Tumor primario y aislamiento de células MEF para el Estudio de pulmón metástasis

Resumen

El objetivo de este protocolo es estudiar la tumorigénesis de mama. Con esta técnica, se extirpan los tumores mamarios de ratón y se preparan las células primarias a partir de los tumores. Se incluye un protocolo de extracción pulmonar para el estudio de las metástasis pulmonares. Además, se incluye otro protocolo para analizar fibroblastos embrionarios de ratón a partir del embrión de ratón.

Resumen

En la tumorigénesis de mama, la etapa metastásica de la enfermedad representa la mayor amenaza para el individuo afectado. Las células mamarias normales con genotipos alterados ahora poseen la capacidad de invadir y sobrevivir en otros tejidos. En este protocolo, se extirpan los tumores mamarios de ratón y se preparan las células primarias a partir de los tumores. Las células aisladas de este procedimiento están disponibles para experimentos de perfiles genéticos. Para que la metástasis tenga éxito, estas células deben ser capaces de intravasarse, sobrevivir en circulación, extravasarse a órganos distantes y sobrevivir en ese nuevo sistema de órganos. Los pulmones son el objetivo típico de la metástasis del cáncer de mama. Se ha descubierto un conjunto de genes que median la selectividad de la metástasis en el pulmón. Aquí describimos un método para estudiar la metástasis pulmonar a partir de un modelo de ratón modificado genéticamente. Además, se incluye otro protocolo para analizar fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs) a partir del embrión de ratón. Las células MEF del mismo tipo animal proporcionan una pista sobre la expresión génica de células no cancerosas. Juntas, estas técnicas son útiles en el estudio de la tumorigénesis mamaria de ratón, sus mecanismos de señalización asociados y las vías de las anomalías en los embriones.

Introducción

La metástasis es el paso final en la progresión del cáncer de mama ¹. Implica una serie de etapas en las que las células malignas se liberan del tumor primario y se diseminan a otros órganos ². Las células deben ser capaces de intravasarse, sobrevivir en circulación, extravasarse a órganos distantes y sobrevivir en ese ^{nuevo sistema de} órganos. Cada paso en la tumorigénesis es estrictamente controlado por las células a través de diversos cambios genéticos y epigenéticos ⁴. Para estudiar los mecanismos de la tumorigénesis del cáncer de mama, se han utilizado sistemas de modelos de ratón debido a su corta vida útil, pequeño ta....

Protocolo

Todos los experimentos con ratones se realizaron de acuerdo con los protocolos aprobados por el Cuidado de Animales institucional y Comités Use (IACUC) de la Escuela de Medicina LSU. Todos los instrumentos deben esterilizarse en autoclave antes de la disección.

1. Preparación de células primarias de tumores mamarios de ratón

1. Use un modelo de ratón que fue manipulado genéticamente con el Ratón Tumor Mamario poliomavirus Medio T-antígeno (ratón MMTV-PYMT transgénicos), que espontáneamente desarrollan tumores a lo descrito previamente ^6.
2. Sacrificar los ratones con isoflurano (99,9%) y el spray etanol al 75% para asegurar un ambien....

Resultados

La etapa de progresión del tumor en la que sacrificar el animal depende del estudio en particular y las directrices IACUC. En la Figura 1A, un viejo ratón C57BL / 6 100 días con el Ratón Tumor Mamario poliomavirus Medio T-antígeno (MMTV-PYMT) fue sacrificado a los tres meses. La piel se abre desde el área del orificio uretral al cuello con las tijeras y la piel se fijó hacia abajo para permitir el fácil acceso a los órganos como se muestra en la Figura 1B. Esto permitió un fácil acceso .......

Discusión

Este protocolo es para el aislamiento de células primarias a partir de un tumor de ratón fresco. Los lisados ​​preparados a partir de este método son útiles para la proteína, el ADN y análisis de ARN. Las células cancerosas del tumor primario de mama a menudo metástasis en el cerebro, pulmón y hueso ^1. Incluido es una técnica para extraer el pulmón para la detección de metástasis. La tinción del pulmón con una mancha de tinta permitirá la visualización de nódulos tumorales como se ve en la Figura 2B.<.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
DMEM	HyClone	SH30243.01	Tienda a 4 ° C
0.05% Tripsina-EDTA	Tecnologías de vida	25300-062	Tienda en – 20 ° C
Colagenasa Tipo IV	Sigma-Aldrich	C5138	Tienda en – 20 ° C
Hialuronidasa	Sigma-Aldrich	H3506	Tienda en – 20 ° C
Pen Strep	Life  tecnologías	15140-122	Tienda en 4 ° C
Suero fetal bovino (FBS)	Gemini Bio-Products	100-106	Tienda en – 80 ° C
Z-fix	ANATECH	#174	Tienda en RT
India Ink	Yasutomo		Tienda en RT
AERRANE (Isoflurano)	Baxter	NDC 10019-773-60	Tienda en RT
Etanol	EMD	AX0441-3	Tienda en RT