M7002 | |
| Filaggrin anticuerpo | Abcam | ab81468 | |
| H& E tinción: | |||
| Mayer&agudo; s Haemalaun | AppliChem | A0884,2500 | |
| Xylol | Sigma Aldrich | 296325-4X2L | |
| Etanol | Sigma Aldrich | 32205-4X2.5L | |
| HCl | Sigma Aldrich | H1758-500ML | |
| Eosin | Sigma Aldrich | E4009-5G | |
| 2-Propanolol | Sigma Aldrich | I9516-500ML | |
| Medio de montaje | Sigma Aldrich | M1289-10ML |
Referencias
- Proksch, E., Brandner, J. M., Jensen, J. M. The skin: an indispensable barrier. Exp Dermatol. 17, 1063-1072 (2008).
- Guo, S., Dipietro, L. A. Factors affecting wound healing. J Dent Res. 89, 219-229 (2010).
- Kirsner, R. S., Eaglstein, W. H.
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Reimpresiones y permisos
