Artículo de método

Trabecular Respuesta malla de elevación de la presión en el Living Ojo humano

DOI:

10.3791/52611

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20 de junio de 2015

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1Department of Ophthalmology, UPMC Eye Center, Eye and Ear Institute, Ophthalmology and Visual Science Research Center, University of Pittsburgh School of Medicine, 2Department of Bioengineering, Swanson School of Engineering, University of Pittsburgh, 3The McGowan Institute for Regenerative Medicine, University of Pittsburgh School of Medicine, 4Deptartment of Biostatistics, Graduate School of Public Health, University of Pittsburgh

En este artículo

Resumen

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Malla trabecular (TM) la migración al espacio del canal de Schlemm se puede inducir por elevación de la presión aguda por ophthalmodynamometer, y observado por dominio espectral tomografía de coherencia óptica. El objetivo de este método es cuantificar la respuesta morfométrico del tracto de salida vivir a elevación de la presión aguda en los tejidos vivos in situ.

Resumen

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Las características mecánicas de la malla trabecular (TM) están vinculados a la resistencia de salida y la presión intraocular (PIO) la regulación. El fundamento de esta técnica es la observación directa de la respuesta mecánica de la TM a la elevación de la PIO aguda. Antes de la exploración, la PIO se midió al inicio y durante la elevación de la PIO. El limbo es escaneado por el dominio espectral tomografía de coherencia óptica al inicio y durante la elevación de la PIO (ophthalmodynamometer (ODM) que se aplica a 30 g fuerza). Escanea se procesan para mejorar la visualización de la salida del humor acuoso vía utilizando ImageJ. Vasculares puntos de referencia se utilizan para identificar ubicaciones correspondientes en la línea de base y los volúmenes de escaneo de elevación de la PIO. Schlemm del canal (SC) área transversal (SC-CSA) y la longitud de SC de anterior a posterior a lo largo de su eje largo se miden manualmente en 10 lugares dentro de un segmento de 1 mm de SC. Significa interior a distancia de la pared exterior (longitud del eje corto) se calcula como el área de SC dividido por sulongitud del eje largo. Para examinar la contribución de los tejidos adyacentes a los efectos de las elevaciones de la PIO, las mediciones se repiten sin y con la relajación del músculo liso con la instilación de tropicamida. Migración TM en SC es resistido por la rigidez TM, pero se ve reforzada por el apoyo de su fijación al músculo liso adyacente dentro del cuerpo ciliar. Esta técnica es la primera para medir la respuesta vivir TM humano a la elevación de la presión in situ en condiciones fisiológicas dentro del ojo humano.

Introducción

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El glaucoma es la segunda causa mundial de ceguera irreversible 1. La presión intraocular elevada (PIO) es un importante factor de riesgo causal para la presencia y la progresión de glaucoma 2-7.   PIO está regulado por el equilibrio entre la formación y el drenaje del humor acuoso 8. Los lugares de mayor resistencia de salida son el tejido juxtacanicular y la pared interior del canal de Schlemm (SC), la interfaz entre el SC y la malla trabecular (TM) 9-11. Mientras que la rigidez TM puede contribuir a la prevención de colapso SC en la cara de elevación de la PIO, Overby et al. 12 demostraron recientemente que la expresión génica en el glaucoma se altera, lo que resulta en una mayor rigidez SC endotelial, lo que impide la formación de poros, lo que conduce a la elevación de la PIO en ojos glaucomatosos 13. Morfología TM y la rigidez se correlacionan con la posibilidad de salida 14,15, haciendo hincapié en tque necesita para medir sus características biomecánicas.

Mediciones de microscopía de fuerza atómica de la TM muestran rigidez elevada en los ojos donados por los pacientes con glaucoma (81 kPa) en comparación con los ojos de donantes sin glaucoma (4,0 kPa) 16, pero estas mediciones se hicieron en vivo tejidos disecados ex. El TM posterior está anclada en el músculo ciliar a través de tendones anteriores de las células musculares longitudinales que se insertan en el laminosa y cribiforme TM exterior 17. Actividad muscular (CM) ciliar puede aumentar tirantez TM, imitando elevada rigidez TM 17. La capacidad de observar alteraciones en la resistencia a SC colapso inducido por perturbaciones de músculo liso se ha demostrado en un modelo animal 18. Hemos demostrado la capacidad de imagen no invasiva del sistema de salida del humor acuoso primaria en que viven los ojos humanos distal e incluyendo SC usando espectral tomografía de coherencia óptica de dominio (OCT) 19-21. Usando esta técnica, hemos demostrado la capacidad de cuantificar la respuesta morfométricos de la TM y SC a la elevación de la presión intraocular aguda 22.

El objetivo general del método descrito en el presente documento fue cuantificar la respuesta morfométricos del tracto de salida vivir a la elevación de la presión intraocular aguda en los tejidos vivos in situ. Esta técnica tiene la ventaja de examinar el TM en condiciones fisiológicas, que incluye las contribuciones tanto de la actividad contráctil de la fibra dentro de la TM y CM a la rigidez TM, en comparación con las mediciones realizadas publicados en los tejidos disecados. El fundamento de la aplicación de esta técnica para la observación de la respuesta TM mecánica es que nos proporciona conocimientos de otro modo no disponibles en el comportamiento mecánico de la TM, que ahora sabemos que estar vinculados directamente a la resistencia de salida y la regulación de la PIO 13. Para discernir la contribución de los tejidos contráctiles a la rigidez general, una pequeña cohort de los sujetos fue examinada con y sin supresión de la actividad del músculo liso mediante la administración de tropicamida.

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Protocolo

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Ética Declaración: Se obtuvo la aprobación de la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Pittsburgh School of Medicine antes de que comenzara el reclutamiento de sujetos. Todos los temas siempre consentimiento informado por escrito antes de la participación en el estudio.

1. Adquisición de Datos

  1. Elevación de la presión
    1. Tome medidas de referencia (PIO y octubre mediciones) por inculcar una gota de 0,5% proparacaína en el ojo. Espere 3 minutos para la eficacia.
    2. Aplique suavemente presión a la esclerótica temporal con el ophthalmodynamometer, 30 g en la cohorte 1 y 5 y luego 10 g en la cohorte 2. Luego tome las medidas (PIO y octubre) deseados de la siguiente manera
      1. Las mediciones de la PIO
        1. Medir la PIO basal. Elevar la presión como se describe en la sección 1.1.
        2. En cohorte 1 inculcar una gota de proparacaína al 0,5%, 3 min para permitir la eficacia, y aplicar 30 g de la presión a la esclerótica. Mientras se está aplicando la presión, medir la PIO con el tonómetro siguiente Manufalas instrucciones del cturer.
        3. En la cohorte 2, inculcar una gota de 0,5% proparacaína, permitir 3 min para la eficacia, y aplicar 5 g de presión escleral utilizando un ophthalmodynamometer. Mida la PIO durante la elevación de la presión usando las instrucciones del tonómetro siguiente del fabricante.
          1. Espere 5 minutos después de la medición de 5 g.
          2. Aplicar 10 g de presión escleral por ophthalmodynamometer, y medir la PIO durante la elevación de la presión mediante el tonómetro siguiendo las instrucciones del fabricante. Registre la PIO y la condición (es decir, la línea de base o 10 g) en el registro de estudios.
      2. Octubre de barrido
        1. Asiente el tema en el escáner de octubre. Introduzca los datos demográficos de los pacientes para los nuevos temas, o recuperar los datos demográficos de la base de datos de octubre de sujetos previamente escaneados.
        2. Seleccione el segmento anterior protocolo de 512 x 128 de exploración. Centrar la atención en la ventana de imagen de vídeo. Disminuir la distancia entre el escánery el ojo hasta que aparezca la imagen de la córnea de la sección transversal en la ventana de exploración
        3. Uso de los comandos verbales posicionar el limbo temporal del centro de la ventana de análisis por la dirección de la mirada del paciente en la dirección nasal
        4. Adquirir la exploración de línea de base, y revisar el análisis de la calidad. Si es aceptable, ahorre, y si no es aceptable, repita este paso.
          1. Acepte las exploraciones si no hay parpadeos, y el ángulo se visualiza en todo el volumen sin la deriva fuera del borde de la imagen o mover de un tirón en la parte superior.
        5. Inculcar una gota de 0,5% proparacaína, permitir 3 min para la eficacia, y repita los pasos 1.3.2 a través de 1.3.5.
        6. Para la cohorte 1, aplicar 30 g de presión escleral por ophthalmodynamometer, y adquirir la exploración mientras se aplica presión. Quite la presión y revisar la exploración de la calidad. Si es aceptable, ahorre, y si no es aceptable, repita este paso.
        7. Para la cohorte 2, aplicar 5 g de presión escleral por ophthalmodynamometer, y adquirir la exploración mientras se aplica presión. Quite la presión y revisar la exploración de la calidad. Si es aceptable, ahorre, y si no es aceptable, repita este paso.
        8. Espere 5 min lo que permite que el ojo se recupere de la 5 g de perturbación de presión.
        9. Para la cohorte 2, aplicar 10 g de presión escleral por ophthalmodynamometer, y adquirir la exploración mientras se aplica presión. Quite la presión y revisar la exploración de la calidad. Si es aceptable, ahorre, y si no es aceptable, repita este paso.
        10. Registre el tiempo de exploración, la condición (es decir, la línea de base o 10 g) y la ubicación en el registro de estudios.

2. Procesamiento de Datos

  1. Conecte un dispositivo de almacenamiento USB de alta capacidad en la OCT. Seleccione "Exportar" en el menú Registros en la OCT. Designe una ubicación de archivo para los archivos exportados en la unidad USB. De-seleccionar la opción ".zip". Introduzca el nombre del paciente para scans destinados a la exportación, y seleccione las imágenes para ser exportados. Iniciar la exportación.
  2. Cuando finaliza la exportación, desmontar la unidad USB y retirar de la OCT. Conecte la unidad USB de alta capacidad que contiene las imágenes exportadas en la estación de trabajo de procesamiento de imágenes.
  3. Inicie el programa de procesamiento de imágenes, en este caso ImageJ.
  4. Importar los datos de imagen en bruto; seleccione "Archivo -> Importar -> Raw" en el menú archivo. Seleccione el archivo con el que termina en "_cube_raw.img" para ser procesada desde la unidad USB.
  5. Guarde el archivo importado utilizando un nuevo nombre, de modo que los datos de imagen original se guarda inalterado (http://www.ori.dhhs.gov/education/products/RIandImages).
  6. Introduzca los parámetros de importación de la siguiente manera, el tipo de imagen: de 8 bits, Ancho: 512, Altura: 1024, Offset: 0; Número de imágenes: 128.
  7. Seleccione "Plugins -> R EGISTRO -> StackReg" en el menú de plugins. Y a continuación, seleccione la opción "cuerpo rígidoOpción ". A continuación, seleccione "Archivo -> Guardar como -> TIFF" para guardar la pila alineada.
  8. Seleccione "Proceso -> Filtros -> La media 3D" en el menú de proceso. Introduzca los parámetros X = 1, Y = 1 y Z = 1, como las opciones de filtro. Repita este paso dos veces.
  9. Seleccione "Archivo -> Guardar como -> TIFF" para guardar la pila promedio. Haga girar la rueda del ratón para desplazarse a fotograma 1 de la pila activa.
  10. Seleccione "Proceso -> Mejorar contraste local (CLAHE)" en el menú Procesamiento. Utilice el tamaño de bloque parámetros: 31, intervalos del histograma: 256, Pendiente máxima: 5, Máscara: ninguno, y marque la opción "rápida". Utilice la tecla de flecha derecha para avanzar al siguiente fotograma.
  11. Mover al bastidor 2 de la pila activa y repita el Process-> Mejorar contraste local (CLAHE). Repita hasta que todas las tramas han tenido un mayor contraste.
  12. Seleccione "Archivo -> Guardar como -> TIFF"; guardar la pila con contraste. A continuación, seleccione "Imagen -> Ajustar -> Tamaño" en el menú Imagen. Desactive la opción "Restringir Relación de aspecto", a continuación, introduzca Anchura: 2.048 y altura: 1.024 valores.
  13. Seleccione "Imagen -> Transformar -> Voltear verticalmente" en el menú Imagen. A continuación, seleccione "Analizar -> Set Escala" en el menú Analizar. Introducir distancia en píxeles: 2048, distancia Conocido: 4000, y Proporción de píxeles: 1, y haga clic en Aceptar. Seleccione "Archivo -> Guardar como -> TIFF" para guardar el 1 calibrada: relación de pila 1 aspecto.
  14. Lentamente girar la rueda del ratón para examinar visualmente las exploraciones para identificar un cruce buque distintivo para servir como un punto de referencia dentro de los análisis. Anote el número de la imagen y el número de referencia del marco de la hoja de cálculo de análisis.
  15. Pulse la flecha izquierda clave 15 veces para ir a la primera trama de medición. Seleccione la opción "SelectionsR a mano alzada21; herramienta de la barra de herramientas.
  16. Coloque el ratón en el centro de Carolina del Sur y pulse la flecha hacia arriba. Repita este paso hasta SC llene la pantalla.
  17. Manualmente segmento SC encerrando en un círculo la frontera con el ratón. Mantenga pulsada la tecla control (Ctrl) y pulse D para el marco de imagen actual. Mantenga pulsada la tecla Ctrl y pulse M. Transcribe la medición de SC área transversal y número de fotograma de medición a la hoja de cálculo de análisis. De-seleccionar el área esbozado. Pulse la tecla de flecha hacia la derecha 3 veces. Repita este paso hasta que SC se ha medido en 10 cuadros.
  18. Pulse la flecha izquierda clave 30 veces para volver a la primera trama de medición.
  19. Seleccione la herramienta segmento recto de la barra de herramientas.
  20. Dibuja una línea recta desde los más anterior a posterior-la mayoría de los lugares en SC. Mantenga pulsada la tecla control y pulse D para sólo el marco actual. Mantenga presionada la tecla Control y pulse longitud M. Transcribe SC y número de fotograma a la hoja de cálculo de análisis. De-seleccionar el área esbozado. Pulse la tecla de flecha derecha3 veces. Repita este paso hasta que la longitud SC se ha medido en las mismas 10 fotogramas como el área transversal SC.
  21. Inserte longitud = SC-CSA / axial la ecuación SC-IOWD en la hoja de cálculo de análisis para calcular la media SC interior de la pared la distancia de pared exterior (SC-IOWD) dividiendo las mediciones de área por las medidas de longitud.
  22. Pulse la flecha izquierda clave 30 veces para volver a la primera trama de medición.
  23. Seleccione la herramienta segmento recto de la barra de herramientas.
  24. Dibuja una línea recta desde el más anterior en Carolina del Sur hasta la frontera de la malla trabecular y la cámara anterior. Asegúrese de que la línea es perpendicular a la frontera. Sostenga la tecla Ctrl y pulse D, entonces M.
  25. Dibuja una línea desde la parte posterior, más ubicación de Carolina del Sur y la frontera de la TM y la cámara anterior. Asegúrese de que la línea perpendicular a la frontera. Sostenga Control y pulse D, entonces M.
  26. Dibuja una línea desde el centro de Carolina del Sur y la frontera de la TM y la cámara anterior. Asegúrese de que el line perpendicular a la frontera. Mantenga pulsada la tecla control y pulse D para sólo el marco actual.
  27. Transcribir las tres mediciones de espesor TM y número de marco a la hoja de cálculo de análisis. Para ello pulse la tecla de flecha hacia la derecha 3 veces. Repita este paso hasta que el espesor TM se ha medido en las mismas 10 fotogramas como el área transversal SC.

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Resultados

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El uso de estas técnicas de adquisición de datos y de análisis de imagen, se obtienen los efectos de los cambios pequeños y grandes en la PIO en los parámetros morfológicos del tracto de salida, tales como SC área de sección transversal (Figura 1). Podemos ver que los altos niveles de aumento de la PIO producen un colapso observable de SC, como se representa por una gran reducción en el área de la sección transversal. El ojo parece ser capaz de acomodar los pequeños aumentos en la PIO, como lo demuestra...

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Discusión

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La presente técnica aprovecha la observación no invasiva de la respuesta mecánica de los tejidos blandos para cuantificar colapso SC. Se necesita trabajo futuro usando los ojos de cadáveres humanos para calibrar deflexiones tejido rigidez del tejido real después de la disección. Pero, estos estudios van a sufrir las mismas limitaciones de los modelos de flujo de salida anteriores; en concreto, que las contribuciones de los músculos que viven a la tensión del tejido no estarán presentes. Además de calibración en un model...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dr. Schuman recibió regalías por propiedad intelectual licenciada por el Instituto de Tecnología de Massachusetts y Massachusetts Eye and Ear Infirmary de Zeiss, Inc.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Apoyado en parte por los contratos R01-EY13178 y P30-EY08098 del Instituto Nacional de Salud (Bethesda, MD), la Fundación del Ojo y el Oído (Pittsburgh, PA), y subvenciones sin restricciones de Investigación para Prevenir la Ceguera (Nueva York, NY).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Dominio espectral OCTZeissCirrus
Imaging WorkstationAppleiMac
OphthalmodinamometerBaillairt Matalene Ophthalmodinamometer, Surgical instruments CO., Inc. Nueva York, NY
Programa de Procesamiento de Imágenesrsb.info.nih.gov/ijImageJ, FIJI

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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