Presentamos aquí un protocolo para el aislamiento de islotes del modelo de ratón de diabetes tipo 2, Leprdb y detalles de un ensayo de células vivas para la medición de la secreción de insulina de islotes intactos que utiliza microscopía de 2 fotones.
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En este artículo
Resumen
Resumen
La diabetes tipo 2 es una enfermedad crónica que afecta a 382 millones de personas en 2013, y se espera que aumente a 592 millones en 2035 1. Durante las últimas 2 décadas, el papel de la disfunción de las células beta en la diabetes tipo 2 se ha establecido claramente 2. Progreso de la investigación ha requerido métodos para el aislamiento de islotes pancreáticos. El protocolo del aislamiento de islotes presenta aquí comparte muchos pasos comunes con protocolos de otros grupos, con algunas modificaciones para mejorar el rendimiento y la calidad de los islotes aislados de tanto el tipo silvestre y db Lepr diabéticos (db / db) ratones. Un método de formación de imágenes 2-fotón de células vivas se presenta entonces que se puede utilizar para investigar el control de la secreción de insulina en islotes.
Introducción
El papel de la disfunción de las células beta en la enfermedad ha sido ampliamente reconocida 3,4. Las líneas celulares como el MIN6 e INS-1 son herramientas útiles para entender la biología del comportamiento de las células beta. Sin embargo, el control fisiológico de la secreción de insulina tiene lugar dentro de los islotes de Langerhans. Estos islotes contienen miles de células beta apretadas, así como los vasos sanguíneos y otros tipos de células endocrinas. Este entorno dentro del islote influye en la secreción de insulina y es probable que sea importante en la diabetes. Por lo tanto, para entender el control fisiológico de la secreción de insulina, ....
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Protocolo
NOTA: Todos los experimentos actuales se realizaron de acuerdo con los procedimientos de ética locales de animales de la Universidad de Queensland (aprobado por la Universidad de Queensland, Comité de Ética Biosciences anatómica).
1. Aislamiento Islet
- Preparación de los reactivos
- Mezcla de enzimas
- Para la digestión pancreática, utilizar una mezcla de Liberase y colagenasa tipo IV. Diluir Liberase TL (termolisina bajo) 1 vial de 5 mg con 26 ml de DMEM (Medio Eagle Modificado de Dulbecco).
- Preparar colagenasa tipo IV en tampón de Hank a una concentración de 0,5 mg / ml, complementado con HEPES 5 mM, 0,....
- Mezcla de enzimas
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Resultados
Rendimiento de los islotes y purificación
Para un tipo salvaje ratón normal, se espera que unos 200 islotes. Islotes sanos mirar brillante, forma redonda y tienen un borde liso. Un lote aislamiento digerido sobre-usualmente tiene islotes pequeños y difusos mientras que un lote bajo-digerido tiene menos islotes y células acinares adjunto islotes (Figura 3). Para los ratones db / db diabéticos, el rendimiento de los islotes y la apariencia depende de la progresión de la enferm.......
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Discusión
El factor más crítico en el aislamiento de islotes es la perfusión inicial del páncreas; un bajo perfundido páncreas resultados con un rendimiento de islotes considerablemente menor. Otros factores también afectan a la calidad de aislamiento tales como el tiempo de digestión y el nivel de agitación que podría compensar en parte el nivel de perfusión. Por ejemplo, tendrá que ser incubaron a 37 ° C durante ~ 18 min 30 sec mientras se agitaba suavemente, en un contraste bajo digerido páncreas pueden requerir ~ 20 min más d.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por una subvención del Consejo de Investigación Australiano DP110100642 (a PT) y las subvenciones del Consejo Nacional de Investigación Médica y de Salud APP1002520 y APP1059426 (a PT y HYG).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Liberase TL 5 mg | Roche-5401020001 | ||
| Colagenasa tipo IV-1g | Gibco-Life Technologies | 17104-019 | |
| Histopaque 1077 500 ml | Sigma Aldrich | 10771 | |
| RPMI 1640 Medio (10x) 1L | Sigma Aldrich | R1383 | para preparar medios de aislamiento |
| RPMI 1640 (1x) 500 ml | Gibco-Life Technologies | 21870-076 | para preparar medios cultivados |
| Penicilina-Estreptomicina 100 ml | Gibco-Life Technologies | 15140-122 | para preparar medios cultivados |
| Suero fetal bovino 500 ml | Gibco-Life Technologies | 10099-141 | para preparar medios de cultivo |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Gibco-Life Technologies | 11966-025 | para diluir la liberasa |
| Programa Metamorph | Molecular Devices, EE. UU. | para analizar las imágenes de 2 fotones |
Referencias
- Guariguata, L., et al. Global estimates of diabetes prevalence for 2013 and projections for 2035. Diabetes Research and Clinical Practice. 103, 137-149 (2014).
- Ashcroft, F. M., Rorsman, P. Diabetes mellitus and the beta cell: The last ten years. Cell<....
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Reimpresiones y permisos
