Artículo de método

De Alto Rendimiento Cuantitativa en tiempo real RT-PCR ensayo para determinar los perfiles de expresión de los tipos I y III de interferón subtipos

DOI:

10.3791/52650

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24 de marzo de 2015

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1Center for Biologics Evaluation and Research, US Food and Drug Administration, 2Center for Drug Evaluation and Research, US Food and Drug Administration

En este artículo

Resumen

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Este protocolo describe un ensayo qRT-PCR de alto rendimiento para el análisis de firmas de expresión de IFN de tipo I y III. El ensayo discrimina las diferencias de pares de bases individuales entre las transcripciones altamente similares de estos genes. A través del ensamblaje de lotes y el pipeteo robótico, los ensayos son consistentes y reproducibles.

Resumen

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En este informe se describe un ensayo qRT-PCR para el análisis de diecisiete subtipos de IFN humano en un formato de placa de 384 pocillos que incorpora sondas de ácido nucleico bloqueado (LNA) y balizas moleculares (MB) altamente específicas, estándares de transcripción, pipeteo multicanal automatizado y secado de placas. La determinación de la expresión entre los interferones de tipo I (IFN), especialmente los doce subtipos de IFN-α, está limitada por su identidad de secuencia compartida; asimismo, las secuencias del IFN tipo III, especialmente el IFN-λ2 y -λ3, son muy similares. Este ensayo proporciona un medio fiable, reproducible y relativamente barato para analizar la expresión de los diecisiete transcritos del subtipo de interferón.

Introducción

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Tipos I y III interferones (IFN) son críticos en la respuesta inmune a los virus y otros estímulos patógenos y presente en todos los vertebrados 1. Las células inmunes y no inmunes expresan y secretan, así como responder a, IFN 2. Sensores de inmunidad innata, como los receptores tipo Toll (TLR), picadura, y RIG-I, inducen tipo I y III IFN expresión ante la detección de patógenos patrones moleculares asociados (PAMP) 3,4. En los seres humanos, IFN de tipo I incluyen IFN-β, -ω, -κ, y 12 subtipos de IFN-α, y se unen al receptor IFNAR1 / IFNAR2 complejo de 2,5. Tipo III IFN incluyen IFN-λ1, -λ2, y -λ3 y se unen al complejo receptor IL10RB / IL28RA 2. Clásicamente, los tipos I y III IFN se unen a sus respectivos complejos de receptores que a su vez reclutan STAT1 / heterodímeros STAT2 e iniciar la transcripción de genes de interferón estimulado (ISG) 6. ISG están involucrados en una amplia gama de funciones, desde antiviral y antila actividad proliferativa a la activación de la respuesta inmune adaptativa 7.

Los numerosos mecanismos patógenos han evolucionado para evadir, subvertir, y secuestrar elementos de la vía de señalización de IFN demuestran la importancia de IFN en la respuesta inmune innata 8. Por ejemplo, el virus vaccinia expresa un receptor señuelo con homología IFNAR1 que secuestra IFN tipo I 9 mientras que un virus de la enfermedad Yaba-como segrega una glicoproteína que inhibe las proteínas de tipo I y III IFN 10. Además de su papel en la defensa del huésped, IFN también están implicadas en la vigilancia del cáncer y una serie de enfermedades auto-inflamatoria: silenciamiento de la expresión de IFN en células de cáncer de mama restringe inmunovigilancia 11, la sobreproducción de IFN-α es un mecanismo en el desarrollo de sistémico lupus eritematoso 12, y la activación errante de STING conduce a la inflamación sistémica causada por cantidades excesivas de IFN en la vasculopatía STING-asociado13. Terapéuticamente, IFN se utilizan para tratar la esclerosis múltiple 14, infecciones virales crónicas, tales como HBV y HCV 16,17 15, y los cánceres tales como la leucemia de células pilosas 18 y leucemia mielógena crónica 19. Preguntas sobre la relevancia de IFN en un proceso fisiológico particular, revelan continuamente la naturaleza ubicua de esta familia de citoquinas.

Tipo I IFN, especialmente los subtipos de IFN-α, a menudo considerada como una entidad 20-23, en lugar de como un grupo de estrechamente relacionados, pero distintos, las proteínas. La existencia y la persistencia de múltiples especies de IFN incluyendo los subtipos de IFN-α, durante la evolución de los vertebrados 24 sugiere que al menos un subconjunto de estos subtipos tienen funciones específicas o únicas. Es posible que los patrones que definen la expresión de IFN se descifrar y ayudar a caracterizar las funciones específicas de uno o más de los subtipos 17. El reto de estudiar tque escriba subtipos I y III IFN se basa en su identidad de secuencia compartida: los doce subtipos de IFN-α comparten> 50% 25 y los subtipos de IFN-λ comparten 81-96% 26 de sus secuencias de aminoácidos. En el ensayo de QRT-PCR descrito, baliza molecular (MB) y ácido nucleico bloqueado (LNA) sondas fluorescentes discriminan individuales diferencias de pares de bases entre las secuencias del subtipo IFN muy similares y permiten la caracterización de la firma la expresión de IFN. 384 pocillos formato de placa de El ensayo incluye tanto cuantitativos (normas de transcripción) y (los genes del hogar (HKG)) semi-cuantitativos medidas, lo que permite el análisis de número de copias de la transcripción y ΔCq respectivamente. Montaje de lotes, facilitado por pipeteo automatizado multicanal, y almacenamiento a largo plazo, es posible a través de secado de la imprimación / sonda (Pr / Pb) establece en las placas, mejorar la reproducibilidad, utilidad y practicidad del ensayo.

Este protocolo describe el procesopara la preparación de placas de 384 pocillos de ensayo QRT-PCR (Figura 1) con hasta diecisiete conjuntos Pr / Pb diferentes dirigidos subtipos de IFN humanos (Tabla 1). Pr / Pb conjunto de trabajo placas fuente de valores (Figura 2) se utilizan para preparar múltiples de 384 pocillos placas de ensayo en un proceso que puede ser automatizado usando una pipeta multicanal robótica. Mientras que el enfoque inicial fue en la creación de un protocolo para el estudio de firmas de expresión de IFN humanos, este método se ha aplicado a los macacos rhesus también. Aunque los diseños de placa son ligeramente diferentes y los conjuntos de Pr / Pb (Tabla 2) son distintos, el método de preparación general para la creación de las placas humanos y rhesus es idéntico. Con modificaciones mínimas del protocolo, el método puede ser ejecutado para permitir el desarrollo de ensayos para estudiar otros grupos de genes estrechamente relacionados.

Ver las figuras 1 y 2 Debajo

Véanse las Tablas 1 y 2 Belay

Protocolo

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1. Preparación de diluciones en serie estándar (Figura 3A)

NOTA: serie de dilución de serie de plásmidos linealizados que contenían las secuencias blanco de un conjunto Pr / Pb se utilizan como normas cuantitativas para el ensayo de QRT-PCR. Cada conjunto de dilución en serie estándar para los subtipos de IFN contiene suficiente volumen para funcionar 90 placas de ensayo. Los cuatro puntos de la curva de dilución estándar usado para el ensayo se seleccionan para cubrir los valores de Ct de un rango de 20 a 32 (Tabla 3).

  1. Thaw, vórtice, y centrifugar brevemente el estándar (50 pM) y ADN de esperma de salmón (ssDNA, 10 mg / ml) de soluciones madre.
  2. Preparar la mezcla de ssDNA / agua para los 17 conjuntos de dilución estándar mediante la mezcla de 51 l de ssDNA con 20,3 ml de agua.
  3. Marque uno de 8 tubos PCR tira para un conjunto de diluciones estándar.
    NOTA: Preparación de las diluciones en serie estándar de las soluciones madre se llevará a 2-3 horas.
  4. Prescindir de 190 l de la mezcla ssDNA / agua para el ftubo rimero en la avenida principal y 180 l de mezcla / agua ssDNA a los cinco tubos restantes.
  5. Realizar una dilución 1:20 de la transferencia de 10 l de la madre de patrón 50 pM al tubo con 190 l de la ssDNA / agua, mezclar; vórtice y rápidamente centrifugar la tira PCR.
  6. Realizar una dilución 1:10 mediante la transferencia de 20 l desde el tubo más recientemente diluida a la siguiente tubo en la serie; vórtice y rápidamente centrifugar la tira PCR.
  7. Repita el paso 1.6 hasta el último tubo en la serie de dilución ha recibido la norma.
  8. Repita los pasos 1.3 a 1.7 para cada estándar.

Véase el cuadro 3

2. Preparación de cebadores / sondas (Pr / Pb) y Control Sin Templado (NTC) de funcionamiento Stock Mixes (Figura 3B)

NOTA: Cada 1,7 ml Pr / Pb conjunto stock y 128,6 l control sin molde (NTC) de trabajo stock mezcla hará 30 placas de ensayo de trabajo.

  1. Prepare el Pr / Pb establecido mezclas material de trabajo.
    NOE: Preparación del conjunto Pr / Pb y NTC madre de trabajo se mezcla de las soluciones madre se llevará a 03.02 h.
    1. Resuspender los cebadores y sondas en 100 m con agua ultra pura para la preparación de las soluciones madre.
    2. Etiquetar hasta diecisiete 2 tubos ml; uno para cada conjunto Pr / Pb incluido en el ensayo.
    3. Thaw, vórtice, y centrifugar brevemente los cebadores (100 m), sondas (100 m), y ssDNA (10 mg / ml) soluciones madre.
    4. Añadir 2 l de ssDNA a cada tubo usando el 12,5 l pipeta multicanal electrónica. Añadir el cebador directo apropiado, cebador inverso, y la sonda a cada Pr / Pb conjunto de trabajo tubo stock. Ver Tabla 1 para los conjuntos Pr / Pb dirigidos subtipos IFN humanos y la Tabla 2 para el macaco rhesus conjuntos Pr / Pb. Añadir agua para llevar el volumen de cada Pr / Pb conjunto de trabajo tubo stock de 200 l.
      NOTA: El volumen de los cebos, la sonda y el agua a añadir depende de la concentración de la reacción final requerido de un Pr / Pbestablecer.
  2. Preparar las mezclas de valores NTC trabajo.
    1. Etiqueta dos tiras de PCR 5 tubos para las poblaciones que trabajan NTC mezclas.
    2. Transferencia de 14,3 l de cada Pr / Pb establecen en el tubo apropiado mezcla madre de trabajo NTC. Ver Tabla 4 para las combinaciones de juegos de Pr / Pb para pozos NTC. Añadir agua para cada una de las acciones de trabajo NTC mezclas para llevar el volumen final a 128,6 l.
    3. Vortex, centrifugar brevemente, y colocar los tubos en la oscuridad en hielo oa -20 ° C para almacenamiento a largo plazo.

Ver Tabla 4 Abajo

  1. Diluir el Pr / Pb establecido reservas de trabajo.
    1. Después de la eliminación de una parte alícuota de los conjuntos Pr / Pb necesarios para las mezclas de acciones de trabajo del CNT, añadir 1,5 ml de agua para llevar el volumen final de cada Pr / Pb conjunto de trabajo tubo stock a 1,7 ml.
    2. Vortex, centrifugar brevemente, y colocar los tubos en la oscuridad en hielo oa -20 ° C para el almacenamiento a largo plazo.
3. Preparación de placas de ensayo de 384 pocillos usando la pipeta multicanal automatizado

  1. Preparar un plato fuente de 96 pocillos de los conjuntos Pr / Pb y mezclas NTC para alícuotas de 384-así placas de ensayo.
    NOTA: Preparación de la placa de la fuente de los Pr / Pb mezclas funcionamiento acciones tomará menos de 1 hora. Cada placa de fuente de 96 pocillos es suficiente para hacer seis placas de ensayo de 384 pocillos (Figura 3C).
    1. Vortex y centrifugar brevemente el Pr / Pb establecido reservas de trabajo y NTC mezclas de acciones de trabajo.
    2. Coloque una nueva placa de 96 pocillos en un bloque de 96 pocillos de enfriamiento refrigerada y designar a los pozos para cada conjunto Pr / Pb o NTC mezclar los pocillos reciben (ver Figura 2).
    3. Añadir agua a la placa de 96 pocillos con una pipeta multicanal 250 l electrónico: Dispensar 66 l de agua a cada Pr / Pb fija bien (excepto los 4 pozos para Meta 17). Prescindir de 82,5 l de agua a las 4 Objetivo 17 pozos. Prescindir de 27,5 l de agua a cada mezcla NTC bien.
    4. Añadir la correcta Pr / Pb conjunto stock trabajar a los pocillos designados de la placa de 96 pocillos: Dispensar 54 l de la correcta Pr / Pb conjunto stock de trabajo para los pozos de ajuste Pr / Pb designados (excepto los 4 pozos para Meta 17). Prescindir de 67,5 l de la Meta 17 Pr / Pb conjunto stock trabajar a los 17 pozos Objetivo Ajuste Pr / Pb designados. Añadir 22,5 l de la mezcla correcta de existencias NTC trabajar a los pocillos designados.
    5. Sellar la placa de 96 pocillos con una junta de la placa adhesiva y centrifugar durante 1 min a 700 xg para asegurar que los contenidos están en el fondo de los pocillos.
    6. Coloque la placa de 96 pocillos en el mezclador de vórtice usando un adaptador de placa de 96 pocillos y se mezcla durante 1 min a 1000 rpm. Centrifugar la placa de 96 pocillos durante 5 min a 700 x g.
    7. Guarde la placa de fuente de 96 pozos en la oscuridad a 4 ° C si se utiliza en el mismo día, si no almacenar a -20 ° C hasta su uso.
  2. Preparar las placas de ensayo de 384 pocillos añadiendo el Pr / Pb juegos usando la pipeta multicanal automatizada.
    NOTA: Preparación de seis placas de ensayo de la placa de fuente de 96 pocillos se llevará a 3-4 horas.
    1. Antes de hacer las placas, pre-enfriar el nido de refrigeración a 4 ° C y pre-calentar la placa del evaporador a 125 ° C y el bloque de calor inferior a 80 ° C con el flujo de aire que sopla entre 20 a 25 litros por minuto (lpm).
    2. Encienda la pipeta multicanal automatizada y abrir el protocolo para hacer placas de ensayo IFN haciendo doble clic en el icono del software.
    3. Para configurar la plataforma, coloque un cuadro de punta de la pipeta completamente llena en posición de la plataforma 1, la placa de fuente de 96 pozos en la posición 4, y una nueva placa de 384 pocillos en la posición 6. Comienza la ejecución pulsando el botón de reproducción.
      NOTA: Al finalizar la carrera, cada pocillo contendrá 5 l de mezcla Pr / Pb.
      NOTA: El importe final de ssDNA por pocillo de la placa de ensayo de 384 pocillos es de 0,025 mg.
    4. Golpear suavemente la placa de ensayo de 384 pocillos en una superficie plana para asegurar fluidos están en el fondo de los pocillos y aplicar un adhesivojunta de la placa.
    5. Centrifugar la placa durante 1 min a 700 x g. Retire la junta de la placa adhesiva, coloque la placa de 384 pocillos de ensayo en la secadora placa y colocar el colector de 384 pocillos directamente encima de los pozos.
    6. Cuando el contenido de la placa de 384 pocillos de ensayo seca, aplicar una nueva junta de la placa adhesiva, envolver en papel de aluminio, etiqueta, y almacenar en la oscuridad a 4 ° C hasta su uso.
      NOTA: Las placas pueden ser almacenadas a 4 ° C durante al menos 6 meses.
    7. Repita los pasos 3.2.3-3.2.6 hasta 6 x 384 pozos placas de ensayo se preparan o el líquido en la placa de fuente de 96 pozos se agotan.
    8. Apague el nido de refrigeración, cierre el software y apague la pipeta multicanal automatizada. Apague la secadora placa.

4. Carga y Gestión de una placa de 384 pocillos de ensayo

  1. Prepare dos limpieza de genes (HKG) y mezclas, que consisten en el conjunto Pr / Pb de un HKG, ssDNA, maestro de la mezcla de PCR, y el agua, que se añade a una placa de 384 pocillos de ensayo se secaron ( Figura 3D).
    NOTA: La preparación de las mezclas y la carga de la placa de ensayo se llevará a 1-2 horas. Ejecución de la placa de ensayo se llevará a menos de 2 horas.
    1. Etiquetar un tubo de 1,5 ml para cada mezcla HKG.
    2. Diluir 2 l de ssDNA (10 mg / ml) con 84,9 l de agua. Añadir 2 l de la ssDNA diluida, 11,8 l de agua, 23 l de mezcla maestra, y 9,2 l de la correcta 20x HKG Pr / Pr ajustado a cada tubo, vórtice, y centrifugar brevemente.
    3. Utilice deshidrogenasa gliceraldehído-3-fosfato (GAPDH) y ubiquitina C (UBC) como el HKG para el ensayo humano (véase Tabla de Materiales). Utilice GAPDH y 18S ribosomal RNA como la HKG para el ensayo de rhesus.
      NOTA: La HKG utilizado para realizar el ensayo son flexibles y debe reflejar los genes apropiados para el tipo de célula está probando GAPDH, UBC, y 18S son ejemplos de uso común HKG;. otra HKG puede ser más apropiado.
  2. Preparar la muestra y positihe controlar bien mezclas, que consisten en la muestra o cDNA control positivo, mezcla maestra, y agua, que se añade a una placa de 384 pocillos de ensayo seca. Preparar la muestra y las mezclas de control positivo en cantidad suficiente para dispensar a 21 pocillos de la placa (Figura 3D).
    1. Antes de la síntesis de ADNc, siga las instrucciones del fabricante para preparar las muestras de ARN con una etapa de digestión DNasa.
    2. Preparar las muestras y control positivo por adelantado de la síntesis de cDNA de al menos 500 ng de ARN seguido por un tratamiento con RNasa H (volumen final de 24 l para cada muestra) siguiendo las instrucciones del fabricante. Almacenar el cDNA preparado a -20 ° C hasta su uso. Thaw, vórtice, y centrifugar brevemente el cDNA de la muestra.
    3. Añadir 78,8 l de mezcla maestra y 54,8 l de agua a cada muestra 24 l y el tubo de control positivo.
    4. Vortex y centrifugar brevemente los tubos.
  3. Preparar las normas y NTC bien se mezcla, conconsistente de mezcla maestra y agua, que se añade a una placa de ensayo de 384 pocillos se secaron (Figura 3D). Para los estándares bien mezclar, añadir 165 l de agua a 275 l de mezcla maestra en un tubo de 1,5 ml. Para el NTC bien mezclar, añadir 52,5 l de agua a 52,5 l de mezcla maestra en un tubo de 1,5 ml. Vortex y centrifugar brevemente los tubos.
  4. Preparar una placa de ensayo de 384 pozos secos para la carga de las mezclas y muestras.
    1. Retire una placa de 384 pocillos de ensayo seco de 4 ° C y centrifugar durante 1 min a 700 x g.
    2. Colocar la placa en un bloque de 384 pozos de enfriamiento refrigerado, retire la junta de la placa adhesiva y delinear los pocillos de la placa para designar donde las diversas mezclas y muestras se pipetean (Figura 1).
  5. Cargar la placa de 384 pocillos de ensayo con la mezcla bien estándar, normas, NTC bien mezclar, muestras, control positivo y mezcla HKG (Figura 3E). Vortex y centrifugar brevemente todas las soluciones antes de dispensar a la placa.
    1. Dosificar 6 l de las normas bien mezclan a cada pocillo de serie con la electrónica pipeta multicanal 30 l. Prescindir de 1,5 l de la dilución en serie estándar correcto para el bien designado con el 12,5 l pipeta multicanal electrónica.
    2. Dosificar 7,5 l de NTC bien se mezclan para cada NTC bien con la electrónica pipeta multicanal 30 l. Dispensar 7,5 l de la muestra a los pocillos designados con el 30 l pipeta multicanal electrónica. Prescindir de 2,5 l de la HKG Pr / Pb se mezcla a los pocillos designados con el 12,5 l pipeta multicanal electrónica.
    3. Rellene los pozos vacíos con 7,5 l de agua y mezcla maestra mezcla sobrante con el 30 l multicanal electrónica pipeta; 7,5 l de agua sola también funcionarán.
    4. Sellar la placa de 384 pocillos de ensayo con la película de adhesivo óptico y centrifugar durante 1 min a 700 x g. Agite la placa de 384 pocillos sellado en el vórtex durante 2 minutos a 2600 rpmy centrifugar durante 5 min a 700 x g.
    5. Coloque la placa de ensayo de 384 pocillos sellada en la máquina de QRT-PCR, abra la plantilla para el diseño del ensayo y comenzar la ejecución.
      Nota: Los resultados se pueden exportar como una hoja de cálculo o como un archivo de texto para su análisis.
    6. Use las siguientes condiciones de reacción ciclador térmico óptimo para el ensayo: i) 50 ° C durante 2 min, ii) 95 ° C durante 10 min, iii) 95 ° C durante 25 s, iv) 59 ° C durante 1 min. Repita los pasos iii y iv durante 40 ciclos.
    7. Exportar los datos en bruto de la plataforma QRT-PCR en un software de hoja de cálculo. Trazar cada estándar de 4 puntos establecido como una curva estándar para observar la linealidad. Realizar análisis calculando el ΔCq o por el número de copias en base a las curvas de calibración de cuatro puntos de 27.

Ver Figura 3 A continuación

Resultados

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El ensayo de QRT-PCR descrito puede ser implementado para analizar los patrones de expresión de los tipos I y III IFN en una variedad de tipos de células y contextos. Por ejemplo, de tipo I humana y firmas de expresión III IFN se analizaron en las células mononucleares de sangre periférica (CMSP) de 6 donantes estimulados con ligandos TLR; poli I: C (25 mg / ml), LPS (10 ng / ml), imiquimod (10 mM), y oligonucleótidos CpG (1 M) (Figura 4). Los datos se analizaron usando un software de aplicación de hoja de cálculo y se presentan como gráficos de radar con los subtipos de IFN-α dispuestas las agujas del reloj según el árbol filogenético de su secuencia de la proteína 27. Los gráficos radiales de expresión de IFN humano se presentan en una escala logarítmica calculada utilizando los dos métodos diferentes de análisis incorporado en el diseño del ensayo: Cq valor absoluto normalizado a HKG (ΔCq), y el número de copias de la plantilla por microgramo (mg) de ARN total . Los valores de número de copia se calculan a partir del resultado o curva estándar de fa transcripción. Los datos muestran que las firmas de expresión de IFN humanos provocados por agonistas de TLR son ligando específico.

Ver Figura 4 Abajo

Como se ha demostrado por las firmas de expresión de IFN humanos, firmas de expresión de los tipos I y III IFN en macacos rhesus fueron también TLR ligando específico. PBMC de 3 donantes se estimularon con poli I: C (50 mg / ml), LPS (10 mg / ml), y imiquimod (10 mg / ml) durante 3 horas (Figura 5). IFN expresión subtipo de células sin estimular al inicio del estudio fue baja. Se expresaron número limitado de IFN subtipos en respuesta a LPS y poli I: C. En contraste, la expresión de IFN en respuesta a imiquimod fue alta y la expresión subtipo era amplia. La expresión de IFN-β e IFN-λ1 fue reforzada por los tres agonistas TLR 28.

Ver Figura 5 A continuación

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Figura 1:. El diseño de una placa de 384 pocillos de ensayo con diecisiete conjuntos Pr / Pb Objetivo número se refiere a un conjunto Pr / Pb. Las curvas estándar de cuatro puntos (triángulo gris oscuro) se añaden a las columnas 1-5. Los conjuntos HKG Pr / Pb (fondo blanco) se añaden a las columnas 6 y 7. Las columnas restantes, 8-24, son específicas para una de las diecisiete conjuntos Pr / Pb. Las muestras se añadieron a las filas AP, de las columnas 6-24 (flechas negras). Los dos pozos (O5, P5) en la parte inferior de la columna 5 sólo reciben agua y maestro de la mezcla. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2:. El diseño de una placa de fuente de 96 pocillos con diecisiete conjuntos Pr / Pb número objetivo se refiere a un Pr / Pbestablecer. Las flechas negras representan cuando se añade un conjunto Pr / Pb de múltiples pozos. Mezclas NTC se añadieron a los pocillos designados (fondo gris oscuro). Los dos pozos (F3, G3) con líneas diagonales no se utilizan. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Esquema de medidas específicas en el protocolo de ensayo QRT-PCR diagrama AE seleccionar partes del protocolo.. (A) Paso 1: Preparación de diluciones en serie estándar. (B) Paso 2: Preparación de Pr / Pb y NTC mezclas de acciones de trabajo. (C) Paso 3.1: Preparación de una las poblaciones de placa de 96 pocillos de trabajo de los conjuntos Pr / Pb y mezclas NTC. (D) Paso 4.1-3: Preparación de las mezclas para la carga de la placa de 384 pocillos de ensayo. (Estep 4.5: Carga de la placa de 384 pocillos de ensayo. Los diagramas se leen desde la parte superior izquierda a la esquina inferior derecha. Reactivos para el interferón (IFN) de ensayo se almacenan a -20 ° C y se enumeran en la columna de la izquierda; Líneas acciones separadas en el protocolo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: El patrón de expresión de IFN humano en células mononucleares de sangre periférica (PBMC) difiere en respuesta a los ligandos de TLR utiliza para la estimulación de PBMC se estimularon con ligandos de TLR y el ARN se recogió para el análisis de QRT-PCR.. Las medias geométricas de las respuestas de los picos a poli I: C (25 mg / ml) a las 8 hr (cuadrados rojos), LPS (10 ng / ml) a 4 hr (triángulos verdes), imiquimod (10 mM) en 16 hr ( diamantes de color púrpura), CpG (1 m) en16 hr (círculos negros), y el control no estimulado en 16 hr (círculos azules) de 6 donantes se muestran en la escala log 10 como una función de la expresión de la HKG UBC ΔCq (izquierda) o como número de copias por g de ARN (a la derecha) . Subtipos de IFN-α se ordenan de acuerdo a la trama filogenético de la secuencia de aminoácidos similitud. Esta cifra fue publicado originalmente en Inmunología y Biología Celular 27.

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Figura 5:. La firma rhesus Macaca IFN expresión en células mononucleares de sangre periférica (PBMC) difiere en respuesta a los ligandos de TLR utilizados para la estimulación de PBMC de tres macacos rhesus (designados por el cuadrado, diamante, y el triángulo) se aislaron a partir de sangre entera y estimulada con lipopolisacárido (LPS) (10 mg / ml), poli I: C (50 mg / ml) o imiquimod (10 mg / ml). Las células se recogieron a 0 hr (OPEn formas) o después de 3 horas de TLR estimulación (formas cerradas) para la medición de la expresión de IFN. Los niveles de transcripción de tipo I, II y III IFN se muestran en el registro de 10 escala en función de la expresión de la HKG GAPDH ΔCq (izquierda) o como copia de ARN número / g (derecha). Esta cifra fue publicado originalmente en la revista Journal of Interferon y citoquinas Investigación 28.

figure-results-6
Tabla 1:. IFN humano secuencias conjunto de cebadores / sondas y reacción información Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta tabla.

figure-results-7
Tabla 2:. Macacos Rhesus IFN secuencias conjunto de cebadores / sondas y reacción información Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta tabla.

Concentración de plásmido (FM)
La B C D
IFN-α1 25 2.5 0.25 0,025
IFN-α2 25 2.5 0.25 0,025
IFN-α4 2500 250 25 2.5
IFN-α5 25 2.5 0.25 0,025
IFN-α6 250 25 2.5 0.25
IFN-α7 250 25 2.5 0.25
IFN-α8 250 25 2.5 0.25
IFN-α10 25 2.5 0.25 0,025
IFN-α14 25 2.5 0.25 0,025
IFN-α16 250 25 2.5 0.25
IFN-α17 25 2.5 0.25 0,025
IFN-α21 25 2.5 0.25 0,025
IFN-λ1 25 2.5 0.25 0,025
IFN-λ2 25 2.5 0.25 0,025
IFN-λ3 250 25 2.5 0.25
IFN-β 25 2.5 0.25 0,025
IFN-ω 250 25 2.5 0.25

Tabla 3: conjunto dilución de la información estándar de concentración.

Conjuntos IFN Pr / Pb añaden El volumen de agua añadido (ml)
NTC 1 IFN-β, -ω, -λ3 85.7
NTC 2 IFN-α1, -α5 100.0
NTC 3 IFN-α2 114.3
NTC 4 IFN-α4 114.3
NTC 5 IFN-α7 114.3
NTC 6 IFN-α6, -α8, -α10 85.7
NTC 7 IFN-α14, -α16 100.0
NTC 8 IFN-α17 114.3
NTC 9 IFN-α21, -λ1 100.0
NTC 10 IFN-λ2 114.3

Tabla 4: NTC madre de trabajo se mezcla la información.

Discusión

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Este informe describe el diseño, la producción por lotes, y un enfoque hacia el análisis de un ensayo para medir la transcripción de un conjunto de genes muy similares en un laboratorio de investigación. El ensayo de alto rendimiento QRT-PCR informó aquí mide el IFN-y - subtipos λ con alta especificidad. Este método consiste en dos aspectos fundamentales, el diseño de conjuntos Pr / Pb que discriminan entre los miembros de una familia de genes homólogos y el desarrollo de una plataforma de producción para la creación de placas de ensayo de 384 pocillos fiables y coherentes precargados con los conjuntos Pr / Pb. Las sondas QRT-PCR incorporan una o química enfoque estructural (MB) (LNA) a mejorar su especificidad 29. Para dos de los conjuntos de cebadores en el ensayo de rhesus (Tabla 2), el sistema de mutación-amplificación refractaria (ARMS) fue incorporado en las secuencias de cebadores para mejorar aún más la especificidad 30. Aunque en general es mejor apuntar exón-exón cruces a ENHAna vez que la especificidad de una reacción QRT-PCR, esto no fue posible debido a que el IFN de tipo I genes carecen de intrones. Por lo tanto, el ADN genómico se amplifica en la reacción de PCR, y debe ser degradado por tratamiento con DNasa después de la extracción de ARN.

La región diana para los conjuntos de Pr / Pb se restringió a las regiones codificantes del péptido maduro para cada IFN. Debido a la alta similitud de secuencia entre los subtipos de IFN-α, en particular la región del péptido maduro, a veces era necesario comprometer la sensibilidad para garantizar la especificidad. Este fue especialmente el caso con IFN-α17, donde la transcripción péptido maduro tiene sólo cuatro bases únicas cuando se compara con los otros subtipos de IFN-α. Orientación de IFN-α17 cebadores que se unen las transcripciones de múltiples subtipos requiere, restringiendo especificidad a la sonda. Como consecuencia, la reacción de PCR amplificará subtipos distintos de IFN-α17, consumiendo de ese modo un porcentaje sustancial de los reactivos y loweri PCRng de la amplitud de la señal de fluorescencia de la sonda específica para IFN-α17. Un reto adicional hacia el diseño de conjuntos de Pr / Pb sensibles y específicos para los genes altamente similares, tales como el IFN es la posibilidad de que las secuencias anotado en la base de datos GenBank pueden no ser completa o completa en el momento del diseño. De nuevo, esto fue un reto para IFN-α17, en el que las secuencias recién anotado no se alinean perfectamente con la versión de la secuencia en la base de datos en el momento del diseño. Por lo tanto, al diseñar Pr / Pb establece para los genes que no han sido estudiados intensivamente, es aconsejable consultar periódicamente la última secuencia anotada de un gen diana. Finalmente, es necesario asegurarse de que los conjuntos de Pr / Pb no amplifican pseudogenes que pueden ser transcritas pero no traducidas.

Después de diseñar los decorados Pr / Pb, el siguiente reto es la optimización de las condiciones de la PCR de diecisiete diferentes Pr / Pb establece en una placa de 384 pocillos. Normas de transcripción son importante en la prueba de la especificidad de un conjunto Pr / Pb y convertido en esencial para la armonización de las condiciones de QRT-PCR de los numerosos y diferentes reacciones de PCR. Prueba de un conjunto Pr / Pb contra las normas de transcripción establece su eficiencia y sensibilidad; plásmidos que expresan pseudogenes muy similares pueden ser necesarias para asegurar que el Pr / Pb establecido mide selectivamente la transcripción del gen funcional. Las normas de transcripción también proporcionan un medio cuantitativo de análisis (número de transcripciones), además de los análisis semi-cuantitativo con respecto a un gen de mantenimiento (ΔCq).

Robotic pipeteo multicanal de una placa fuente de 96 pocillos en múltiples de 384 pocillos placas de ensayo mejora la precisión y consistencia de los resultados entre las placas. ADN de esperma de salmón (ssDNA) se utiliza como un portador que estabiliza y conserva los conjuntos de Pr / Pb para almacenamiento a largo plazo, al igual que el secado de los reactivos dispensados ​​en las placas. El secado de las placas también disminuye el volumen de la reacciónnecesario para obtener resultados reproducibles, que a su vez conserva muestras preciosas y disminuye el uso de reactivos costosos. A través de estos pasos, los lotes de placas se ensamblan que proporcionan precisión y consistencia durante más de seis meses.

Después de la preparación de placas, las medidas de control de calidad son fundamentales para comprobar la consistencia de un lote de placas. Para este propósito, otros cuatro conjuntos de normas se ejecutan en un plato. La placa "estándar 5x" seguimiento del rendimiento y crea un conjunto de datos a la que se comparan los estándares de una placa individual. Mientras diez diluciones de 10 veces de cada estándar se utilizan durante el diseño del ensayo, las consideraciones de espacio requieren que cuatro puntos se utilizan para la curva estándar en cada placa de ensayo, y para la placa estándar de 5x. Además, un control positivo debe ser incluida en cada placa para garantizar la validez de la placa.

Normalmente, se tarda 3-4 horas para preparar seis placas de ensayo de un Pr / Pb splaca ource; es factible para preparar doce placas en un solo día en un laboratorio de investigación. Dado que cada placa de ensayo subtipo humano IFN examina diecisiete conjuntos Pr / Pb y puede acomodar quince muestras experimentales, un día de montaje produce un lote de placas con la capacidad de generar hasta 3060 puntos de datos experimentales. Los datos en bruto de la plataforma QRT-PCR pueden ser procesados ​​y ensamblados mediante secuencias de comandos de programación en un software de hoja de cálculo para rellenar automáticamente una plantilla de análisis prediseñado. Este método minimiza manos en la entrada de datos, evitando así errores de copia y permite al investigador se centran en el análisis de datos en lugar de la recopilación de datos. Como se describe aquí, este ensayo de alto rendimiento QRT-PCR se puede aplicar para medir la expresión de los subtipos de interferón en las muestras de macaco rhesus y humano o se podría adaptar para utilizar para otras especies o conjuntos de genes homólogos. La flexibilidad de la disposición de la placa permite al usuario cambiar de cebador / sonda fija para adaptar los genes deinterés hacia un tipo de célula particular o sistema modelo. Este ensayo se puede aplicar para medir firmas de expresión de IFN en modelos de cultivo celular que estudian patógenos o en muestras de pacientes en el contexto de modelos de enfermedades para dilucidar los mecanismos de señalización implicadas en la respuesta inmune.

Divulgaciones

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VPM y RLR son coinventores de la tecnología para medir la expresión de los subtipos de IFN e IFN y obtener ingresos por regalías de ello. El resto de autores declaran no tener conflicto de intereses.

Agradecimientos

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Este trabajo fue apoyado por CBER / FDA-NIAID / NIH Interinstitucional Acuerdo YI-AI-6153-01, FDA / CBER fondos intramuros, y la Iniciativa de contramedidas médicas FDA. TCT, MNB, VPM, LMS, y KDK fueron apoyados por una cita para el Programa de Participación de Investigación en el Centro de Evaluación e Investigación Biológica administrado por el Instituto Oak Ridge para la Educación la Ciencia a través de un acuerdo interinstitucional entre los EE.UU. Departmen de Energía y los EE.UU. Administración de Alimentos y Drogas.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Tiras de tubo de PCR de 0,2 ml Eppendorf (Westbury, NY, EE. UU.)E0030 124 286
Pipeta electrónica ecualizadora 384 de 12 canales, 0,5-12,5 ulThermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, EE. UU.)14-387-139*Descontinuada
Pipeta electrónica ecualizadora 384 de 12 canales, 1-30 ulThermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, EE. UU.)14-387-137
Pipeta electrónica de 12 canales descontinuada, 5-250 ulThermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, EE. UU.)14-387-118*Descontinuado
Tubo de microcentrífuga de 2,0 ml, estérilCelltreat Scientific Products (Shirley, MA, EE. UU.)229446
Pipeta electrónica de 8 canales, 15-1250 ulThermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, EE. UU.)14-387-115desechables descontinuados
 VWR International (Radnor, PA, EE. UU.)89094-668 Depósitos de25 ml con 2 divisores
E-CentrifugeWealtec Corp. (Sparks, NV, EE. UU.)1090003
Eucariota 18S rRNA (18S)Applied Biosystems (Foster City, CA, EE. UU.)Hs99999901_s1Rhesus HKG Juego de cebador/sonda
Velocidad fija Mini vórticeThermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, EE. UU.)02-215-360
Sello de placa adhesiva permeable al gasThermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, EE. UU.)AB-0580Sello de placa desechable utilizado durante el proceso de preparación de placas 
Glicealdehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH)FBR (Silver Spring, MD, EE. UU.)Pedido personalizadoHKG humano, Juego de sonda/cebador
, Glicealdehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH)Applied Biosystems (Foster City, CA, EE. UU.)Rh02621745_g1Rhesus HKG Imprimador/juego de sonda
pipeta multicanal automatizada Hudson Solo Hudson Robotics (Springfield, NJ, EE. UU.)800200Modificado con un nido de enfriamiento de 384 pocillos
Plásmidos linealizados (genes IFN)Aldevron (Fargo, ND, EE. UU.)de pedido personalizado3000, 3580; utilizado para estándares de ensayo 
Inhibidores de LNAExiqon (Woburn, MA, EE. UU.)pedido personalizado500100
Sondas de LNASigma-Proligo (St. Louis, MO, EE. UU.)Pedido personalizadoNúmero de material VC00023
Puntas de pipeta filtradas por matriz, 12,5 ulThermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, EE. UU.)14-387-193
Puntas de pipeta filtradas por matriz, 30 ulThermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, EE. UU.)14-387-196
Puntas de pipeta de longitud extendida Matrix TallTip, 1,250 ulThermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, EE. UU.)14-387-160
Puntas de pipeta de longitud extendida Matrix TallTip, 250 ulThermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, EE. UU.)14-387-152
Placa de reacción óptica MicroAmp de 384 pocillos con código de barrasBiosystems aplicado (Foster City, CA, EE. UU.)4309849
Placa de reacción óptica MicroAmp de 96 pocillosApplied Biosystems (Foster City, CA, EE. UU.)N8010560
Película adhesiva óptica MicroAmpApplied Biosystems (Foster City, CA, EE. UU.)4311971Película adhesiva utilizada para sellar la placa antes de la ejecución de qRT-PCR 
Hoja de cálculo de Microsoft Excel 2010Microsoft (Redmond, WA, EE. UU.)  Office 2010Visual Basic 
Mezclador de vórtice MixMateEppendorf (Westbury, NY, EE. UU.)5353 000.014Aparato de vórtice de placa bidimensional
Sondas de baliza molecularFBR (Silver Spring, MD, EE. UU.)pedido
, sistema de almacenamiento en frío sin hielo para placas de 96 pocillos y tubos de PCREppendorf (Westbury, NY, EE. UU.)de placas Z606634-1EA
(colector)Fabricaciones de diseño mecánico y eléctrico, Oficina de Servicios de Investigación de los NIH (Bethesda, MD, EE. UU.)Pedido
Juegos de imprimaciónFBR (Silver Spring, MD, EE. UU.)Pedido
pUC57 plasmido DNAGenescript (Piscataway, NJ, EE. UU.)SD1176
Tubos de microfuga de 1,5 ml sin ARNasaLife Technologies (Grand Island, NY, EE. UU.)AM12400
DNasa sin ARNasa Set (50)Qiagen (Valencia, CA, USA)79254
RNase HNew England Biolabs (Ipswitch, MA, EE.UU.)M0297L
RNeasy Mini Kit (250)Qiagen (Valencia, CA, EE.UU.)74106
Robot Tips (puntas de pipeta preesterilizadas de punta transparente)Hudson Robotics (Springfield, NJ, EE.UU.)800350-S
Salmon Sperm DNA SolutionInvitrogen (Carlsbad, CA, EE. UU.)15632-011
SoftLinx Versión VHudson Robotics (Springfield, NJ, EE. UU.)pedido personalizadopara programar los pasos de pipeteo
TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (2x), sin AmpErase UNGLife Technologies (Grand Island, NY, EE. UU.)4352042
Sellos de placa adhesiva ABgene   Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, EE. UU.)AB0580
Ubiquitina C (UBC)Applied Biosystems (Foster City, CA, EE. UU.)Hs01871556_s1HKG humano Juego de cebadores/sondas
Kit de síntesis de ADNcVerso Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, EE. UU.)
ViiA 7 Sistema de PCR en tiempo realApplied Biosystems (Foster City, CA, EE. UU.)4453536
Water-Ultra PureQuality Biological, INC. (Gaithersburg, MD, EE. UU.) 351-029-101
Zipvap 384 (elemento calefactor del secador de placas)Glas-Col LLC (Terre Haute, IN, EE. UU.)384-109ASecador de placas
**Depósitos de reactivos , Artículo Artículo de Lenguaje de programación Enfriador de PCR de personalizado Secador personalizadopersonalizado Software de AB1453B

Referencias

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