El objetivo de este protocolo es estudiar la tumorigénesis de mama. Con esta técnica, se extirpan los tumores mamarios de ratón y se preparan las células primarias a partir de los tumores. Se incluye un protocolo de extracción pulmonar para el estudio de las metástasis pulmonares. Además, se incluye otro protocolo para analizar fibroblastos embrionarios de ratón a partir del embrión de ratón.
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Artículo de método
Tumor primario y aislamiento de células MEF para el Estudio de pulmón metástasis
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Resumen
Resumen
En la tumorigénesis de mama, la etapa metastásica de la enfermedad representa la mayor amenaza para el individuo afectado. Las células mamarias normales con genotipos alterados ahora poseen la capacidad de invadir y sobrevivir en otros tejidos. En este protocolo, se extirpan los tumores mamarios de ratón y se preparan las células primarias a partir de los tumores. Las células aisladas de este procedimiento están disponibles para experimentos de perfiles genéticos. Para que la metástasis tenga éxito, estas células deben ser capaces de intravasarse, sobrevivir en circulación, extravasarse a órganos distantes y sobrevivir en ese nuevo sistema de órganos. Los pulmones son el objetivo típico de la metástasis del cáncer de mama. Se ha descubierto un conjunto de genes que median la selectividad de la metástasis en el pulmón. Aquí describimos un método para estudiar la metástasis pulmonar a partir de un modelo de ratón modificado genéticamente. Además, se incluye otro protocolo para analizar fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs) a partir del embrión de ratón. Las células MEF del mismo tipo animal proporcionan una pista sobre la expresión génica de células no cancerosas. Juntas, estas técnicas son útiles en el estudio de la tumorigénesis mamaria de ratón, sus mecanismos de señalización asociados y las vías de las anomalías en los embriones.
Introducción
La metástasis es el paso final en la progresión del cáncer de mama 1. Implica una serie de etapas en las que las células malignas se liberan del tumor primario y se diseminan a otros órganos 2. Las células deben ser capaces de intravasarse, sobrevivir en circulación, extravasarse a órganos distantes y sobrevivir en ese nuevo sistema de órganos. Cada paso en la tumorigénesis es estrictamente controlado por las células a través de diversos cambios genéticos y epigenéticos 4. Para estudiar los mecanismos de la tumorigénesis del cáncer de mama, se han utilizado sistemas de modelos de ratón debido a su corta vida útil, pequeño tamaño y rápido tiempo de reproducción. Algunas de las principales ventajas del uso de modelos de ratón en la investigación del cáncer son las similitudes moleculares y fisiológicas que comparten con los humanos 5.
Las líneas celulares establecidas de ratón y humanos se han utilizado ampliamente en la investigación del cáncer de mama. Aunque podemos obtener cierta información sobre los pasos de la metástasis utilizando estas células, los modelos animales manipulados genéticamente con supresores tumorales/oncogenes proporcionarán mucha más información sobre el desarrollo tumoral y la metástasis desde la etapa embrionaria. Así, con estos modelos de ratón, podemos obtener una regulación genética y del desarrollo del crecimiento tumoral. Además, el microambiente tumoral también desempeña un papel importante en la expresión génica de las células tumorales y puede ser difícil imitar el mismo escenario con estudios que utilizan líneas celulares establecidas. Los tumores mamarios humanos primarios también se pueden utilizar para estudiar la tumorigénesis mamaria de ratones. La principal desventaja de utilizar tumores de mama aislados es que este tumor recién implantado no tiene la vasculatura ni el tejido linfático del ratón. Mientras que los sistemas de modelos genéticos de ratón para el estudio de la tumorigénesis mamaria nos permitirán monitorizar los pasos de la metástasis, analizar el microambiente tumoral y acceder a todo el cuerpo 5.
El objetivo general de este protocolo es estudiar la tumorigénesis de mama en ratones. Se sabe que los cánceres de mama suelen hacer metástasis en el cerebro, los pulmones y los huesos. Este protocolo permite el aislamiento de células tumorales mamarias primarias, así como el estudio de la metástasis del cáncer de mama en el pulmón. Además, se incluye otro protocolo para analizar fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs) a partir del embrión de ratón. Juntas, estas técnicas son útiles en el estudio de la tumorigénesis mamaria de ratón.
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Protocolo
Todos los experimentos con ratones se realizaron de acuerdo con los protocolos aprobados por el Cuidado de Animales institucional y Comités Use (IACUC) de la Escuela de Medicina LSU. Todos los instrumentos deben esterilizarse en autoclave antes de la disección.
1. Preparación de células primarias de tumores mamarios de ratón
- Use un modelo de ratón que fue manipulado genéticamente con el Ratón Tumor Mamario poliomavirus Medio T-antígeno (ratón MMTV-PYMT transgénicos), que espontáneamente desarrollan tumores a lo descrito previamente 6.
- Sacrificar los ratones con isoflurano (99,9%) y el spray etanol al 75% para asegurar un ambiente estéril (Figura 1A).
- Abra la piel de la zona del orificio uretral al cuello con unas tijeras. Pin de la piel hacia abajo para permitir el fácil acceso a los órganos (Figura 1B).
- Aislar el tumor de mama mamaria y lavar con fosfato estéril frío solución salina tamponada (PBS) (pH 7,4) (Figura 1C).
- Transferir el tumoruna placa de cultivo tisular de 10 cm estéril y cortar con una cuchilla de afeitar estéril y tijeras para aproximadamente 1 mm 3 piezas. Los pasos siguientes deben realizarse en una campana de flujo laminar estéril.
- Incubar el tejido tumoral picado con colagenasa disuelto en medio DMEM libre de suero a una concentración final de 1 mg / ml en un agitador durante 2 horas a 37 ° C. Centrifugar la suspensión de tejido tumoral durante 3 min a 200 x g.
NOTA: La incubación colagenasa es esencial para la disociación enzimática del tejido. - Descartar el sobrenadante y lavar el precipitado 3 veces con PBS (pH 7,4) por centrifugación durante 3 minutos a 200 x g. Después del lavado final, se decanta el sobrenadante.
- Resuspender el tejido con 2 ml de EDTA tripsina durante 5 min a 37 ° C mientras nutación. Centrifugar la suspensión durante 3 min a 200 xg y repetir los lavados.
- Resuspender el sedimento de tejido en medio de crecimiento normal (DMEM, 10% FBS, 2X pen / strep) en una placa de 10 cm. Cambiolos medios de comunicación todos los días durante los próximos 3 días. Se obtienen células de cultivo hasta el número de células deseado.
NOTA: Aproximadamente 1x10 7 células se aisló de este procedimiento. Otros modelos de la tumorigénesis mamaria de ratón, como MMTV-Neu, dan menor rendimiento de las células en comparación con MMTV-PYMT. Al utilizar los modelos que producen un menor rendimiento, es beneficioso para comenzar con un tumor y cultura más grandes células más largas.
2. Extracción de pulmón de ratón para visualizar pulmón metástasis
- Antes de la extracción de pulmón, eliminar el hígado y el diafragma. Desalojar las costillas sin molestar a los pulmones.
- Con un buen par de tijeras, abrir la parte superior de la tráquea, que está más cerca de la vena yugular.
- El uso de un catéter, se inyecta un agente tal como 1 ml de Z-fix o India tinta a través de la tráquea para llenar los pulmones (Figura 2a). Incrustar el Z-fix Pulmones en parafina.
- De-mancha los pulmones inyectados con tinta china en la solución de Fekete(100 ml 70% de alcohol, 10 ml de formalina al 10% tamponada, y 5 ml de ácido acético glacial) durante 5 min. Definir nódulos tumorales en los sitios secundaria con un ≥ 0,5 mm de diámetro, determinar los nódulos como metástasis.
NOTA: Debido a la obstrucción bronquios y bronquiolos por el tumor, nódulos tumorales no pueden absorber 15% tinta china, y por lo tanto el tejido pulmonar normal serán en negro, y nódulos tumorales serán de color blanco 7. Esto permitirá la visualización de nódulos tumorales individuales (Figura 2B).
3. Preparación de fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs) de embriones de ratón
- Sacrificar los ratones embarazadas con isoflurano (99,9%) y el spray etanol al 75% para asegurar un ambiente estéril.
- Abra la piel de la zona del orificio uretral al cuello con unas tijeras y aislar los embriones desde el útero.
- Tenga cuidado de no molestar a los embriones al abrir la piel.
- Retire los cuernos uterinos y enjuague en ste fríairritar a PBS (pH 7,4).
- Separar el embrión de su placenta muy cuidadosamente y colocar los embriones en una placa de 10 cm que contiene hielo frío PBS (pH 7,4).
- Retire la cabeza, el hígado y el intestino del embrión y colocar la porción restante en una placa de cultivo de tejido de 12 pocillos que contenía PBS (pH 7,4).
- Transferir el cuerpo embrión a otra placa de 12 pocillos que contenía EDTA tripsina y cortado en trozos pequeños (~ 1 mm 3) utilizando una cuchilla de afeitar estéril y tijeras. Incubar el material picado con 5 ml de EDTA tripsina durante 5 min a 37 ° C.
- Inactivar la tripsina mediante la adición de 1 ml de suero bovino fetal (FBS) a los embriones picadas. Centrifugar la suspensión a 200 la velocidad xg durante 10 minutos, retire con cuidado el sobrenadante, resuspender el precipitado con 1 ml de medio DMEM cálido y transferir todo el contenido de un plato de 10 cm que contiene 10 ml de DMEM (con 20% de SFB y 2X penicilina / estreptomicina ).
- Cambie el medio todos los días durante dos días. Cultivar las células hasta celda deseadase alcanza número.
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Resultados
La etapa de progresión del tumor en la que sacrificar el animal depende del estudio en particular y las directrices IACUC. En la Figura 1A, un viejo ratón C57BL / 6 100 días con el Ratón Tumor Mamario poliomavirus Medio T-antígeno (MMTV-PYMT) fue sacrificado a los tres meses. La piel se abre desde el área del orificio uretral al cuello con las tijeras y la piel se fijó hacia abajo para permitir el fácil acceso a los órganos como se muestra en la Figura 1B. Esto permitió un fácil acceso ...
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Discusión
Este protocolo es para el aislamiento de células primarias a partir de un tumor de ratón fresco. Los lisados preparados a partir de este método son útiles para la proteína, el ADN y análisis de ARN. Las células cancerosas del tumor primario de mama a menudo metástasis en el cerebro, pulmón y hueso 1. Incluido es una técnica para extraer el pulmón para la detección de metástasis. La tinción del pulmón con una mancha de tinta permitirá la visualización de nódulos tumorales como se ve en la Figura 2B.<...
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Divulgaciones
Los autores no tienen revelaciones.
Agradecimientos
Nos gustaría agradecer a NIH, LACaTS y la fundación de la clínica Ochsner por el apoyo financiero.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| DMEM | HyClone | SH30243.01 | Tienda a 4 ° C |
| 0.05% Tripsina-EDTA | Tecnologías de vida | 25300-062 | Tienda en – 20 ° C |
| Colagenasa Tipo IV | Sigma-Aldrich | C5138 | Tienda en – 20 ° C |
| Hialuronidasa | Sigma-Aldrich | H3506 | Tienda en – 20 ° C |
| Pen Strep | Life tecnologías | 15140-122 | Tienda en 4 ° C |
| Suero fetal bovino (FBS) | Gemini Bio-Products | 100-106 | Tienda en – 80 ° C |
| Z-fix | ANATECH | #174 | Tienda en RT |
| India Ink | Yasutomo | Tienda en RT | |
| AERRANE (Isoflurano) | Baxter | NDC 10019-773-60 | Tienda en RT |
| Etanol | EMD | AX0441-3 | Tienda en RT |
Referencias
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- Poste, G., Fidler, I. J. The pathogenesis of cancer metastasis. Natur. 283 (5743), 139-146 (1980).
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