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Artículo de método

Establecimiento de un modelo de xenoinjerto Humano mieloma múltiple en el pollo para estudiar el crecimiento del tumor, la invasión y la angiogénesis

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DOI:

10.3791/52665

1 de mayo de 2015

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Las células humanas de mieloma múltiple (MM) requieren el microambiente de apoyo de células mesenquimales y componentes de la matriz extracelular para la supervivencia y proliferación. Hemos establecido un modelo in vivo de embriones en pollo con células de mieloma y mesenquimales humanas injertadas para estudiar los efectos de fármacos contra el cáncer en el crecimiento tumoral, la invasión y la angiogénesis.

Resumen

El mieloma múltiple (MM), una enfermedad de las células plasmáticas malignas, sigue siendo incurable y nuevos fármacos son necesarios para mejorar el pronóstico de los pacientes. Debido a la falta del microambiente óseo y factores de crecimiento de auto / paracrina células MM humanos son difíciles de cultivar. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de establecer adecuado in vitro y en sistemas de cultivo in vivo para estudiar la acción de nuevas terapias en las células MM humanos. Aquí se presenta un modelo para crecer células de mieloma múltiple humanos en un entorno 3D complejo in vitro e in vivo. Líneas celulares de MM OPM-2 y RPMI-8226 fueron transfectadas para expresar el transgén GFP y se cultivaron en la presencia de células mesenquimales humanos y de colágeno de tipo I matriz como esferoides tridimensionales. Además, esferoides fueron injertados en la membrana corioalantoidea (CAM) de embriones de pollo y el crecimiento tumoral se controló por microscopía de fluorescencia estéreo. Ambos modelos permiten el estudio de la novela dru terapéuticags en un entorno 3D complejo y la cuantificación de la masa celular del tumor después de la homogeneización de los injertos en un GFP-ELISA-transgén específico. Por otra parte, las respuestas angiogénicas de la acogida y la invasión de células tumorales en el tejido huésped subyacente pueden ser monitoreados diariamente por un microscopio estéreo y se analizaron por tinción inmunohistoquímica frente a células tumorales humanas (Ki-67, CD138, vimentina) o células anfitrionas murales que cubren los vasos sanguíneos (desmina / ASMA).

En conclusión, el sistema onplant permite estudiar el crecimiento de células MM y la angiogénesis en un entorno 3D complejo y permite la detección de nuevos compuestos terapéuticos dirigidos a la supervivencia y proliferación de las células MM.

Introducción

El mieloma múltiple (MM) se caracteriza por la proliferación de células plasmáticas malignas en la médula ósea, lesiones óseas e inmunodeficiencia 1. Aunque existen nuevas opciones de tratamiento, como los inhibidores del proteasoma (bortezomib) y los fármacos inmunomoduladores (pomalidomida y lenalidomida), el MM sigue siendo una neoplasia maligna incurable con un pronóstico sombrío 2. El mal pronóstico podría explicarse por la extraordinaria heterogeneidad de los clones de células MM que contribuye a respuestas variables a la terapia, en particular bajo tratamiento a largo plazo y presión de selección de clones MM 3.

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Protocolo

De acuerdo con la ley austriaca, y la Oficina de Bienestar de los Animales de Laboratorio de los embriones de aves de servicios de salud pública de Estados Unidos no son considerados como animales vertebrados vivos hasta hatching.The Oficina de NIH de Laboratorio Bienestar Animal ha proporcionado orientación escrita en esta área (http: // www.grants.nih.gov/grants/olaw/references/ilar91.htm y NIH Publication No .: 06-4515).

1. Cultivo de células y transfección Lentiviral

  1. Líneas de cultivo de células MM OPM-2, RPMI-8226 y las células madre mesenquimatosas humanas de la médula ósea en medio RPMI 1640, suplementado con 10% de suero bovino fetal de ter....

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Resultados

El análisis in vitro de los compuestos de interés en los ensayos de esferoide mieloma múltiple 3D

Debido a la limitación de cultivo de células MM humanas primarias in vitro establecimos nuevos modelos de cultivo in vitro en 3D para líneas celulares de MM humanos que hacen uso de una matriz de crecimiento extracelular y células mesenquimales humanas primarias de apoyo de la médula ósea (Figura 1A, B). Líneas celulares de MM transgén.......

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Discusión

El desarrollo de nuevos agentes terapéuticos para refractario MM requiere menos tiempo y caros sistemas in vivo para evaluar la sensibilidad de las células MM humanos a las drogas. Hasta ahora, solamente pocos sistemas in vivo están disponibles para la evaluación preclínica de nuevas terapias anti-mieloma. Todos ellos tienen sus limitaciones para el cribado a gran escala de bibliotecas de compuestos 29.

Los mejores modelos actuales de las células MM humanos son altamente ratones inmunodeficientes.......

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Divulgaciones

Los autores no tienen intereses financieros en competencia

Agradecimientos

Los autores quieren agradecer a la Sra. Cornelia Heis por su excelente asistencia técnica en inmunohistoquímica y preparación de embriones de pollo. Este trabajo ha contado con el apoyo del Fondo Austriaco para la Ciencia (subvención FWF n.º P19552) y de la Unión Europea (proyecto FP7 de la UE Optatio n.º 278570).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Células RPMI-8226 CélulasDSMZACC 9STR perfiladas
OPM-2 célulasDSMZACC 50STR perfiladas
Células madre mesenquimales humanas PromoCellPC-C-12974
HEK293FT células InvitrogenR700-07
RPMI1640 MedioSigma AldrichR0883
Suero Fetal Bovino  HyCloneThermoScientificSH30070.03
L-Glut- Pen- Solución de estreptococosSigmaG6784
DMEM MedioGibco31966
NEAASigma Life SciencesM7145
Medio de transfección/Opti-MEM Gibco51985
eGFP partículas lentiviralesGeneCopoeiaLPP-EGFP-LV105Partículas virales listas para usar
pLenti6/V5Dest6 eGFP vectorInvitrogenPN 35-1271de los autores
ViralpowerTM mezcla de embalaje InvitrogenN/P 35-1275
Reactivo de transfección/ Lipofectamin 2000Invitrogen11668-027
BlasticidinInvitrogenR210-01
NeomycinBiochromA2912
Colágeno-Tipo1  Cola de rataBD Biosciences354236
polvo DMEMLife TechnologiesArt.Nr. 10338582
plitidepsinaPharmamar
bortezomibLKT Lab., Inc.B5871
Huevos de gallina blancos SPFCharles RiverFertilizado  Leghorn blanco  huevos de gallina
Barcos de pesaje de plásticoneoLabArt.Nr. 1-1125para cultivo ex ovo
Placa de Petridish cuadrada (Tapas)SimportD210-16para cultivo ex ovo
Tampón RIPA (10x)Señalización celular#9806
Proteasa Comprimidos inhibidores Roche11 836 170 001
Mini Completo sin EDTA
GFP ELISACell Biolabs, Inc.AKR-121
Histocette IISimportM493-6
PFA  37%Roth7398.1
DPBSLonzaBE17-512F
Etanol absolutNormapur20,821,321
Roti-HistolRothArt.Nr.6640.4
ParaplastSigmaA6330
Portaobjetos de microscopio SuperFrostR. Langenbrinck Art.-Nr.
Labor- u. Medizintechnik03-0060
DakoCytomation Wash Buffer 10xDakoCytomationCode-Nr.
S 3006
Solución de recuperación de objetivos (10x)  pH 6,1Código DAKONr.
S 1699
H2O2Merck
m-a-hu ASMA clon 1A4DAKOM0851
m-a-hu CD138 clon MI15DAKOM7228
m-a-hu Vimentin clon V9DAKOM0725
m-a-hu clon Desmin D33DAKO  M0760
m-a-hu Ki67  clon MIB-1   DAKO  M7240
cabra biotinilada- anti-ratón Vector LaboratoriesInc.BA-9200
Vectastain Elite ABC KitLaboratorios Vector Inc.# PK-6100
Juego de tabletas FAST DAB.Sigma Biochemicals# D4293
Mayer' s haemalaun solutionMerck1.092.490.500
Roti HistokittRothArt.Nr.6638.2
Microtomo rotativo de sobremesaThermo Electron, Shandon Finesse ME+
Estación de inclusión de tejidosLeica, TP1020
Incubadora de huevosGrumbach BSS160
Microscopio estereoscópico de fluorescencia equipado con una cámara digital conectada con una cámara digital (Olympus E410) y luz fría flexible Olympus, SZX10
Ultra Turrax HomogeneizadorIKA T10

Referencias

  1. Kuehl, W. M., Bergsagel, P. L. Multiple myeloma: evolving genetic events and host interactions. Nat.Rev.Cancer. 2 (3), 175-187 (2002).
  2. Kumar, S. K., Gertz, M. A. Risk adapted therapy for multiple myeloma: back to basics. Leuk.Lymphoma. , (2014).
  3. Prideaux, S. M., Conwa....

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Etiquetas

Modelo de embri n de polloan lisis del crecimiento tumoralmedici n de la expresi n de GFPinjerto en la membrana corioalantoideamicroscop a de fluorescencia estereosc picatinci n inmunohistoqu micacuantificaci n por GFP ELISAc lulas mesenquimales humanasmatriz de col geno tipo I