Artículo de método

Lepr

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DOI:

10.3791/52632

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11 de mayo de 2015

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1School of Biomedical Sciences, The University of Queensland

En este artículo

Resumen

Presentamos aquí un protocolo para el aislamiento de islotes del modelo de ratón de diabetes tipo 2, Leprdb y detalles de un ensayo de células vivas para la medición de la secreción de insulina de islotes intactos que utiliza microscopía de 2 fotones.

Resumen

La diabetes tipo 2 es una enfermedad crónica que afecta a 382 millones de personas en 2013, y se espera que aumente a 592 millones en 2035 1. Durante las últimas 2 décadas, el papel de la disfunción de las células beta en la diabetes tipo 2 se ha establecido claramente 2. Progreso de la investigación ha requerido métodos para el aislamiento de islotes pancreáticos. El protocolo del aislamiento de islotes presenta aquí comparte muchos pasos comunes con protocolos de otros grupos, con algunas modificaciones para mejorar el rendimiento y la calidad de los islotes aislados de tanto el tipo silvestre y db Lepr diabéticos (db / db) ratones. Un método de formación de imágenes 2-fotón de células vivas se presenta entonces que se puede utilizar para investigar el control de la secreción de insulina en islotes.

Introducción

El papel de la disfunción de las células beta en la enfermedad ha sido ampliamente reconocida 3,4. Las líneas celulares como el MIN6 e INS-1 son herramientas útiles para entender la biología del comportamiento de las células beta. Sin embargo, el control fisiológico de la secreción de insulina tiene lugar dentro de los islotes de Langerhans. Estos islotes contienen miles de células beta apretadas, así como los vasos sanguíneos y otros tipos de células endocrinas. Este entorno dentro del islote influye en la secreción de insulina y es probable que sea importante en la diabetes. Por lo tanto, para entender el control fisiológico de la secreción de insulina, y la fisiopatología de la enfermedad, es esencial para estudiar islotes intactos.

Aislamiento Islet

Islotes humanos vivos y, en particular, islotes humanos de los pacientes con diabetes tipo 2 son difíciles de obtener. Además, islotes humanos tienen limitadas posibilidades de manipulación molecular experimental. Por lo tanto, los investigadores han empleado esdeja de animales y modelos animales de diabetes tipo 2. Uno de estos modelos de la enfermedad es el ratón db / db. Esta es una mutación espontánea que los modelos de la diabetes tipo 2 con una progresión fenotipo que se asemeja mucho a la enfermedad humana 5,6. El protocolo que aquí se presenta para el aislamiento de los islotes de los ratones db / db diabéticos tiene muchos pasos en común con otros grupos con algunas opciones de mejor rendimiento, depuración y mejora la supervivencia de los islotes.

Imagen 2 de fotones

El ensayo de 2 fotones de células vivas se describe aquí permite a los investigadores para cuantificar el número y evaluar las características de los gránulos individuales que contiene insulina de muchas células del diabético 7 y de tipo salvaje islotes 8,9.

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Protocolo

NOTA: Todos los experimentos actuales se realizaron de acuerdo con los procedimientos de ética locales de animales de la Universidad de Queensland (aprobado por la Universidad de Queensland, Comité de Ética Biosciences anatómica).

1. Aislamiento Islet

  1. Preparación de los reactivos
    1. Mezcla de enzimas
      1. Para la digestión pancreática, utilizar una mezcla de Liberase y colagenasa tipo IV. Diluir Liberase TL (termolisina bajo) 1 vial de 5 mg con 26 ml de DMEM (Medio Eagle Modificado de Dulbecco).
      2. Preparar colagenasa tipo IV en tampón de Hank a una concentración de 0,5 mg / ml, complementado con HEPES 5 mM, 0,5 mM CaCl 2, 0,1 mg / ml de DNasa y 1 mg / ml de albúmina de suero bovino.
      3. Mezclar la TL Liberase y soluciones de colagenasa en una proporción de 4: 1 (por volumen), es decir, 4 ml Liberase TL + 1 ml de colagenasa. Alícuota la mezcla de enzimas de 2,5 ml cada una y se almacena a -20 ° C.
        NOTA: Los tiempos de incubación del tejido vary un poco entre lotes de enzima (30 seg a 1 min diferencia). Por lo tanto, puede ser necesario un ensayo de lote.
    2. RPMI Aislamiento Medios
      1. Disolver un vial de RPMI 1640 en polvo en 1 L de agua a RT y complementar con 2 g de NaHCO 3, 4,02 g de HEPES.
      2. Combine los medios de aislamiento RPMI en un matraz cónico grande, mezcla con un agitador magnético, se ajusta a pH 7,4 con NaOH, filtro de esterilizar y almacenar a 4 ° C.
    3. RPMI Medios de Cultivo
    4. Usar medios de cultivo RPMI, con suero bovino fetal al 10% y 1% de antibióticos (es decir, penicilina 100 U / ml, estreptomicina 100 g / ml).
  2. Aislamiento y cultivo Islet
    1. Sacrificio de Animales
      1. Sacrificar los ratones por dislocación cervical o asfixia de CO 2 de acuerdo a los procedimientos de ética de la institución local. Pulverizar el cuerpo del ratón a fondo con etanol al 70%.
    2. Perfusión de páncreas
      1. USE 2 cortes largos lateralmente a través de la piel abdominal y el peritoneo para hacer una solapa en forma de V. Tire de la solapa de la piel hacia arriba para descubrir toda la cavidad abdominal, dejar a un lado el intestino y mantener el hígado en su lugar por un pañuelo de papel doblado para revelar el conducto biliar común (Figuras 1 y 2). Ponga el animal de modo que la cabeza hacia el cirujano y la cola lejos de la cirujano.
      2. Aplicar una pinza vascular en la ampolla en la pared duodeno para bloquear las enzimas inyectadas de entrar en el duodeno (Figura 1).
        NOTA: Este es un paso importante, ya que determina si las enzimas inyectadas voy a entrar en el conducto pancreático y perfundir el páncreas o el reflujo de la zona de inyección (más de pinza) o entrar en el duodeno (menores de pinza).
      3. Canular la vía biliar común con una aguja de calibre 31 cerca de la unión del conducto hepático común y el conducto cístico (Figura 1) y dejar espacio para una segunda inyección si ªe páncreas no para perfundir la primera vez. Lentamente (más de ~ 10 seg) inyectar unos 2 ml de mezcla de enzimas fría en el ratón del conducto biliar común.
        NOTA: El páncreas se perfundieron rápidamente si la pinza está en la posición correcta.
      4. Ajuste la posición de la abrazadera si la aguja está dentro del conducto biliar común, pero no puede perfundir el páncreas (es decir., Ascender en la pinza un poco lejos del hígado si sobre sujetado o moverlo un poco al hígado si es menor sujetado).
        NOTA: La aguja a veces entra en la cápsula que rodea en lugar de la luz del conducto. Un signo útil para comprobar si la aguja está dentro del conducto biliar común es la dilatación del conducto cuando se inyecte. Si el páncreas no para perfundir, una alternativa es la mezcla de enzima podría ser inyectado a múltiples sitios de páncreas con menor rendimiento esperado. La perfusión del sitio izquierda del páncreas (el lóbulo esplénica) es importante para la maximización del rendimiento de los islotes.
      5. Después de que el páncreas es perfused, eliminar rápidamente el páncreas, lo puso en un vial (~ 20 ml, vidrio) y se incuba durante ~ 19 minutos en un baño de agua 37 ° C.
        NOTA: El tiempo de incubación puede variar un poco dependiendo de la cepa de ratón y la edad.
      6. Después del tiempo de incubación, detener el proceso de la digestión mediante la adición de ~ 20 ml de medios de aislamiento frío. Agitar el vial suavemente para interrumpir el páncreas y se vierte a través de un tamiz de té normal (diámetro de poro de 1 mm) en un tubo de 50 ml estéril. Rellenar el tubo con medios de aislamiento y se centrifuga a 400 xg durante 1 min a 4 ° C con freno de apagado.
      7. Disolver el precipitado en los medios de aislamiento de nuevo y transferir a dos tubos de 15 ml y centrifugar a 400 xg durante 1 min a 4 ° C con freno de apagado. Después de la aspiración del sobrenadante, mezclar los dos gránulos bien con 6 ml de medio de separación de células en gradiente de densidad (Histopaque solución 1,077) por tubo mediante agitación con vórtex o pipeteando arriba y abajo. A continuación, añadir suavemente ~ 6 ml de los medios de aislamiento para el lado del tubo en la parte superior delos medios de separación de gradiente de densidad y centrifugar a 100 xg durante 15 min a 4 ° C con freno off.
      8. Recoger el sobrenadante en la parte superior (medios de aislamiento), medio e inferior (densidad medios de separación celular gradiente) de la capa 3 en platos separados. Handpick los islotes en estos 3 platos, usando una pipeta en un microscopio de disección.
        NOTA: La capa media contiene la mayoría de los islotes. Los islotes se reconocen como estructuras compactas de ~ 50 a 500 micras de tamaño (Figura 3). Obtenemos ~ 200 islotes en ratones WT y 300- <100 islotes en ratones db / db.
    3. El cultivo Islet
      1. Para ayudar a los islotes se recuperan de la digestión enzimática, grupos culturales de 40 islotes en un 25 cm placa de Petri con 6 ml de RPMI cultura de los medios (10 mM glucosa) a 37 ° C, 5% / 95% de CO 2 / O 2 durante 2 días antes en directo las células beta de imágenes 2-fotón. Cambie el medio de cultivo a diario.

2. Vivo Cell 2-Photon imágenes

  1. Preparación de los reactivos
    1. Extracelular Buffer
      1. Preparar el tampón extracelular de sodio rico para el ensayo 2-fotón con NaCl 140 mM, 5 mM KCl, 2,5 mM CaCl 2, 1 mM de MgCl 2, 5 mM NaHCO 3 y 10 mM HEPES.
    2. Extracelular Tinte
      1. Para el ensayo de 2 fotones, preparar social SRB 8 mM en tampón extracelular, alícuota en pequeños tubos y almacenar a -20 ° C. Diluir el Stock SRB 1:10 en tampón extracelular fresco para obtener una concentración de trabajo de 0,8 mM.
  2. Imágenes de fotones
    1. En primer lugar, pre-incubar 2-día islotes cultivados en 3 mM de tampón extracelular de glucosa durante 30 min.
      NOTA: Nosotros usamos islotes entre 2 y 5 días en cultivo.
    2. Luego, colocar una lámina de vidrio en la cámara de control térmico montado en la platina del microscopio. Utilice grasa para evitar la filtración de solución.
    3. Cubra la cámara con 500 l de extracelulartampón ular que contiene 0,8 mM SRB con diferentes concentraciones de glucosa (3 mm, 6 mm, 15 mm y glucosa 20 mM).
    4. A continuación, colocar el islote pre-incubado en el centro de la cámara y se centran en 3-4 capas de células en el islote donde, en los islotes de roedores, la inmunotinción para la insulina muestra que la mayoría de las células son células beta.
      NOTA: El SRB será delinear toda la membrana de la célula del islote de forma rápida y el islote está listo para la imagen.
    5. Utilice un microscopio 2-fotón con un objetivo de inmersión en aceite 60X (NA 1,42) y el software de formación de imágenes (por ejemplo., Scanimage 11). La figura 4 ilustra una disposición típica microscopía. Imagen eventos exocytic utilizando SRB como una membrana impermeable fluorescente marcador extracelular excitados por pulsos láser de femtosegundo a 880 nm, con fluorescencia detectados a 550-650 nm. Anote las respuestas de los islotes a la estimulación.
    6. Identificar eventos exocytic individuales por la aparición repentina de una pequeña mancha fluorescente (resolución de 10 píxeles /1; m) y confirmar con la fase de rápido aumento de la señal fluorescente sobre una región de interés (~ 0,78 m 2).

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Resultados

Rendimiento de los islotes y purificación

Para un tipo salvaje ratón normal, se espera que unos 200 islotes. Islotes sanos mirar brillante, forma redonda y tienen un borde liso. Un lote aislamiento digerido sobre-usualmente tiene islotes pequeños y difusos mientras que un lote bajo-digerido tiene menos islotes y células acinares adjunto islotes (Figura 3). Para los ratones db / db diabéticos, el rendimiento de los islotes y la apariencia depende de la progresión de la enferm...

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Discusión

El factor más crítico en el aislamiento de islotes es la perfusión inicial del páncreas; un bajo perfundido páncreas resultados con un rendimiento de islotes considerablemente menor. Otros factores también afectan a la calidad de aislamiento tales como el tiempo de digestión y el nivel de agitación que podría compensar en parte el nivel de perfusión. Por ejemplo, tendrá que ser incubaron a 37 ° C durante ~ 18 min 30 sec mientras se agitaba suavemente, en un contraste bajo digerido páncreas pueden requerir ~ 20 min más d...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por una subvención del Consejo de Investigación Australiano DP110100642 (a PT) y las subvenciones del Consejo Nacional de Investigación Médica y de Salud APP1002520 y APP1059426 (a PT y HYG).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Liberase TL 5 mgRoche-5401020001
Colagenasa tipo IV-1gGibco-Life Technologies17104-019
Histopaque 1077 500 mlSigma Aldrich10771
RPMI 1640 Medio (10x) 1LSigma AldrichR1383para preparar medios de aislamiento
RPMI 1640 (1x) 500 mlGibco-Life Technologies21870-076para preparar medios cultivados
Penicilina-Estreptomicina 100 mlGibco-Life Technologies15140-122para preparar medios cultivados 
Suero fetal bovino 500 mlGibco-Life Technologies10099-141para preparar medios de cultivo
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)Gibco-Life Technologies11966-025para diluir la liberasa
Programa MetamorphMolecular Devices, EE. UU.para analizar las imágenes de 2 fotones

Referencias

  1. Guariguata, L., et al. Global estimates of diabetes prevalence for 2013 and projections for 2035. Diabetes Research and Clinical Practice. 103, 137-149 (2014).
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