Protocolos se describen para el estudio de la migración de células de cáncer de mama, la proliferación y la colonización en un sistema modelo de explante de tejido óseo humano.
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Artículo de método
Métodos de explantes de tejidos El cultivo fémur humano para el Estudio de la colonización de la célula del cáncer de pecho de la Niche metastásico
En este artículo
Resumen
Resumen
El hueso es el sitio más común de metástasis del cáncer de mama. Aunque es ampliamente aceptado que el comportamiento de las células del cáncer de influencias microambiente, poco se sabe acerca de las propiedades celulares de cáncer de mama y comportamientos dentro del microambiente natural de tejido óseo humano. Hemos desarrollado enfoques para realizar el seguimiento, cuantificar y modular las células de cáncer de mama humano en el microambiente de fragmentos humanas cultivadas de tejido óseo aisladas de cabezas femorales desechados después de cirugía de reemplazo total de cadera. El uso de células de cáncer de mama de ingeniería para la luciferasa y la proteína fluorescente (EGFP) expresión verde mejoradas, somos capaces de cuantificar de forma reproducible la migración y proliferación de patrones de uso de imágenes de bioluminiscencia (BLI), interacciones celulares pista dentro de los fragmentos de hueso mediante microscopía de fluorescencia, y evaluar las células del seno después la colonización con citometría de flujo. Las principales ventajas de este modelo son: 1) a, microE tejido arquitectónico intacto nativambiente que incluye tipos de células humanas pertinentes, y 2) el acceso directo al microambiente, lo que facilita cuantitativo rápido y monitoreo cualitativo y perturbación de mama y de células óseas propiedades, comportamientos e interacciones. Una limitación principal, en la actualidad, es la viabilidad finito de los fragmentos de tejido, lo que limita la ventana del estudio de cultivo a corto plazo. Aplicaciones del sistema de modelo incluyen el estudio de la biología básica del cáncer de mama y otros tumores malignos por el hueso dentro del nicho metastásico, y el desarrollo de estrategias terapéuticas para orientar eficazmente las células de cáncer de mama en los tejidos óseos.
Introducción
El microambiente tumoral es ampliamente reconocida como un determinante crítico de la conducta de células de cáncer durante la progresión del cáncer de mama metastásico y repartidas 1-3. El objetivo del método que aquí se presenta es la de facilitar el estudio de las células de cáncer de mama en el microambiente del tejido óseo humano, el sitio más frecuente de metástasis del cáncer de mama 4-6. El hueso se compone de compartimentos mineralizadas y médula ósea 7-9, ambos de los cuales albergan células y factores secretados implicados en la progresión metastásica 10,11. Aunque es ampliamente utilizado en modelos
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Protocolo
Cabezas femorales se obtuvieron de los pacientes sometidos a cirugía electiva THR en el Departamento de Cirugía Ortopédica en la Escuela de Medicina de la Universidad de Stanford. Todos los tejidos se recogieron como muestras sin identificación, de acuerdo con las regulaciones de la Oficina de Cumplimiento de Investigación de la Universidad de Stanford.
1. Selección de una línea (s) Celular del Cáncer de Mama
- Obtener o transfectar la línea celular de cáncer de mama deseado (s) con un reportero luciferase construir-GFP. Los siguientes experimentos se realizaron utilizando el MCF-7 de cáncer de mama líneas celulares de ingeniería para la expresión es....
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Resultados
El aislamiento de fragmentos de tejido de Cabezas femorales
Cabezas femorales se obtuvieron de igual número de hombres y mujeres (44 a 90 años de edad) sometidos a cirugía electiva de reemplazo total de cadera en el Departamento de Cirugía Ortopédica en la Escuela de Medicina de la Universidad de Stanford. Cada cabeza femoral desechado contiene una pequeña porción de la parte superior del fémur, que alberga el tejido óseo trabecular compuesto por espículas mineralizadas y ósea. Este tejido e.......
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Discusión
Mehra et al., Han descrito previamente la recogida y análisis de muestras de hueso postmortem de pacientes con cáncer de próstata metastásico cosechadas en el momento de la autopsia, que revela los tejidos de alta calidad y validar el uso de muestras de huesos humanos para estudiar el proceso metastásico 47. Aquí hemos descrito los protocolos de recolección, procesamiento y uso de fragmentos de tejidos óseos humanos obtenidos de cabezas femorales desechados después de la cirugía THR en un sistema de .......
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Divulgaciones
No hay divulgaciones que informar.
Agradecimientos
Fueron financiados Estos estudios, en parte, por subvenciones de la Fundación Alternativa de Investigación y Desarrollo (107.588), el Instituto Nacional de Salud (1U54CA136465-04S1), y el Programa de Investigación del Cáncer de Seno de California (201B-0141). Agradecemos a los Dres. Andrew Wilber y R. Scott McIvor por la generosa donación de su transponson y PK / hubiC-SB11 plásmidos transposasa. Agradecemos John Tamaresis, Ph.D. para el asesoramiento sobre métodos estadísticos, Timothy Brown para realizar citometría de flujo, Georgette Henrich consejo sobre ensayos migraciones, y Nancy Bellagamba para facilitar la recogida de muestras THR.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| DMEM (1X) + GlutaMAX-l | Life Technologies | 10569-010 | Complementa todos los DMEM con un 10% de suero fetal bovino y un 1% de Pen/Estreptococo |
| McCoy's 5A Medium (1X) | Life Technologies | 16600-082 | Complementa todos los McCoy's con un 10% de suero fetal bovino y un 1% |
| suero bovino fetal | Technologies | 16000-044 | |
| Penicillen Estreptomicina | Life Technologies | 15140-122 | |
| Blastocidina (10 mgl/ml) | InvivoGen | ant-bl | Medios complementarios utilizados para líneas celulares transfectadas. |
| Halcón® Insertos de cultivo celular para placa de 24 pocillos con membrana de PET transparente (8.0 μ | Corning Incorporated | 353097 | |
| Falcon® 24 Pozos Placa complementaria de inserción de cultivo celular de poliestireno tratado con TC | Corning Incorporated | 353504 | |
| VIVO/MUERTO Kit de Viabilidad/Citotoxicidad *para células de mamíferos* | Invitrogen Detection Technologies | L-3224 | |
| FluoroBrite DMEM | Life Technologies | A18967-01 | |
| D-luciferina luciérnaga, sal de potasio 5 g (30 mg/ml) | Life Technologies | L-8220 | |
| Colador de células estériles 70 μ m | Fisher Scientific | 22363548 | |
| 6 pocillos de cultivo celular tratado con TC | Corning Incorporated | 3516 | |
| 12 pocillos | Corning Incorporated | 3513 | |
| 24 pocillos TC Cluster de cultivo celular tratado con TC | Corning Incorporated | 3526 | |
| Friedman-Pearson Rongeur | Fine Science Tools | 16021-14 | |
| Cera ósea | Corporación de Especialidades Quirúrgicas | 903 | |
| IVIS 50 Plataforma de imágenes Caliper | Life Sciences/PerkinElmer | ||
| Living Image Software Program | Calibrador de Ciencias de la Vida/PerkinSistema | ||
| EVOS FL | Life Technologies | versión 4.2 | |
| OsteoSense 680 EX | PerkinElmer | NEV10020EX | |
| Células de cáncer de mama MCF-7 | ATCC | HTB-22 | |
| MDA-MB-231 células de cáncer de mama | ATCC | HTB-26 | |
| Ratón monoclonal anti-citoqueratina humana clon | de citomatación DAKO | (AE1/AE3) |
Referencias
- Place, A. E., Jin Huh, S., Polyak, K. The microenvironment in breast cancer progression: biology and implications for treatment. Breast Cancer Res. 13, 227(2011).
- Joyce, J. A., Pollard, J. W. Microenvironmental regulation of metastasis. Nat Rev Cancer. 9<....
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Reimpresiones y permisos
