Las células humanas de mieloma múltiple (MM) requieren el microambiente de apoyo de células mesenquimales y componentes de la matriz extracelular para la supervivencia y proliferación. Hemos establecido un modelo in vivo de embriones en pollo con células de mieloma y mesenquimales humanas injertadas para estudiar los efectos de fármacos contra el cáncer en el crecimiento tumoral, la invasión y la angiogénesis.
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Artículo de método
Establecimiento de un modelo de xenoinjerto Humano mieloma múltiple en el pollo para estudiar el crecimiento del tumor, la invasión y la angiogénesis
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Resumen
Resumen
El mieloma múltiple (MM), una enfermedad de las células plasmáticas malignas, sigue siendo incurable y nuevos fármacos son necesarios para mejorar el pronóstico de los pacientes. Debido a la falta del microambiente óseo y factores de crecimiento de auto / paracrina células MM humanos son difíciles de cultivar. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de establecer adecuado in vitro y en sistemas de cultivo in vivo para estudiar la acción de nuevas terapias en las células MM humanos. Aquí se presenta un modelo para crecer células de mieloma múltiple humanos en un entorno 3D complejo in vitro e in vivo. Líneas celulares de MM OPM-2 y RPMI-8226 fueron transfectadas para expresar el transgén GFP y se cultivaron en la presencia de células mesenquimales humanos y de colágeno de tipo I matriz como esferoides tridimensionales. Además, esferoides fueron injertados en la membrana corioalantoidea (CAM) de embriones de pollo y el crecimiento tumoral se controló por microscopía de fluorescencia estéreo. Ambos modelos permiten el estudio de la novela dru terapéuticags en un entorno 3D complejo y la cuantificación de la masa celular del tumor después de la homogeneización de los injertos en un GFP-ELISA-transgén específico. Por otra parte, las respuestas angiogénicas de la acogida y la invasión de células tumorales en el tejido huésped subyacente pueden ser monitoreados diariamente por un microscopio estéreo y se analizaron por tinción inmunohistoquímica frente a células tumorales humanas (Ki-67, CD138, vimentina) o células anfitrionas murales que cubren los vasos sanguíneos (desmina / ASMA).
En conclusión, el sistema onplant permite estudiar el crecimiento de células MM y la angiogénesis en un entorno 3D complejo y permite la detección de nuevos compuestos terapéuticos dirigidos a la supervivencia y proliferación de las células MM.
Introducción
El mieloma múltiple (MM) se caracteriza por la proliferación de células plasmáticas malignas en la médula ósea, lesiones óseas e inmunodeficiencia 1. Aunque existen nuevas opciones de tratamiento, como los inhibidores del proteasoma (bortezomib) y los fármacos inmunomoduladores (pomalidomida y lenalidomida), el MM sigue siendo una neoplasia maligna incurable con un pronóstico sombrío 2. El mal pronóstico podría explicarse por la extraordinaria heterogeneidad de los clones de células MM que contribuye a respuestas variables a la terapia, en particular bajo tratamiento a largo plazo y presión de selección de clones MM 3.
Las pruebas preclínicas de nuevos fármacos y sus combinaciones in vitro e in vivo son un paso crítico y que requiere mucho tiempo para el desarrollo futuro de fármacos. Por lo tanto, se requieren modelos in vivo útiles de MM para obtener una mejor comprensión de la biología de la enfermedad y permitir el descubrimiento de nuevos fármacos. De hecho, los mejores modelos de xenotrasplante para neoplasias hematológicas y terapéuticas son los ratones inmunodeficientes, como los ratones inmunodeficientes combinados graves (SCID) 4-7, los ratones diabéticos/SCID (NOD/SCID) no obesos 8,9 o los ratones NOD/SCID con β microglobulina knockout 10,11.
Aunque los modelos murinos de MM humano en algunos aspectos pueden parecerse al fenotipo de la enfermedad humana, los ratones inmunodeficientes son endogámicos, por lo tanto, simulan solo una respuesta individual a un medicamento y los costos son muy altos. Debido a la inmunosupresión, los animales requieren condiciones especiales de mantenimiento y el injerto de MM humano en ratones requiere de 6 semanas a 2 meses 9,12, a menos que las células se injerten directamente en la médula ósea mediante un procedimiento técnicamente exigente con menores tasas de supervivencia animal 7,13. Por lo tanto, se han establecido nuevos métodos que utilizan modelos de organoides basados en células madre 14, ingeniería de tejidos 15 o modelos sofisticados de cultivo celular en 3D 16. Competirán en un futuro próximo con los experimentos clásicos con animales para las pruebas preclínicas de fármacos, pero no pueden sustituir a las pruebas de toxicidad sistémica en organismos vivos.
El embrión de pollo ha demostrado antes ser un organismo adecuado para el xenotrasplante de células y tejidos humanos debido a la falta de respuesta inmune adaptativa hasta la eclosión 17-19. Además, cada embrión de pollo refleja una reacción individual a los medicamentos aplicados o a las células tumorales debido a la diversidad genética dentro de la población de pollos. La membrana corioalantoidea (MCA) es un sistema consolidado para el estudio de la angiogénesis tumoral dependiente 20-22. Cuando los tumores sólidos se injertan en la CAM, muestran muchas características de los cánceres in vivo, incluyendo proliferación, invasión, angiogénesis y metástasis 23-27.
Sobre la base de la experiencia previa de nuestro grupo con modelos de xenoinjertos CAM20,26,27, se estableció un modelo MM humano que combina la ventaja de un sistema de cultivo 3D humano con el modelo de embriones de pollo en desarrollo ex ovo. Este sistema de modelo MM permite el seguimiento en tiempo real de la progresión del crecimiento de MM, la cuantificación de la masa celular y las pruebas preclínicas de fármacos.
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Protocolo
De acuerdo con la ley austriaca, y la Oficina de Bienestar de los Animales de Laboratorio de los embriones de aves de servicios de salud pública de Estados Unidos no son considerados como animales vertebrados vivos hasta hatching.The Oficina de NIH de Laboratorio Bienestar Animal ha proporcionado orientación escrita en esta área (http: // www.grants.nih.gov/grants/olaw/references/ilar91.htm y NIH Publication No .: 06-4515).
1. Cultivo de células y transfección Lentiviral
- Líneas de cultivo de células MM OPM-2, RPMI-8226 y las células madre mesenquimatosas humanas de la médula ósea en medio RPMI 1640, suplementado con 10% de suero bovino fetal de ternera y 100 IU / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina y glutamina 2 mM en presencia de 5% de CO 2 a 37 ° C.
- Transfectar 5 x 10 6 células HEK 293FT con la mezcla viral empaquetamiento del ADN (9 g) y 3 g pLenti6 / V5 dest eGFP vector por el uso de 30 l de reactivo de transfección liposomal y medio de transfección (10 ml). Retire medio de transfección después de 12 h, yañadir 10 ml de medio DMEM con 10% de suero bovino de ternera y 1% de aminoácidos no esenciales (NEAA).
- Después de 5 días, recoger los sobrenadantes de células HEK293FT después de la centrifugación de las células de natación (1.000 xg, 5min). Determinar el título viral por PCR en tiempo real como se describe en otra parte 28.
- Transfectar 1 x 10 6 células MM con partículas lentivirales eGFP (1 x 10 5 partículas) en una placa de 24 pocillos en medio de crecimiento completo. Después de 3 días, iniciar el proceso de selección mediante la adición de 2 mg / ml blasticidina al medio de cultivo. Para el eGFP lentivirus comercialmente disponible, utilizar 500 mg / ml de neomicina.
- Después de 2 semanas de selección, aparecerá racimos de células que expresan eGFP MM; recoger las células por centrifugación (1.000 xg, 5 min) y expandirlos como OPM-2 eGFP y RPMI-8226 sublíneas eGFP para experimentos (sección 2 y 3).
2. 3D-múltiple Modelo mieloma esferoide
- Solución de colágeno tipo I y Chill 10 x DMEM on hielo.
- Mezclar 1/10 de volumen de 10 x medio DMEM en matriz de colágeno; añadir NaOH (0,2 N) para neutralizar la solución ácida de colágeno a un valor de pH de 7,4; colágeno tienda / solución del medio en el hielo.
- Mezclar líneas celulares MM transgénicos (OPM-2 eGFP o RPMI-8226 eGFP; 250,000 por esferoide,) con las células humanas mesenquimales (50.000 células / esferoide, es decir, 30 l de caída).
- Mezcla de células centrífuga en tubos de 15 ml (1.000 xg, 5min), agregar la mezcla de colágeno preparada fría (1 ml) al sedimento celular y mezclar bien (con 1.000 l punta).
- Inmediatamente pipetear 30 l de la mezcla de colágeno / célula (con 100 l punta) en una placa de 24 pocillos en la película de parafina estéril y permitir que la mezcla de célula / colágeno para polimerizar durante 30 min a 37 ° C (véase la Figura 1A).
- Esferoides MM de superposición con 1 ml de medio de cultivo que contiene 1, 10 y 100 nM bortezomib (ver Figura 1B).
- Después de 72 h de incubación a 37 ° C, documento esferoides porestereomicroscopía de fluorescencia (véase la Figura 1C).
- Transferir cada esferoide por el uso de fórceps con mordazas planas anchas en un tubo de reacción para la medición de GFP (véase la Figura 1D).
3. 3D mieloma múltiple modelo de xenoinjerto en la CAM
- Incubar huevos de gallina en una incubadora especial para huevos de aves a 37 ° C y 70% de humedad durante tres días.
- A partir de entonces, los huevos abiertos y embriones de transferencia para esterilizar con barcos de etanol, cuadrada, de 10 cm de plástico con un peso con placa de cultivo celular de tapa e incubar "ex ovo" para los otros seis días, por lo que la CAM es capaz de desarrollar (ver Figura 2 A).
- Solución I-colágeno tipo Chill y 10 x DMEM en hielo, se mezclan un décimo de volumen de 10 x medio DMEM en matriz de colágeno, Añadir NaOH (0,2 N) para neutralizar la solución ácida de colágeno a un valor de pH de 7,4; colágeno tienda / solución del medio en el hielo.
- Mezclar líneas celulares MM transgénico (OPM-2 eGFP oRPMI-8226 eGFP; 250.000 por esferoide,) con células mesenquimales humanas (50.000 células / esferoide).
- Centrifugar las células en tubos de 15 ml (1.000 xg, 5 minutos; para cada compuesto de ensayo 1 vial), añadir 1 ml de mezcla de colágeno preparada frío con el fármaco (a una concentración de trabajo deseada) al sedimento celular y mezclar bien (con 1.000 l punta).
- Coloque colágeno gotas (30 l cada uno) sobre Parafilm en un 6 así paté durante 30 min para permitir la polimerización de la matriz extracelular a 37 ° C.
- Transferencia "onplants" desde el paso 3.6 con el uso de fórceps a la superficie sin tratar de la CAM (2 cm del embrión) de embriones de pollo de 9 días de edad (4 onplants para cada embrión de pollo, vea la Figura 2B)
- Después de 5 días de crecimiento in vivo en una incubadora de huevos a 37 ° C y 70% de humedad, documento xenoinjertos por estereomicroscopía de fluorescencia (véase la Figura 2C). La eutanasia a los embriones de pollo por hipotermia a 4 ° C en la nevera durante 5 h.
- Retire xenoinjertos con tejido CAM subyacente por una tijera oftálmica y pinzas con mandíbulas planas anchas. Úsalos para la medición de las buenas prácticas agrarias (artículo 4, ver Figura 2D) o para el análisis inmunohistoquímico de los vasos sanguíneos y / o las células tumorales invasoras (sección 5).
4. Cuantificación de eGFP de proteínas por ELISA
- Transferir cada esferoide MM o xenoinjerto extirpado en 0,5 ml RIPA tampón que contenía inhibidores de la proteasa / ml 200 g.
- Homogeneizar esferoide / xenoinjerto con un homogeneizador de tejidos en el hielo.
- Haz tres de congelación / descongelación ciclos en nitrógeno líquido y 37 ° C baño de agua.
- Centrifugar homogeneizado a 4 ° C durante 20 min (12000 g) y almacenar sobrenadantes.
- Diluir las muestras 1:20 en tampón de ensayo (200 l) del kit de ELISA. Mida GFP-niveles por una GFP comercial ELISA Kit utilizando anticuerpos anti-GFP biotinilados, de acuerdo con el protocolo del fabricante.
5. ImmunohiAnálisis stochemical de los vasos sanguíneos y las células tumorales invasoras
- Fijar xenoinjertos extirpados con área CAM en el 4% paraformaldehido O / N a 4 ° C.
- Coloque xenoinjertos fijos en cassettes de inclusión y transferirlos a una estación de incrustación de tejido con una serie graduada de alcohol creciente (50%, 70%, 80%, 95% de etanol, xilol y parafina; cada paso 60 min).
- Sección xenoinjertos (5 M) por el uso de un micrótomo rotatorio banco de trabajo. Hornee secciones de parafina sobre portaobjetos de vidrio O / N a 56 ° C.
- Desparafinar secciones por una serie graduada de alcohol bajando a agua bidestilada (xilol, 95%, 80%, 70%, etanol al 50%, agua bidestilada; cada paso 10 min).
- Realizar la recuperación de antígenos en un baño de agua (95 ° C, 20 min) con una solución de recuperación de antígeno (tampón citrate-; pH 7,0; volumen de 100 l).
- Bloquear la actividad peroxidasa endógena con 100 l 3% H 2 O 2 / metanol durante 30 min.
- Secciones de bloque en PBS que contenía10% de suero de ternero fetal durante 45 min (volumen 100 l).
- La mancha durante 1 hora con 100 l de anticuerpo primario (1μg / ml) diluido en PBS que contenía 1% de suero de ternera fetal a TA.
- Después de lavar 3 veces en PBS, se incuban durante 1 hora con el anticuerpo secundario biotinilado (0,1 mg / ml) en PBS que contenía 1% de suero de ternera fetal a TA.
- Después de lavar 3 veces en PBS realizar la reacción de color por la solución de avidina / (DAB) de sustrato-biotina (ABC) y la diaminobencidina de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- 5.11. Detener la reacción mediante la transferencia de secciones al agua bidestilada, contratinción con hematoxilina y montaje de las secciones con un medio de montaje sintético.
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Resultados
El análisis in vitro de los compuestos de interés en los ensayos de esferoide mieloma múltiple 3D
Debido a la limitación de cultivo de células MM humanas primarias in vitro establecimos nuevos modelos de cultivo in vitro en 3D para líneas celulares de MM humanos que hacen uso de una matriz de crecimiento extracelular y células mesenquimales humanas primarias de apoyo de la médula ósea (Figura 1A, B). Líneas celulares de MM transgén...
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Discusión
El desarrollo de nuevos agentes terapéuticos para refractario MM requiere menos tiempo y caros sistemas in vivo para evaluar la sensibilidad de las células MM humanos a las drogas. Hasta ahora, solamente pocos sistemas in vivo están disponibles para la evaluación preclínica de nuevas terapias anti-mieloma. Todos ellos tienen sus limitaciones para el cribado a gran escala de bibliotecas de compuestos 29.
Los mejores modelos actuales de las células MM humanos son altamente ratones inmunodeficientes...
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Divulgaciones
Los autores no tienen intereses financieros en competencia
Agradecimientos
Los autores quieren agradecer a la Sra. Cornelia Heis por su excelente asistencia técnica en inmunohistoquímica y preparación de embriones de pollo. Este trabajo ha contado con el apoyo del Fondo Austriaco para la Ciencia (subvención FWF n.º P19552) y de la Unión Europea (proyecto FP7 de la UE Optatio n.º 278570).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Células RPMI-8226 Células | DSMZ | ACC 9 | STR perfiladas |
| OPM-2 células | DSMZ | ACC 50 | STR perfiladas |
| Células madre mesenquimales humanas | PromoCell | PC-C-12974 | |
| HEK293FT células | Invitrogen | R700-07 | |
| RPMI1640 Medio | Sigma Aldrich | R0883 | |
| Suero Fetal Bovino HyClone | ThermoScientific | SH30070.03 | |
| L-Glut- Pen- Solución de estreptococos | Sigma | G6784 | |
| DMEM Medio | Gibco | 31966 | |
| NEAA | Sigma Life Sciences | M7145 | |
| Medio de transfección/Opti-MEM | Gibco | 51985 | |
| eGFP partículas lentivirales | GeneCopoeia | LPP-EGFP-LV105 | Partículas virales listas para usar |
| pLenti6/V5Dest6 eGFP vector | Invitrogen | PN 35-1271 | de los autores |
| ViralpowerTM mezcla de embalaje | Invitrogen | N/P 35-1275 | |
| Reactivo de transfección/ Lipofectamin 2000 | Invitrogen | 11668-027 | |
| Blasticidin | Invitrogen | R210-01 | |
| Neomycin | Biochrom | A2912 | |
| Colágeno-Tipo1 Cola de rata | BD Biosciences | 354236 | |
| polvo DMEM | Life Technologies | Art.Nr. 10338582 | |
| plitidepsina | Pharmamar | ||
| bortezomib | LKT Lab., Inc. | B5871 | |
| Huevos de gallina blancos SPF | Charles River | Fertilizado Leghorn blanco huevos de gallina | |
| Barcos de pesaje de plástico | neoLab | Art.Nr. 1-1125 | para cultivo ex ovo |
| Placa de Petridish cuadrada (Tapas) | Simport | D210-16 | para cultivo ex ovo |
| Tampón RIPA (10x) | Señalización celular | #9806 | |
| Proteasa Comprimidos inhibidores Roche | 11 836 170 001 | ||
| Mini Completo sin EDTA | |||
| GFP ELISA | Cell Biolabs, Inc. | AKR-121 | |
| Histocette II | Simport | M493-6 | |
| PFA 37% | Roth | 7398.1 | |
| DPBS | Lonza | BE17-512F | |
| Etanol absolut | Normapur | 20,821,321 | |
| Roti-Histol | Roth | Art.Nr.6640.4 | |
| Paraplast | Sigma | A6330 | |
| Portaobjetos de microscopio SuperFrost | R. Langenbrinck | Art.-Nr. | |
| Labor- u. Medizintechnik | 03-0060 | ||
| DakoCytomation Wash Buffer 10x | DakoCytomation | Code-Nr. | |
| S 3006 | |||
| Solución de recuperación de objetivos (10x) pH 6,1 | Código DAKO | Nr. | |
| S 1699 | |||
| H2O2 | Merck | ||
| m-a-hu ASMA clon 1A4 | DAKO | M0851 | |
| m-a-hu CD138 clon MI15 | DAKO | M7228 | |
| m-a-hu Vimentin clon V9 | DAKO | M0725 | |
| m-a-hu clon Desmin D33 | DAKO | M0760 | |
| m-a-hu Ki67 clon MIB-1 | DAKO | M7240 | |
| cabra biotinilada- anti-ratón Vector Laboratories | Inc. | BA-9200 | |
| Vectastain Elite ABC Kit | Laboratorios Vector Inc. | # PK-6100 | |
| Juego de tabletas FAST DAB. | Sigma Biochemicals | # D4293 | |
| Mayer' s haemalaun solution | Merck | 1.092.490.500 | |
| Roti Histokitt | Roth | Art.Nr.6638.2 | |
| Microtomo rotativo de sobremesa | Thermo Electron, Shandon Finesse ME+ | ||
| Estación de inclusión de tejidos | Leica, TP1020 | ||
| Incubadora de huevos | Grumbach | BSS160 | |
| Microscopio estereoscópico de fluorescencia equipado con una cámara digital conectada con una cámara digital (Olympus E410) y luz fría flexible | Olympus, SZX10 | ||
| Ultra Turrax | Homogeneizador | IKA T10 |
Referencias
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Reimpresiones y permisos
