El objetivo de este protocolo es la detección del marcador de la oxidación del ADN, 8-oxo-7,8-dihidro-2 'desoxiguanosina (8-oxo-dGuo) por HPLC-ED, en el ADN de células cultivadas o tejidos animales.
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Artículo de método
HPLC Medición de la oxidación del ADN de biomarcadores, 8-oxo-7,8-dihidro-2 'desoxiguanosina, en células cultivadas y tejidos animales
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Resumen
Resumen
El estrés oxidativo está asociado con muchos procesos fisiológicos y patológicos, así como el metabolismo de xenobióticos, que conduce a la oxidación de biomacromoléculas, incluyendo ADN. Por lo tanto, la detección eficiente de la oxidación del ADN es importante para una variedad de disciplinas de investigación, incluyendo la medicina y toxicología. Un biomarcador común de ADN oxidativamente dañado es 8-oxo-7,8-dihidro-2 'desoxiguanosina (8-oxo-dGuo; a menudo denominado erróneamente como 8-hidroxi-2' desoxiguanosina (8-OH-dGuo o 8 oxo-DG)). Se han descrito varios protocolos para la medición de 8-oxo-dGuo por cromatografía líquida de alta presión con detección electroquímica (HPLC-ED). Sin embargo, éstos se aplicaron principalmente a ADN purificado tratado con pro-oxidantes. Además, debido a las diferencias metodológicas entre los laboratorios, debido principalmente a las diferencias en equipo analítico, la adopción de métodos publicados para la detección de 8-oxo-dGuo por HPLC-ED requiere la optimización cuidadosa de cada laboratorio. LAprotocolo integral, que describe un procedimiento de este tipo de optimización, es insuficiente. Aquí, un protocolo detallado se describe para la detección de 8-oxo-dGuo por HPLC-ED, en el ADN de células cultivadas o tejidos animales. Se ilustra cómo la preparación de muestras de ADN se puede optimizar fácilmente y rápidamente para minimizar la oxidación indeseable de ADN que puede ocurrir durante la preparación de la muestra. Este protocolo muestra cómo detectar 8-oxo-dGuo en células cultivadas humanos adenocarcinoma alveolar (es decir, células A549) tratados con el agente oxidante KBrO 3, y del bazo de ratones expuestos a la dibenzo hidrocarburo aromático policíclico (def, p) criseno (DBC, antes conocido como dibenzo (a, l) pireno, DALP). En general, este trabajo ilustra cómo una metodología HPLC-ED se puede optimizar fácilmente para la detección de 8-oxo-dGuo en muestras biológicas.
Introducción
Especies reactivas del oxígeno (ROS), cuyos niveles de estado estacionario puede aumentar durante muchas condiciones patológicas y el metabolismo xenotoxic, contribuyen a una mayor frecuencia de daño oxidativo del ADN. Entre varios productos de oxidación posibles nucleobases, daño oxidativo del ADN fácilmente se puede medir usando el marcador estable 8-oxo-7,8-dihidro-2 'desoxiguanosina (8-oxo-dGuo), que es una de las formas oxidadas de 2' -deoxyguanosine (dGuo) 1. 8-oxo-dGuo es el más abundante lesión del ADN 2 y, por lo tanto, ha sido estudiado para mayor detalle como un biomarcador oxidación del ADN a pesar de la existencia de product....
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Protocolo
Asegúrese de que todo la ganadería, la vivienda, la manipulación y la experimentación se adhieran a las normas y regulaciones locales y que los protocolos de experimentación se aprobó antes de comenzar cualquier estudio. Para los experimentos descritos, cuidado de los animales, el manejo y el tratamiento fueron aprobados por el Comité de Cuidado Animal Health Canada. Consulte la "Tabla de Reactivos" para obtener información de los proveedores.
1. Recolección de muestras biológicas
- Las células o tejidos de animales
- Crecer células A549 adenocarcinoma alveolares humanos en medios F12-K que contenía suero bovino fetal al 1....
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Resultados
dGuo fue observado para tener un tiempo de retención de 4,7 min mientras que 8-oxo-dGuo tenía un tiempo de retención de aproximadamente 6,4 min (Figura 2A y B). Hay una diferencia sobre 1.000 veces en las alturas de los picos entre los dos analitos, como se ve en la Figura 2C. Voltamogramas para 8-oxo-dGuo y dGuo se obtuvieron por las normas de funcionamiento a un potencial de trabajo en el intervalo de 0,2 a 1,1 V. El potencial de trabajo óptimo para 8-oxo-dGuo se dete.......
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Discusión
Aunque 8-oxo-dGuo ha sido reportado como un biomarcador útil de la oxidación del ADN, su cuantificación fiable puede suponer un reto. Aunque existen varios métodos publicados, hay una necesidad de una visión global, descriptivo de protocolo para permitir a los investigadores a implementar el método en sus laboratorios. Aquí presentamos un resumen detallado de un protocolo basado en HPLC que permita a los nuevos usuarios para establecer un método eficaz para la detección y cuantificación de 8-oxo-dGuo.
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Divulgaciones
No se declara ningún conflicto de intereses o intereses financieros contrapuestos.
Agradecimientos
Esta investigación fue financiada por la Iniciativa de Salud de Canadá Genómica Investigación y Desarrollo (GRDI) y la Estrategia de Regulación Canadiense de Biotecnología (letras CRSB). Los autores no tienen ningún conflicto de intereses.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 8-oxo-dGuo estándar | Cayman Chemical Company | 89320 | Referido inapropiadamente como "8-hidroxi-2'-desoxi guanosina"; ver Fig. 1 y texto para más detalles. |
| Fosfatasa alcalina | Sigma-Aldrich | P5931 | De E. coli |
| Chelex 100 | Sigma-Aldrich | C7901 | Quelatos de metales pesados |
| Mesilato de desferoxamina | Sigma-Aldrich | D9533 | |
| dGuo estándar | Sigma-Aldrich | D7145 | |
| Fosfato sódico dibásico | Sigma-Aldrich | S9390 | |
| ADN de esperma de salmón | Sigma-Aldrich | D1626 | Sal de sodio |
| DNasa I | Sigma-Aldrich | D4527 | TipoII, de páncreas bovino |
| DNAzol | Invitrogen | 10503-27 | |
| Ácido etilendiaminotetraacético sal disódica disódica dihidratada (EDTA) | Sigma-Aldrich | E4884 | El compuesto no se disolvería completamente hasta que el pH de la solución se ajustara a 8.0 (p. ej. con NaOH) |
| F12-K | medios ATCC | 30-2004 | |
| Suero fetal bovino | ATCC | 30-2020 | |
| Columna de protección | Especialidades cromatográficas | YBA 99S03 0204GC | Protege el colum de la contaminación; también puede provocar acumulación de presión |
| Cloruro de magnesio | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Fosfato | sódico monobásicoSigma-Aldrich | S9638 | |
| Penicilina-Estreptomicina | Invitrogen | 15140-122 | |
| Solución salina tamponada con fosfato | Invitrogen | 15190-250 | |
| Enzima fosfodiesterasa I | Sigma-Aldrich | P3243 | Tipo II de veneno de Crotalus adamaneus |
| Homogeneizador de teflón | Thomas Scientific | 7724T-1 o 7724T-5 para 1 o 5 mL, respectivamente | El volumen (capacidad de retención) depende de la cantidad de muestra a procesar. |
| Tripsina | Invitrogen | 15050-065 | |
| Columna YMC-BASIC con sílice esférica adherida | Especialidades cromatográficas | YBA 99S03 1546WT |
Referencias
- Helbock, H. J., Beckman, K. B., Shigenaga, M. K., Walter, P. B., Woodall, A. A., Yeo, H. C., Ames, B. N. DNA oxidation matters: The HPLC-electrochemical assay of 8-oxo-deoxyguianosine and 8-oxo-guanine. Proc. Natl. Acad. Sci. 95 (1), 288-293 (1998).
- Valavanidis, A., Vlachogianni, T., Fiotakis, C.
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Reimpresiones y permisos
