Generación de una tridimensional grosor de la piel completa y automatizada Equivalente Heridas

Resumen

El objetivo de este protocolo es construir un equivalente de piel tridimensional de espesor completo, que se asemeje a la piel natural. Con un dispositivo de herida automatizado específicamente construido, se pueden generar heridas precisas y reproducibles bajo el mantenimiento de la esterilidad.

Resumen

Los modelos in vitro son una alternativa rentable y ética para estudiar los procesos de cicatrización de heridas cutáneas. Además, al utilizar células humanas, estos modelos reflejan la situación de las heridas humanas mejor que los modelos animales. Aunque los modelos bidimensionales se utilizan ampliamente para investigar procesos como la migración celular y la proliferación, se requieren modelos más complejos para obtener un conocimiento más profundo sobre la cicatrización de heridas. Además de un sistema de modelo adecuado, la generación de heridas precisas y reproducibles es crucial para garantizar resultados comparables entre diferentes series de pruebas. En este estudio se muestra la generación de una piel tridimensional de espesor completo equivalente al estudio de la cicatrización de heridas. La parte dérmica de los modelos está compuesta por fibroblastos dérmicos humanos incrustados en un hidrogel de colágeno tipo I de cola de rata. Tras la inoculación con queratinocitos epidérmicos humanos y el consiguiente cultivo en la interfaz aire-líquido, se forma una epidermis multicapa sobre los modelos. Para estudiar el proceso de cicatrización de heridas, desarrollamos adicionalmente un dispositivo automatizado de heridas, que genera heridas estandarizadas en una atmósfera estéril.

Introducción

La piel es el órgano más grande del cuerpo. Se crea una barrera entre el entorno exterior y los órganos internos. Por otra parte, la piel protege el cuerpo de la pérdida de líquidos, las influencias ambientales, las lesiones y las infecciones y ayuda a regular la temperatura corporal ^1. Debido a su ubicación a la vista, la piel es a menudo afectada por los traumatismos mecánicos, térmicos o químicos. Aunque la piel es generalmente capaz de auto-reparación, múltiples factores locales como la infección, la oxigenación y la suficiencia venosa pueden conducir a problemas de cicatrización de la herida. La cicatrización de heridas también puede ser interferido por factores sistémicos como la obesidad, alcoholismo, tabaquismo, medicación, nutrición y las enfermedades tales como la diabetes. ²

El proceso de curación de las heridas puede dividirse en 3 fases: (i) la fase inflamatoria, (ii) la proliferación y la (iii) fase de remodelación. Tras la lesión en la piel, un complejo de señal en cascada se inicia, lo que conduce al cierre de la herida. ³Después de la lesión, la herida está sangrando y se forma un coágulo de sangre. Los fibroblastos se mueven en la coagulación de la sangre y lo reemplazan con nuevo tejido que está remodelado posteriormente durante años.

La comprensión actual de la reparación cutánea procesos biológicos subyacentes es limitado. Modelos pequeños animales y de cerdo se han utilizado para estudiar la cicatrización de heridas. Sin embargo, estos resultados no pueden ser transferidos directamente a los seres humanos debido a las diferencias específicas de las especies. Además de estos modelos in vivo, algunos aspectos de la cicatrización de heridas se pueden estudiar mediante la simulación de una situación de la herida a través de rascado de cultivos en monocapa in vitro basado en líneas celulares inmortalizadas o células primarias. ⁴ Estos modelos rascarse están altamente estandarizados, pero no suficientemente reflejan la . compleja fisiología in vivo ⁵ Además de los modelos de dos dimensiones, los equivalentes de piel humana en tres dimensiones se han desarrollado para la investigación dermatológica. La parte dérmica de estos modelos son generated utilizando diversos andamios incluyendo dermis descelularizados, ⁶ hidrogeles de colágeno, glicosaminoglicanos ^{7,8 9} o materiales sintéticos. ¹⁰ Empleando estos equivalentes de piel, el papel de las interacciones epitelio mesenquimal ^11, la re-epitelización, la diafonía celular entre fibroblastos y queratinocitos y la influencia de diferentes factores de crecimiento puede ser estudiado. Además, estos modelos son útiles para obtener nuevos conocimientos sobre cómo los fibroblastos migran a la zona herida y cómo los factores quimiotácticos influyen en la regeneración de tejidos. ¹²

No sólo la generación del modelo de cicatrización de la herida en sí es difícil, sino también para establecer una herida altamente estandarizada en un modelo es problemática. Las técnicas comunes para crear heridas son ensayos de rayado, ¹³ quemaduras, ¹⁴ cintas de abrasión, ¹⁵ lesiones térmicas, ¹⁶ ampollas de succión, nitrógeno líquido ^{17, 18, ​​19} lasers escalpelos, ¹⁸ malladores ⁶ y punzones de biopsia. ²⁰ La mayoría de estos métodos tienen las mismas trampas. Lesiones aplicadas manualmente son difíciles de estandarizar y de reproducirse entre múltiples pruebas. Tamaño, forma y profundidad de la herida varían entre los estudios y por lo tanto perjudican la calidad de los datos de investigación. El uso de láser para heridas de la piel definido puede ser estandarizada con relativa facilidad, pero conduce a una situación imitando heridas de quemaduras. El calor aplicado por láser puede causar desnaturalización de la proteína, la agregación plaquetaria o los vasos constricción, que puede conducir a tejido necrótico.

En un enfoque alternativo, hemos desarrollado un dispositivo heridas automatizado (AWD), que nos permite generar heridas cutáneas definidas y precisas en condiciones estériles. Parámetros herida, como la profundidad y la velocidad de penetración, así como las revoluciones de la cabeza de perforación pueden ser reguladas. En este estudio, hemos combinado el AWD con equivalentes de piel de espesor completo en casa desarrollados (ftSE) que son comparables a un protocolo publicado por Gangatirkar et al. ⁸ La capa dérmica de la piel equivalente se compone de fibroblastos dérmicos humanos (HDF), que están incrustados en un colágeno I hidrogel. En la capa dérmica, los queratinocitos epidérmicos humanos (HEK) se siembran. Dentro de dos semanas en la interfase aire-líquido del HEK construir una epidermis compuesta de varias capas de células vitales y un estrato córneo. Además de la generación de este modelo, este estudio muestra el uso de la tracción total para crear heridas definidos y precisos en FTSE.

Protocolo

NOTA: El protocolo está diseñado para la producción de 24 equivalentes de piel de espesor completo. Fibroblastos dérmicos y queratinocitos epidérmicos humanos fueron aisladas de biopsias de piel de acuerdo con un protocolo previamente publicado. ^21,22 consentimiento informado se obtuvo de antemano y el estudio fue aprobado por el comité de ética institucional en la investigación humana de las Julius-Maximilians-Universität Würzburg (voto 182 / 10).

1. Producción de Dérmica Componente

1. Disolver colágeno con ácido acético al 0,1% a una concentración final de 6 mg / ml. Para la solución de neutralización gel, mezclar 232,5 ml 2x DMEM, 7,5 ml de suero de ternera fetal, 7,5 ml 3 M HEPES, 2,5 ml de sulfato de condroitina (5 mg / ml). Mantenga solución de neutralización de gel y solución de colágeno en el hielo. Calcule 500 l de gel por equivalente de inserción / piel.
   NOTA: A medida que la solución de neutralización gel se mezclará con dos partes de solución de colágeno prepare doble cantidad de colágeno.
2. Coloque 24 inserciones en una placa de 24 pocillos.
3. Resuspender los fibroblastos dérmicos humanos (HDF) en 10 ml de DMEM, centrifugar durante 5 min a 270 xg y contar las células. Extraer la cantidad necesaria de HDF (5 x 10 ⁴ células por 500 gel de colágeno l) y centrifugar las células durante 5 min a 270 x g.
4. Eliminar el sobrenadante y resuspender el cuidado HDF en 4 ml enfriados solución de neutralización gel sin producir burbujas de aire. Desde este paso asegúrese de trabajar tan rápido como sea posible para evitar la solidificación prematura de los geles de colágeno.
5. Resuspender la solución con 8 ml de solución de colágeno.
6. Tome el colágeno de células-mezcla con múltiples pasos-pipeta y llenar rápidamente 500 l de mezcla en cada inserción. Incubar los geles durante 20 min en una incubadora (37 ° C, 5% de CO ₂₎ para cuajar los geles.
7. Sumergir los geles en ml Medio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) + suero de 2 10% de ternera fetal (FCS) por pocilloy se incuba durante 24 horas en una incubadora (37 ° C, 5% de CO _2).

2. La adición de queratinocitos epidérmicos humanos (HEK)

1. Retire medio después de 24 horas. Disolver proteína humana fibronectina con agua ultrapura hasta una concentración final de 50 mg / ml. Cubrir cada equivalente dérmico con 25 l de solución de fibronectina. Incubar los geles durante 30 minutos en una incubadora (37 ° C, 5% de CO _2).
2. Mientras tanto, resuspender el HEK en 10 ml KGM-2 y establecer la concentración de células a 1 x 10 ⁶ células / ml con KGM-2 listo + 5% de FCS. Semilla de 1 x 10 ⁵ células HEK en cada gel. Incubar los geles durante 45 minutos en la incubadora (37 ° C, 5% de CO ₂₎ para permitir que las células se adhieran.
3. Sumergir los geles con KGM-2 listo + 5% de FCS y la cultura en la incubadora (37 ° C, 5% de CO _2).

3. Cultura de equivalentes de piel de grosor completo (FTSE)

1. FTSE Cultura durante 6-7 díasdescendente en FCS-concentración (5%, 2%, y 0% de FCS). Cambie el medio cada 2-3 días con la siguiente concentración más baja de FCS. Para ello, eliminar completamente el medio y añadir 1,6 ml de medio fresco.
2. El día 7, eliminar por completo medio.
   NOTA: No toque la superficie FTSE con la punta de la pipeta mientras lo hace.
3. Coloque todos los inserte en 1 pocillo de una placa de 6 pocillos con pinzas estériles. Añadir 1,5 ml de medio de transporte aéreo por pozo, asegúrese de no mojar la superficie FTSE. Cambie medio cada 2-3 días para otros 14 días.
   NOTA: El nivel de llenado del medio es hasta el menisco de la FTSE.

4. Análisis histológico

1. Fijación y de inclusión en parafina de la FTSE
   1. Retire medio de cultivo, transferir los insertos en placas de 24 pocillos frescos y fijar los tejidos mediante la adición de 1,6 ml de paraformaldehído al 4% a cada pocillo e incubar los tejidos durante 2 horas a RT. ¡Precaución! Paraformaldehyd es tóxico, manipular bajo campana de humos. TransferenciaEl FTSE a un cassette de la incrustación de tejidos. Retirar el resto de fijador por lavado con agua y deshidratar el tejido utilizando concentraciones de etanol ascendente.
   2. Divida el equivalente de piel por un corte vertical en el centro. Coloque las dos piezas en un molde base de metal parafina lleno de superficies de corte hacia abajo. Añadir el casete de tejido en la parte superior del molde como un respaldo.
   3. Cortar 3-5 micras rodajas y flotar en un baño de agua a 40 ° C para straitening, montar toboganes en portaobjetos de microscopio adecuados. Rebanadas seque completamente.
2. Hematoxilina y eosina (H & E) y de inmunohistoquímica (IHC) tinción
   1. Lugar desliza en estante y se incuba durante 1 hora a 60 ° C. Asegúrese de que la parafina se funde. Manchas rebanadas con H & E rehidrata como tinción resumen estandarizado.
   2. Para la tinción de H & E preparar 4x cubetas de tinción de vidrio con xilol, 3x con etanol 96%, 2 veces con etanol al 70%, 1x con etanol al 50%, 4x agua desionizada, hematoxilina 1x, 1x HCl-eTHANOL (13,7 ml de HCl 1 M ad 200 ml de etanol 50%), 1x agua de la lengüeta, 1x eosina (1 g de eosina en 100 ml de agua desionizada) y 2x 2-propanol.
   3. Lugar desliza 10 min en xilol I y 10 min en xilol II Desparafinar y rehidratar diapositivas. Dip desliza 3x en etanol 96% I, 3x en etanol 96% II, 3x en etanol al 70% y 3x en etanol al 50%. Gire las diapositivas de agua desionizada. Para diferenciar colorante hematoxilina, 2x baño en HCl-etanol. Enjuague con agua desionizada. Para azulado, lugar desliza 5 minutos en agua ficha. Para la tinción de eosina, lugar desliza 1 min en eosina y lavar después en agua destilada. Para la deshidratación, los portaobjetos de inmersión 2x ​​en etanol al 70%, 2x en etanol 96% y las colocan durante 5 min en 2-propanol I, durante 5 min en 2-propanol II, 5 min en xilol I y 5 min en xilol II. Después de la tinción H & E, los núcleos celulares se tiñen de azul, el citoplasma y la matriz extracelular se tiñen de rojo.
   4. Para la recuperación de antígenos, retire la parafina con xileno y rehidratar rodajas para la tinción. Coloque las rebanadasen la olla de vapor y cocinar rebanadas desparafinados y rehidratados durante 20 min en pre-calentadas 10 mM tampón de citrato (pH 6).
   5. Coloque los portaobjetos en tampón de lavado (PBS tampón + 0,5%) y polisorbato 20 rebanadas de círculo con un tobogán repelente rotulador líquido o aguja de diamante.
   6. Coloque las diapositivas en una cámara de humedad. Bloquear la peroxidasa endógena, mediante la adición de 100 l de solución de peróxido de hidrógeno al 3% en cada rebanada. ¡Precaución! Muy peligroso en caso de la piel y el contacto visual. Manejar con equipo de protección personal. Lavar los portaobjetos en tampón de lavado.
   7. Aplicar anticuerpo primario y se incuba durante 1 hora a RT. Lavar los portaobjetos tres veces con tampón de lavado. A partir de aquí, las muestras se deben mantener en la oscuridad.
   8. Use sistema de detección de biotina-estreptavidina para la detección de unión a antígeno del anticuerpo específico.
   9. Contratinción núcleos con hematoxilina durante 1 minuto. Deshidratar y montar toboganes.
   10. Muestras de imágenes utilizando un microscopio inverso.

5. Lesiones por el uso del dispositivo automatizado Heridas (AWD)

1. Prepare el AWD desinfectando la zona de trabajo con etanol al 70% y la luz ultravioleta. Asegúrese de que el cabezal de perforación del tamaño deseado (por ejemplo, 1 mm) se adjunta.
2. Coloque equivalentes de piel en áreas designadas de la placa de soporte de muestras en autoclave usando pinzas estériles. Coloque la placa de soporte de muestras en la toma de debajo de la cabeza de perforación.
3. Utilice el software de control para establecer los parámetros hiriendo la siguiente manera: la velocidad de giro: 15000 rpm; penetración: 1,5 mm; propulsión: 100 Hz. Estos parámetros se deben definir para cada tipo de muestra individual. Transferencia hiriendo parámetros a la tracción total.
4. Iniciar procedimiento hiriendo. Retire la placa de soporte de muestras de la toma. Transferencia herido FTSE nuevo en insertos utilizados para el cultivo utilizando pinzas estériles.
5. Proceda con la cultura de FTSE heridos en la incubadora (37 ° C, 5% CO ₂₎ para la investigación de la regeneración. Alternatively, utilizar los modelos para el análisis histológico en cualquier momento.

Resultados

El HDF y HEK aislado difieren tanto en la morfología y en la expresión de marcadores típicos. El HDF mostró morfología típica de husillo-forma, mientras que la morfología de células HEK puede ser descrita por una morfología de adoquines. Las células se caracterizan por tinción inmunohistoquímica (Figura 1) antes de utilizarlas por FTSE. El HDF son positivas para vimentina (Figura 1A), un marcador de los fibroblastos. HEK primaria expresar la proteína altamente temprana diferenciación de...

Discusión

En las células in vitro generalmente se expanden en cultivos celulares bidimensionales, en el que las células se adhieren a las superficies de plástico. Sin embargo, estas condiciones de cultivo no reflejan las condiciones en tres dimensiones fisiológicas en las que las células crecen in vivo. En condiciones tridimensionales, las células pueden formar adjuntos célula-célula y célula-matriz naturales y migrar en tres dimensiones. Especialmente en la herida cutánea sanar el parecido de la

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tripsina EDTA (1:250) 0,5% en DPBS	PAA	L11-003	0,05%
Dulbecco' s Solución salina tamponada con fosfato	Sigma	D8537
Colágeno (6 mg/ml en ácido acético al 0,1%)	Producido internamente
Fibronectina Proteína humana, plasma (50  y micro; g/ml)	Life Technologies	33016-015
Insertos	Nunc	140627
placa de 6 pocillos	Nunc	140685
placa de 24 pocillos	Nunc	142485
Portaobjetos de microscopio	R. Langenbrinck	03-0070
Cultivo de fibroblastos (500 ml):
DMEM, alta glucosa	Life Technologies	11965-092	89% (445 ml)
Suero fetal bovino	Bio & Vender	FCS. ADD.0500	10% (50 ml)
Penicilina-Estreptomicina (10,000 U/ml)	Life Technologies	15140-122	1% (5 ml)
Medio de cultivo de queratinozyten (500 ml):
Medio de crecimiento de queratinocitos 2	Promocell	C-20111	89% (445 ml)
Medio de Crecimiento de Queratinocitos 2 SuplementoPack	Promocell	C-39011
Penicilina-Estreptomicina (10,000 U/ml)	Life Technologies	15140-122	1% (5 ml)
solución de neutralización en gel (250 ml):
Dulbecco' s Modified Eagle Medium, alto Glucosa en polvo con L-Glutamina	PAA	G0001,3010	93% (232.5 ml)
Sulfato de condroitina sal de sodio de cartílago de tiburón	Sigma	C4384-1g	1% (2.5 ml)
Suero fetal bovino	Bio & Vender	FCS. ADD.0500	3% (7.5 ml)
HEPES	Sigma	H3375-1kg	3% (7.5 ml)
Skin model submerges medium (500  ml):
Medio de crecimiento de queratinocitos 2	Promocell	C-20111
Medio de Crecimiento de Queratinocitos 2 Suplemento	Promocell	C-39011
Suero fetal para terneros	Bio & Vender	FCS. ADD.0500	5%-2% (25 ml-10 ml)
Penicilina-estreptomicina (10.000 U/ml)	Life Technologies	15140-122	1% (5 ml)
Skin model air-liquid interface medium (500 ml):
Keratinocyto Growth Medium 2
Growth Medium 2 Supplement Pack	Promocell	C-39011	añadiendo solo suplementos: insulina, hidrocortisona, epinefrina, transferrina, CaCl2
Penicilina-Estreptomicina (10,000 U/ml)	Life Technologies	15140-122	1% (5 ml)
CaCl2 (300 mM)	Sigma	C7902-500g	0.62% (3.1 ml)
Histología:
IHC-Kit DCS SuperVision 2 HRP DCS		PD000KIT
Anticuerpo Vimentina	Abcam	ab92547
CK14 anticuerpo	Sigma	HPA023040-100 y micro; l
CK10 anticuerpo	Dako	M7002
Filaggrin anticuerpo	Abcam	ab81468
H& E tinción:
Mayer&agudo; s Haemalaun	AppliChem	A0884,2500
Xylol	Sigma Aldrich	296325-4X2L
Etanol	Sigma Aldrich	32205-4X2.5L
HCl	Sigma Aldrich	H1758-500ML
Eosin	Sigma Aldrich	E4009-5G
2-Propanolol	Sigma Aldrich	I9516-500ML
Medio de montaje	Sigma Aldrich	M1289-10ML