Summary
El objetivo de este protocolo es la detección del marcador de la oxidación del ADN, 8-oxo-7,8-dihidro-2 'desoxiguanosina (8-oxo-dGuo) por HPLC-ED, en el ADN de células cultivadas o tejidos animales.
Abstract
El estrés oxidativo está asociado con muchos procesos fisiológicos y patológicos, así como el metabolismo de xenobióticos, que conduce a la oxidación de biomacromoléculas, incluyendo ADN. Por lo tanto, la detección eficiente de la oxidación del ADN es importante para una variedad de disciplinas de investigación, incluyendo la medicina y toxicología. Un biomarcador común de ADN oxidativamente dañado es 8-oxo-7,8-dihidro-2 'desoxiguanosina (8-oxo-dGuo; a menudo denominado erróneamente como 8-hidroxi-2' desoxiguanosina (8-OH-dGuo o 8 oxo-DG)). Se han descrito varios protocolos para la medición de 8-oxo-dGuo por cromatografía líquida de alta presión con detección electroquímica (HPLC-ED). Sin embargo, éstos se aplicaron principalmente a ADN purificado tratado con pro-oxidantes. Además, debido a las diferencias metodológicas entre los laboratorios, debido principalmente a las diferencias en equipo analítico, la adopción de métodos publicados para la detección de 8-oxo-dGuo por HPLC-ED requiere la optimización cuidadosa de cada laboratorio. LAprotocolo integral, que describe un procedimiento de este tipo de optimización, es insuficiente. Aquí, un protocolo detallado se describe para la detección de 8-oxo-dGuo por HPLC-ED, en el ADN de células cultivadas o tejidos animales. Se ilustra cómo la preparación de muestras de ADN se puede optimizar fácilmente y rápidamente para minimizar la oxidación indeseable de ADN que puede ocurrir durante la preparación de la muestra. Este protocolo muestra cómo detectar 8-oxo-dGuo en células cultivadas humanos adenocarcinoma alveolar (es decir, células A549) tratados con el agente oxidante KBrO 3, y del bazo de ratones expuestos a la dibenzo hidrocarburo aromático policíclico (def, p) criseno (DBC, antes conocido como dibenzo (a, l) pireno, DALP). En general, este trabajo ilustra cómo una metodología HPLC-ED se puede optimizar fácilmente para la detección de 8-oxo-dGuo en muestras biológicas.
Introduction
Especies reactivas del oxígeno (ROS), cuyos niveles de estado estacionario puede aumentar durante muchas condiciones patológicas y el metabolismo xenotoxic, contribuyen a una mayor frecuencia de daño oxidativo del ADN. Entre varios productos de oxidación posibles nucleobases, daño oxidativo del ADN fácilmente se puede medir usando el marcador estable 8-oxo-7,8-dihidro-2 'desoxiguanosina (8-oxo-dGuo), que es una de las formas oxidadas de 2' -deoxyguanosine (dGuo) 1. 8-oxo-dGuo es el más abundante lesión del ADN 2 y, por lo tanto, ha sido estudiado para mayor detalle como un biomarcador oxidación del ADN a pesar de la existencia de productos de oxidación de ADN múltiple 3. En los seres humanos, este daño puede ser reparado a través de la reparación por escisión de base por 8-oxoguanina glicosilasa 1 (hOGG1) 4. Si se deja sin reparar, 8-oxo-dGuo puede contribuir a la formación de mutaciones de sustitución de pares de bases (es decir, G a T transversiones) 4. Es importante destacar que, 8-oxo-dGuo es un marcador establecido fodaño en el ADN r en relación con la iniciación y promoción de la carcinogénesis 2. Por lo tanto, la cuantificación precisa de 8-oxo-dGuo es un biomarcador útil y deseable de daño oxidativo del ADN 5.
Hay una confusión generalizada en la literatura con respecto a los nombres correctos de las formas dañadas oxidativamente de 2-desoxiguanosina y, por otra parte, el nombre correcto del compuesto (s) mide rutinariamente como un biomarcador de daño oxidativo del ADN 6. Los 6,8-diceto-enol y 6, 8-ceto formas tautoméricas de 8-oxo-dGuo (mostrado en la Figura 1) son los dos tautómeros más prominentes discutidos en la literatura 5,7. La forma de 6,8-diceto es la forma más prominente a pH fisiológico de 7,4, y es el producto de oxidación de ADN más prominente 7. Por lo tanto, 8-oxo-dGuo, en lugar de 8-hidroxi-dGuo es el nombre más apropiado para este producto de oxidación 6. También es importante señalar que 2-desoxiguanosina (dGuo), en lugar de nucleobase guanina (Gua) o guanosina ribonucleósido (Guo), respectivamente, se detecta por la mayoría de los métodos de 6.
Detección y cuantificación de 8-oxo-dGuo exacta es difícil debido a: i) la variabilidad en la digestión de la muestra de ADN, ii) la oxidación adventicia de dGuo a 8-oxo-dGuo que puede ocurrir durante la preparación de la muestra, y iii) la necesidad para la validación efectiva del método HPLC-ED analítica 8. En este protocolo, que tuvo como objetivo a lograr i) proporcionando condiciones favorables para la digestión completa del ADN y ii) por la inclusión quelante de metal y soluciones quelantes tratados y un reactivo DNA-aislamiento especial, mientras iii) fue sólo parcialmente abordados por la inclusión de controles positivos y, por tanto proporcionando que el método es capaz de detectar 8-oxo-dGuo en muestras biológicas. Además de validación está más allá del alcance de este documento. Sin embargo, estamos seguros de que este protocolo ayudará a la prospectivalos usuarios a determinar el grado en que ellos necesitan para validar formalmente el protocolo, dependiendo de sus fines. Una lista de los pasos requeridos para la validación formal del método está provisto además. Durante el desarrollo e implementación de un método para la detección de 8-oxo-dGuo, métodos publicados fueron revisados y consolidados. Por lo tanto, este método elimina la necesidad de reunir información de varias fuentes publicadas que a menudo carecen de importantes detalles experimentales mientras que también proporciona medios rápidos y directos de las pruebas si el método para la detección y cuantificación de 8-oxo-dGuo ha sido adoptado con éxito. Este método adaptado fue empleado con éxito para analizar muestras de ADN de las células cultivadas y el tejido murino. Este artículo de vídeo ayudará a otros grupos en el establecimiento de un método eficaz para la detección fiable y cuantificación de 8-oxo-dGuo por HPLC-ED.
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Protocol
Asegúrese de que todo la ganadería, la vivienda, la manipulación y la experimentación se adhieran a las normas y regulaciones locales y que los protocolos de experimentación se aprobó antes de comenzar cualquier estudio. Para los experimentos descritos, cuidado de los animales, el manejo y el tratamiento fueron aprobados por el Comité de Cuidado Animal Health Canada. Consulte la "Tabla de Reactivos" para obtener información de los proveedores.
1. Recolección de muestras biológicas
- Las células o tejidos de animales
- Crecer células A549 adenocarcinoma alveolares humanos en medios F12-K que contenía suero bovino fetal al 10%, 100 unidades / ml de penicilina y 100 mg / ml de estreptomicina.
- Células de semillas en aproximadamente 1 millón de células por una placa de 10 cm. Para cada experimento, utilice un conjunto de 12 placas en total (tres placas por una réplica biológica x cuatro dosis) para proporcionar suficiente ADN (80 g) para la digestión enzimática y el análisis HPLC.
- Cuando la densidad celular se hace mayor que aproxmadamente 70% del área de superficie de la placa, eliminar los medios de comunicación y lavar las células dos veces con 4 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7,4.
- Para las células animales cultivadas, utilice KBrO 3 como un control positivo.
NOTA: Una relación lineal positiva entre KBrO concentración 3 y frecuencia 8-oxo-dGuo ha sido reportado en la literatura 9. - Disolver KBrO 3 en PBS. Asegúrese de que la concentración final en el medio de cultivo celular es mayor que 1 mM para obtener un aumento estadísticamente significativo de 8-oxo-dGuo respecto a las células un-expuesta. Añadir la misma concentración de KBrO 3 a cada placa en la serie (por ejemplo, placas de 12 10-cm).
- Incubar las placas durante 3 horas a 37 ° C. Quite el papel y lavar una vez con PBS.
- Añadir 1 ml de solución de tripsina (concentración de stock 2,5 g / ml) y se incuba durante 3 min a 37 ° C.
- Lavar con 4 ml de PBS, recoger las células de cada conjunto en una sola poliestir 50 ml cónicotubo de centrífuga eno, y se centrifuga a 1000 xg durante 5 min a 4 ° C.
- Retirar PBS y almacenar el sedimento celular a -80 ° C hasta su posterior análisis. La oxidación del ADN Artificial puede minimizarse aún más por el aislamiento nuclear, como se describe en otra parte 10.
- Los tejidos de animales
- Dosis animales según se requiera. Para este protocolo, adulto (9 semanas de edad) el tratamiento masculino Muta ratón por sonda oral al día durante tres días consecutivos con 20 mg DBC / kg de peso corporal por día disuelto en aceite de oliva.
NOTA: Este animal transgénico puertos ingeniería λ-bacteriófago y la mutación gen reportero lacZ de E. coli 11 se utiliza para ensayos de mutación de roedores transgénicos 12. - Realice la necropsia de los animales, por ejemplo, los ratones anestesiados utilizando isoflurano puede y luego sacrificados mediante dislocación cervical seguida de abertura de la cavidad torácica. Inmediatamente parpadear tejidos por congelación en nitrógeno líquido. Tejidos Almacenar a -80 ° C hasta su análisis.
NOTA: El momento de la eutanasia después del tratamiento puede ser otra variable importante (por ejemplo, la oxidación del ADN fue máxima a 72 hr después de la exposición al ruido en el cerebro de la rata y el hígado 13).
- Dosis animales según se requiera. Para este protocolo, adulto (9 semanas de edad) el tratamiento masculino Muta ratón por sonda oral al día durante tres días consecutivos con 20 mg DBC / kg de peso corporal por día disuelto en aceite de oliva.
2. Extracción de ADN, precipitación y lavado (para los tejidos proceder directamente a 2,2)
- Homogeneizar las células recogidas en un tubo de centrífuga de poliestireno cónico de 50 ml con 1 ml de ADN aislando agente como DNAzol. Utilice una punta de pipeta l 1000 para dispersar el sedimento celular hasta que la solución sea homogénea. Transferencia homogeneizado a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Incubar en hielo durante 10-20 min. Proceda a 2,3.
- Homogeneizar 15-20 mg de tejido en un homogeneizador de vidrio antiadherente de mano 1 ml contiene 500 agente de aislamiento de ADN l. Elevar suavemente e inferior homogenizador durante 1 min; tejidos más blandos requerirán menos tiempo. Tratamiento suave asegura menos esquila de ADN. Guarde el homogeneizado en hielo durante aproximadamente 10-20 min.
- Bolitael homogeneizado por centrifugación durante 10 min a 10.000 xg y 4 ° C en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml cónica.
- Transferir con cuidado el sobrenadante resultante en un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml prestando especial atención a evitar el contacto con la pastilla.
- Precipitar el ADN del homogeneizado mediante la adición de 0,5 ml EtOH al 100% por 1 ml de homogeneizado. Invertir tubos de 10 veces para asegurar reactivo aislar y EtOH son suficientemente mezclado.
- En este punto, precipitado de ADN es viscoso, carrete que en una punta de pipeta de plástico (por ejemplo, con una capacidad máxima de retención de 200 l) y después se transfirió a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml cónico.
NOTA: centrifugación rápida se puede emplear para eliminar cualquier lisado restante a partir del ADN aislado.
(DNA Wash y solubilización) - Añadir 1 ml de EtOH al 75% para el ADN aislado. Suspender el sedimento de ADN completamente invirtiendo los tubos 10 veces.
- Decantar cuidadosamente el etanol a partir de tubo. Asegúrese de que XXe pellet de ADN se pega a la pared del tubo. Guarde los tubos verticalmente durante 1-2 min y utilizar una pipeta para eliminar cualquier exceso de EtOH desde la parte inferior del tubo.
- Repita el ADN lavar una vez más, y, o bien almacenar la muestra en EtOH a -20 ° C (estable durante varios meses), o proceder de inmediato a la digestión.
- Disolver el ADN en tampón de digestión (descrito a continuación) y luego cuantificar utilizando métodos espectroscópicos estándar (es decir, la absorbancia a 260 nm utilizando un espectrofotómetro NanoDrop).
3. La digestión enzimática
- Prepare "tampón de digestión" mediante la combinación de volúmenes apropiados (en función del número de muestras para ser digerida) de 50 mM de fosfato monobásico Na (que contiene 2,0 mM KCl, 1,0 mM desferal (DFO) y 200 mM de MgCl 2) con 50 mM fosfato dibásico de Na (que también contiene 2,0 mM KCl, 1,0 mM DFO y 200 mM de MgCl 2). Cada muestra requiere 4,0 l monobásico y 17,0 l de solución de fosfato dibásico. <li> Eliminar cualquier resto de EtOH desde el fondo de las muestras de tubos y de secado al aire durante unos 5 minutos. Asegúrese de que el ADN no se seque por completo.
- Disolver 80 g de ADN extraído en 21,0 l de tampón de digestión de la, añadir 1 unidad de DNasa I disuelto en 2,0 l de tampón de digestión.
- Vortex suavemente para lograr una mezcla completa y se incuba durante 1,5 horas a 37 ° C.
- Al final del periodo de incubación, añadir 216,4 l de solución de fosfato dibásico 50 mM Na que contiene 2,0 mM de KCl, 1,0 mM DFO y 200 mM de MgCl 2.
- Preparar "digestión buffer-2" mediante la combinación de un volumen de tampón de digestión con nueve volúmenes de dibásico, 50 mM fosfato de Na (con 2,0 mM KCl, 1,0 mM DFO y 200 mM de MgCl 2).
- Añadir 0,025 unidades de la fosfodiesterasa (PDE) Me enzima en 16,3 l de tampón-2 digestión. Pipetear hacia arriba y abajo durante varios segundos, luego vórtice ligeramente para lograr una mezcla completa y se incuba durante 1,5 horas a 37 ° C.
- Añadir 00,4 unidades de fosfatasa alcalina (AP) en 8,0 l de tampón-2 digestión. Pipetear hacia arriba y abajo durante varios segundos, luego vórtice ligeramente para lograr una mezcla completa y se incuba durante 1,5 horas a 37 ° C. Añadir 33,0 l HPLC grado MeOH.
- Ejecutar las muestras de ADN digeridos en HPLC, como se describe a continuación, de inmediato o almacenar a -80 ° C hasta su uso para minimizar la oxidación. NOTA: Los pasos de digestión de 1,5 hr sugeridas aquí se basan en los intervalos sugirió otros lugares 9 y en las conclusiones que los protocolos similares a lograr la digestión completa del ADN 9. Por lo tanto, se asumió que el único factor limitante para lograr la digestión completa era el tiempo y que la inhibición de la enzima y la falta de homogeneidad de la muestra eran insignificantes.
4. HPLC Run: Preparación de la fase móvil, instalación de Instrumentación y Mantenimiento
- Use agua ultrapura para preparar todas las soluciones tampón y tratado con resina de alta fuerza de adherencia (por ejemplo, Chelex 100: estireno divinylbecopolímero nzene con iminodiacetato iones de metales de transición que quelato con alta afinidad) para minimizar la contaminación por metales y la oxidación del ADN durante la preparación de la muestra.
- Preparar tampón de fosfato 250 mM Na, pH 6,2. Utilice una relación de 1: 3,6957 de fosfato de sodio dibásico (FW = 177,99 g / mol) a fosfato de sodio monobásico (FW = 119,98 g / mol).
Ejemplo: Por lo tanto, para una solución madre de 3 L combinar 70,81 g de monobásico y 28,43 g de polvo dibásico, añadir agua hasta por ejemplo, 2,8 L y verificar que el pH de la solución es 6,2. Ajustar el pH con 250 mono o fosfato de sodio dibásico soluciones mM, preparadas por separado y no por ácidos o bases concentradas. Añadir 2,24 g de KCl para obtener una concentración de 10 mM KCl. - Preparar la fase móvil en tres botellas, por lo menos 1 litro cada una, conteniendo: disolvente B - metanol grado HPLC, disolvente - agua ultrapura B, C y solvente - tampón fosfato desde el paso 4.2. Inserte HPLC tubería de suministro de fase móvil en las botellas; remainitubos ng deben ser también sumergen en una de las botellas (por ejemplo, solución C) y cebados, incluso si no se requieren para la mezcla.
- Durante la carrera, mezclar las soluciones de la fase móvil como 6% de disolvente A, disolvente B 74% y 20% C disolvente para lograr solución final de 50 mM de tampón de fosfato de sodio (pH 6,2) con KCl 2,0 mM, y 6% de MeOH.
- Separe el electrodo del detector electroquímico, desmontarlo y limpio electrodos de referencia y de trabajo con las soluciones de limpieza del electrodo y discos para pulir recomendados por el fabricante. Enjuague las superficies limpiadas con agua ultrapura, limpie el grifo con cuidado y asegúrese de que el detector esté seca antes de encender el sistema.
- Volver a montar el detector y conectar la entrada de fase móvil para el electrodo. A su vez en el flujo y permitir que la fase móvil para llenar el electrodo antes de conectar el tubo de salida de fase móvil. Instalar una nueva columna antes de iniciar la optimización. Asegúrese de que la instalación está en la dirección correcta y follows todas las recomendaciones del fabricante.
- Encienda la instrumentación de HPLC muy por delante (por ejemplo, 1 hr) de la muestra de análisis para permitir el equilibrio y para reducir el ruido de línea de base. Ver Tabla 1 para los ajustes sugeridos; el límite de presión de vuelta debe establecerse en 3000 psi para evitar daños columna. Encienda el desgasificador. Proceda con el cebado de las bombas y la creación de gradiente de disolvente.
- Primer seco las bombas de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Hacer esto para mojar las líneas cuando una fase móvil ha sido reemplazado o la entrada de tubo se expone al aire.
- Busque el disco de cebado e insertar una jeringa de plástico de 10-15 ml allí. Asegúrese de que la jeringa se inserta completamente antes de abrir la línea. Para abrir las líneas simplemente gire el disco hacia la izquierda durante un turno.
- Inicie la primera con la selección de la interfaz de HPLC adecuado. Tire suavemente la jeringa para extraer fluido en las líneas. Una vez que el fluido está fluyendo, el primer es completa; permitir que el programaterminar la carrera. Repita para todas las líneas (normalmente cuatro, dependiendo del instrumento).
- Alternativamente, el primer mojado cuando las líneas ya se humedecen de un primer seca antes (ver más abajo).
NOTA: Cuando haya transcurrido una gran cantidad de tiempo entre usos (por ejemplo, 2 semanas o más), se recomienda un primer seco. - Cambie la composición de los componentes disolventes de fase móvil a 25% cada uno usando la interfaz de usuario HPLC. Desde la interfaz, seleccione la opción "Función directa", luego la opción "Wet Prime" seleccionar. Esto se cebará todas las líneas al mismo tiempo.
- Asegúrese de que todo el aire está fuera del sistema mediante la observación de la línea principal húmeda ya que entra en el recipiente de residuos. Después de un buen primer, asegúrese de que no hay burbujas se dejan en la línea. Si persisten las burbujas, repetir el cebado.
- Una vez que la bomba está cebada, empezar a mover la fase móvil HPLC. Utilice la interfaz de HPLC para cambiar manualmente la composición de la fase móvil a 6% de metanol (disolvente A) y 94%agua (disolvente B), y seleccione un caudal de 0,9 ml / min. Permitir 5 minutos para despejar cualquier metanol a partir de la etapa de limpieza de la columna.
- Después de 5 min, cambiar la composición a 6% de metanol (disolvente A), 74% de agua (disolvente B), tampón de 20% (disolvente C), aumentar la velocidad de flujo a 1,0 ml / min. Establezca otros parámetros como se resume en la Tabla 1, y establecer el límite de presión de nuevo a 3000 psi para evitar daños en la columna.
NOTA: Los problemas potenciales con la configuración HPLC incluyen la línea de base a la deriva, el pico de división y la intensidad de la señal disminuye. Estos por lo general se pueden superar mediante la limpieza de la columna después de cada uso, la limpieza frecuente del electrodo, y asegurar que las soluciones tampón están libres de contaminación (por ejemplo, partículas o crecimiento microbiano). - Ejecute la fase móvil durante aproximadamente 1 a 1,5 horas para lograr una señal de línea de base estable.
- Mediante la interfaz de software del instrumento, seleccione los parámetros que se indican en la Tabla 1 y se ajusta el tiempo de ejecución de 15 min. Inyectar el sample. Utilice aumento de los tiempos de ejecución para muestras complejas (determinar esto empíricamente mediante la observación de la presencia o ausencia de picos allá intervalo de 15 min).
NOTA: El software del instrumento permite la programación de las condiciones de ejecución de la muestra y la configuración de automuestreo. - Después de las carreras se han completado, apague la célula detector mediante la interfaz del detector. Es importante seguir las recomendaciones del fabricante con respecto a apagar el detector como un manejo inadecuado y apagado pueden dañar el instrumento. NO apagar el celular al cambiar la parte posterior del detector, ya que podría dañar el instrumento.
- Cambiar manualmente la composición de la fase móvil a 6% de metanol y 94% de agua. Corre por 5 min.
- Reducir manualmente la velocidad de flujo de 0,7 ml / min, inmediatamente cambiar la composición a 50% de MeOH y 50% de agua. Corre por al menos 20 minutos. Si no se ejecuta este paso durante el tiempo recomendado puede causar daños a la columna y el detector. Apague la corriente, unad luego apague el desgasificador.
5. Elaboración de Normas
- Preparar tampón de fase móvil como se indica en los pasos 4.1 a 4.3 anteriores. Es importante utilizar la fase móvil de HPLC para la preparación de normas para evitar picos resultantes de la mezcla de soluciones diferentes después de la inyección de la muestra.
- Diluir esta solución uno de cada cinco con agua ultrapura antes de su uso, y la solución final debe contener 6% de MeOH.
- dGuo Estándar
NOTA: Alto potencial de oxidación requerido para la detección dGuo puede aumentar el riesgo de medir interferir compuestos electroactivos. Esto puede ser verificada mediante, por ejemplo, una curva estándar de detección UV de dGuo a 260 nm y comparándola con la curva estándar creado con detección CE. Si ambos se alinean bien (por ejemplo, Figura 1) y los efectos de la matriz de la muestra se han tenido en cuenta, se puede proceder con la detección dGuo por UV a 260 nm, en lugar de la detección de la CE.- Vortex a alta velocidad hasta dGuo disuelve completamente. Esta es la acción primaria; almacenar a -20 ° C durante varias semanas.
- Para crear la acción dGuo secundario (0,5 mM), diluir 143 l de dGuo social primario en 857 l de fase móvil HPLC. Almacenar en hielo hasta su uso y preparar fresco todos los días.
- Hacer diluciones adicionales para crear una curva estándar (por ejemplo, Tabla 2). Soluciones de las tiendas en el hielo y se preparan fresco todos los días. Normas Ejecutar en serie con muestras experimentales.
- Antes de correr, puede variar el voltaje del detector con la más alta concentración de la población para encontrar la tensión óptima.
- 8-oxo-dGuo Standard
- Mida 1,0 mg de 8-oxo-dGuo en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Añadir MeOH grado 0,1 ml HPLC. Vortex a velocidad alta hasta 8-oxo-dGuo disuelve completamente. Este es el stock primaria de 8-oxo-dGuo. Conservar a -20 ° C durante sevsemana va-.
- En un tubo separado, combine 2,9 l de existencias primarias y 997,1 l de tampón de fase móvil HPLC, vórtice. Esta es la acción secundaria (10.000 nM).
- Para crear una solución de trabajo para la curva estándar (250 nm), se combinan 24,4 l de valores secundario y 975,6 l de tampón de fase móvil.
- Realizar diluciones adicionales para proporcionar las soluciones necesarias para crear una curva estándar (por ejemplo, la Tabla 3). Soluciones de las tiendas en el hielo y se preparan fresco todos los días. Ejecutar las normas con las muestras experimentales.
- Cuantificación
- Integrar el área bajo la curva para ambos 8-oxo-dGuo y dGuo utilizando software estándar (como parte de la interfaz de HPLC-ordenador; ver Figura suplementaria 2A).
- Construir la curva estándar (concentración conocida de cada analito vs. área bajo la curva (Figura complementario 2B). Usando la ecuación de la curva estándar, para calcular la relación de 8-oxo-dGuo / dGuo para cada muestra.
6. Electroforesis en gel de agarosa
NOTA: electroforesis en gel de agarosa se puede realizar para verificar la integridad de la digestión del ADN.
- Preparar 50x Tris-acetato-EDTA (TAE) de amortiguación, disolviendo 242 g de base Tris (FW = 121,14) en 750 ml de agua ultrapura. Añadir 57,1 ml de ácido acético glacial y 100 ml de 0,5 M EDTA (pH 8,0; EDTA se disolverá completamente cuando el pH de la solución se ajusta a 8,0 con, por ejemplo, NaOH) y añadir agua ultrapura a un volumen final de 1 L. Almacenar a RT, diluir esta solución 50x antes de su uso.
- Pesar 1 g de agarosa y se disuelven en 100 ml de tampón 1x TAE, calentando en el microondas durante 1-2 minutos. Use gafas y equipo de protección para evitar el contacto con agarosa hirviendo.
- Enfriar la solución hasta que aproximadamente 50 ° C, añadir 5 l de bromuro de etidio (precaución: mutágeno) y se vierte en el aparato de gel de agarosa correr. Inserte el peine.
- Esperar hasta que se solidifica la solución, se vierte tampón TAE sobre el gel y cargar las muestras (volumen depende del tamaño peine; típicamente, se carga 10-20 l de muestra de ADN, se mezcla con 6x colorante corriendo para visualizar y facilitar la carga).
- Ejecutar el gel hasta que el colorante migra aproximadamente 2/3 de la longitud del gel (por ejemplo, 45 min a 150 V). Visualizar bandas de ADN bajo la luz ultravioleta.
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Representative Results
dGuo fue observado para tener un tiempo de retención de 4,7 min mientras que 8-oxo-dGuo tenía un tiempo de retención de aproximadamente 6,4 min (Figura 2A y B). Hay una diferencia sobre 1.000 veces en las alturas de los picos entre los dos analitos, como se ve en la Figura 2C. Voltamogramas para 8-oxo-dGuo y dGuo se obtuvieron por las normas de funcionamiento a un potencial de trabajo en el intervalo de 0,2 a 1,1 V. El potencial de trabajo óptimo para 8-oxo-dGuo se determinó que era 0,5 V, y 0,9 V para dGuo (Figura 3). Estos potenciales están de acuerdo con otros electrodos de carbón vítreo descritos en la literatura 14,15. El límite de detección y el rango dinámico de detección electroquímica 8-oxo-dGuo y dGuo se divulga para estar en el rango femtomol y nanomol, respectivamente 8,9. Las curvas de calibración para dGuo y 8-oxo-dGuo deben ejecutarse diariamente para asegurar la detección lineal a través de un rango de concentración adecuado y apropiado realizarANCE del instrumento (Figura 4). Se construyen curvas patrón representando gráficamente el área del pico como una función de la concentración de analito conocida (Figura 2) que permite calcular la concentración de analito en las muestras de la ecuación generada a partir de las curvas estándar.
Se requiere la digestión completa del ADN para mediciones precisas de la frecuencia de 8-oxo-dgua y varios métodos de digestión de ADN genómico se han sugerido 8,15,16. Cuando sea necesario, la eficacia de la extracción de ADN y la digestión puede ser verificada utilizando electroforesis en gel de agarosa (Figura 5A) y HPLC-ED (Figura 5B). Lanes con frotis de ADN evidente en la Figura 5A (por ejemplo, carriles 2, 4, 6, 9, 11, y 13) indican la presencia de ADN sin digerir mientras que las muestras con fragmentos de ADN digeridos salido del gel y fueron por lo tanto sin ser detectados. La meseta en la Figura 5B indica que más incubatien del ADN con enzimas de digestión más allá de 1,5 hr no resulta en una mayor cantidad de dGuo detectado, lo que sugiere la digestión casi completa después de 1,5 hr. Además, tanto la electroforesis en gel de agarosa y HPLC-ED se utilizaron para probar la utilidad del tampón de digestión de ADN basado en fosfato empleado aquí. Este tampón está bien adaptado a la fase móvil de HPLC y no da lugar a ruido del detector reacciones adversas atribuibles a la mezcla de soluciones diferentes (datos no mostrados). Por lo tanto, el interruptor de la memoria intermedia se sugiere en la literatura (es decir, Tris-HCl 8) se recomienda tampón de fosfato de sodio para este protocolo (izquierda versus lado derecho de la Figura 5A). Tenga en cuenta que los supuestos subyacentes para la optimización de la digestión de ADN fueron que la enzima inhibición y falta de homogeneidad de la muestra eran insignificantes y tiempo de digestión fue el único factor limitante, como se ha dicho. Una posibilidad de que la digestión incompleta de ADN dio como resultado fragmentos que son demasiado pequeñas para ser detected sobre los restos de gel de agarosa. A pesar de que un error tan sistemática afectaría a todas las muestras por igual, más experimentos (por ejemplo, el tratamiento de las células cultivadas con radiomarcado pro-oxidante 10) podrían llevarse a cabo para descartar por completo esa posibilidad.
A diferencia de las soluciones estándar, el ADN digerido, ya sea a partir de células aisladas o tejidos de ratón, produjo varios picos adicionales (Figura 6A y 6B). Estos fueron distante de los picos de 8-oxo-dGuo y dGuo, pero experimentos de adición como parte de ejercicios de validación descritas en la Discusión se necesitan para examinar si picos adicionales (es decir, muestra de impureza debido a los efectos de la matriz, por ejemplo) interfieren con la cuantificación . El pico-dGuo 8-oxo fue confirmada por la correspondencia del tiempo de retención con el estándar; y por otra parte, el aumento en el pico-dGuo 8-oxo para muestras de células o animales que se sometieron a tratamiento pro-oxidante (Figura 7). Pro-oxidante KBrO 3 participa en la abstracción de un electrón de guanina que conduce a la formación de 8-oxo-dGuo 17. Es de destacar que, en ausencia de la tensión pro-oxidante, se detectaron 2,4 moléculas de 8-oxo-dGuo por 10 7 dGuo en células A549 (Figura 7A). Esto es comparable a 4,5 moléculas de 8-oxo-dGuo / 10 7 dGuo detectado en células A549 observados utilizando un enfoque alternativo basado en la espectrometría de masas diseñado para hacer frente a posibles deficiencias del método de HPLC-ED 9. Tratamiento DBC (es decir, todos los días 20,0 mg DBC / kg de peso corporal por día durante tres días) aumentó los niveles-dGuo 8-oxo en el ADN de bazo de ratón. Este también es un resultado esperado, ya que ROS se sabe que se produce durante el metabolismo de hidrocarburos aromáticos policíclicos en vivo 8. Los niveles relativos de 8-oxo-dGuo en el bazo de los animales no acentuadas fueron 8.3 a 9.4 8-oxo-dGuo / 10 6 dGuo (Figura 7B), que está en excelentes agreement con los valores publicados de cuatro moléculas de 8-oxo-dG / 10 6 dGuo medidos en células esplénicas murinas en condiciones estándar por HPLC-ED 18. Figuras 6 y 7 muestran que los niveles de 8-oxo-dGuo por encima de la línea de base son muy pequeños . Así, si ADN se oxida a niveles más bajos que los observados aquí, los niveles de 8-oxo-dGuo pueden ser indistinguibles de la línea de base, que debe tenerse en cuenta por los usuarios de protocolo potenciales.
Figura 1. Estructura de 8-oxo-dGuo y su tautómero 8-OH-dGuo. Tenga en cuenta que 8-oxo-dGuo en lugar de 8-OH-dGuo es el tautómero principal a pH 7,4.
Figura 2. Los tiempos de retención para dGuo (A) y 8-oxo-dGuo (B). HPLC-ED cromatogramas se obtuvieron de una inyección de 10,0 l de cualquiera de dGuo, (1,0 nmol total) o 8-oxo-dGuo (1000 fmol total) y se detecta en 0,9 V (A) o 0,5 V (B). El pico de retención para dGuo fue de aproximadamente 4,7 min (A) y que para 8-oxo-dGuo fue de aproximadamente 6,4 min (B). El pico ancho en 2-3 min probable es causada por perturbaciones de inyección y no se ve afectado (es decir, siempre presente en intensidad similar) por la concentración de 8-oxo dGuo. (C) cromatogramas superpuestos a partir de dos inyecciones separadas descritas en (A) y (B) detectado por UV (260 nm). Las normas se realizaron el mismo día utilizando condiciones de ejecución idénticas. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Figura 3. Optimización de voltaje detector. (A) voltamograma de dGuo (concentración final 1 nmol) detectado por análisis de HPLC-ED en un rango de 0,7-1,1 V. (B) voltamograma de 8-oxo-dGuo (concentración final 500 fmol) detectado por análisis de HPLC-ED en un rango de 0,3-0,7 V. Medios de tres experimentos independientes (N = 3) ± la desviación estándar se muestra. En algunos casos, las barras de error son más pequeñas que los símbolos de trazado.
Figura 4. Curva estándar para dGuo (A) y 8-oxo-dGuo (B). Diez microlitros de cualquiera de dGuo o 8-oxo-dGuo se inyectó y medidos por HPLC-ED a 0,9 V (A) o 0,6 V (B ). Medios de tres experimentos independientes (N = 3) ± desviación estándar se muestra. En algunos casos, las barras de error son smaller de los símbolos de trazado.
Figura 5. Optimización de la digestión del ADN. (A) El ochenta microgramos de testículos de salmón de ADN fue digerido como se describe 8 en Tris-HCl, tampón de glicina-etilo (izquierda) o tampón de fosfato de sodio (derecha). Electroforesis en gel de agarosa (1,0%) se hizo funcionar a 150 V durante 45 min. El carril 1 y 8: escalera de ADN; carriles 2, 4, y 6: ADN sin digerir; carriles 3, 5 y 7: ADN digerido; carriles 9, 11 y 13: ADN sin digerir (tampón fosfato); carriles 10, 12, y 14:. digerido DNA (tampón fosfato) (B) testículos de salmón de ADN (80 g) se digirió en el presente documento mediante la incubación con DNasa I, PDE I, y AP para 0,5-2,5 hr por cada paso, en 50 mM de tampón de fosfato que contiene cloruro de magnesio y DFO. Cincuenta microlitros de cada muestra, que contienen 7,3 g de ADN digerido, se analizó por HPLC (es decir, 0,9 V y 1 ml / min flow) para detectar dGuo. La figura muestra a través de tres experimentos independientes (N = 3) ± error estándar de la media. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6. Los cromatogramas para dGuo-8-oxo detección en células cultivadas (A) o tejido animal (B). (A) digerido de ADN a partir de células A549, tratados o no tratados con KBrO 3. (B) de ADN digeridos a partir del bazo de DBC los ratones tratados con. Peaks desplaza a la izquierda debido a la eliminación de la columna de guardia (debido a la acumulación de presión en el aparato; su posición se confirmó con las normas). Normas y las muestras se realizaron en el mismo día usando la condición de ejecución idénticas y 10 ml de inyección de volúmenes, a un caudal 1 ml / min y 0,5 y 0,9 V para dGuo y 8-oxo-dGuo, respectivamente. Por favor haga clic aquí para una versión más grande de panel A; aquí para el panel B.
Figura 7. La cuantificación de 8-oxo-dGuo en muestras biológicas. Los picos se integran y se comparan con las curvas de calibración (véase la figura complementaria 2 para más detalles) para producir niveles de 8-oxo-dGuo en el ADN a partir de células A549, tratados con KBrO 3 ( A), o los niveles de 8-oxo-dGuo en el ADN del bazo de los ratones tratados con DBC (B). Estrellas (*) indican la significación estadística (p <00.05, el análisis de una vía de la varianza (ANOVA) (A), la prueba t de Student (B)). Medios de tres (A) o cinco (B) experimentos independientes ± error estándar de la media se muestran. Las muestras se recogieron 4 o 24 hr después del tratamiento de 3 días.
| Fase móvil | Tampón de fosfato 50,0 mM Na, pH 6,2, que contiene 6% de MeOH y 2,0 mM KCl |
| Caudal de la fase móvil | 1,0 ml / min |
| Tipo de columna | YMC-BASIC con sílice esférica unido |
| Longitud de la columna | 15 cm |
| Diámetro interior de la columna | 3.5 mm |
| Temperatura de la columna | 35 ° C |
| La temperatura del detector | 29 ° C |
| Ajuste de tensión de 8-oxo-dGuo | 0,5 V |
| Ajuste de tensión para dGuo | 0,9 V |
| El volumen de inyección | 10,0 ml |
Tabla 1. Parámetros de instrumentos para la detección y cuantificación de 8-oxo-dGuo por HPLC-ED.
| nmoles | 100 nM estándar, l | HPLC de fase móvil, l | La dilución, doble |
| 5 | 300 | 0 | 1 |
| 2.5 | 150 | 150 | 2 |
| 1 | 60 | 240 | 5 |
| 0.5 | 30 | 270 | 10 |
| 0.25 | 15 | 285 | 20 |
| 0.1 | 6 | 294 | 50 |
Tabla 2. </ Strong> Preparación de la curva estándar para dGuo.
| fmoles | 250 nM estándar, l | HPLC de fase móvil, l | La dilución, doble |
| 2500 | 300 | 0 | 1 |
| 1000 | 120 | 180 | 2.5 |
| 500 | 150 | 150 | 5 |
| 250 | 150 | 150 | 10 |
| 100 | 120 | 180 | 25 |
| 50 | 150 | 150 | 50 |
Tabla 3. Preparación de la curva estándar para 8-oxo-dGuo.
Cenar complementario Figura 1. Comparación de electroquímica (CE) y la detección basada en UV de dGuo. curva estándar fue creado para la detección dGuo por detección electroquímica (CE) o la detección UV (260 nm). Áreas de los picos se integraron para el pico dGuo en aproximadamente 4,7 min por ambos métodos. N = 3, medias ± desviación estándar se muestran.
Suplementaria Figura 2. Cuantificación de dGuo de su curva estándar. Un ejemplo de la utilización de la curva estándar para determinar la concentración de dGuo se muestra. (A) área de pico se puede determinar por integración utilizando el software estándar. (B) Esta información es utilizada para construir una curva estándar con el fin de utilizar la ecuación de la recta para calcular la concentración de analito en la muestra desconocida.52697 / 52697fig9large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Aunque 8-oxo-dGuo ha sido reportado como un biomarcador útil de la oxidación del ADN, su cuantificación fiable puede suponer un reto. Aunque existen varios métodos publicados, hay una necesidad de una visión global, descriptivo de protocolo para permitir a los investigadores a implementar el método en sus laboratorios. Aquí presentamos un resumen detallado de un protocolo basado en HPLC que permita a los nuevos usuarios para establecer un método eficaz para la detección y cuantificación de 8-oxo-dGuo.
Tres métodos principales que se han descrito para la cuantificación de 8-oxo-dGuo. Estos incluyen la enzima ensayo inmunoenzimático (ELISA) basados en kits comerciales 19, cromatografía / espectrometría de masa líquida métodos (MS) (por ejemplo, como se describe en otro lugar 9 y métodos de HPLC-ED, tal como el descrito en el presente documento. Los métodos ELISA pueden sufrir de interferencias con ciertos compuestos en muestras biológicas 19. En general, los resultados obtenidos utilizando Chromatographic técnicas se consideran más fiable para 8-oxo-dGuo cuantificación en comparación con los métodos basados en ELISA 20. En la comparación de los métodos de HPLC-ED con los métodos basados en MS, la ventaja de la primera es relativamente equipos de bajo costo (es decir, aproximadamente un orden de magnitud menos costoso que el equipo para los métodos basados en MS). Además, HPLC-MS son superiores a los métodos de HPLC-ED como los primeros no son propensos a posibles interferencias con compuestos electroactivos y proporcionan mediciones inequívocas, cuantitativos utilizando isótopos 21.
Se han planteado preocupaciones sobre el uso de métodos de extracción fenol tradicionales para la extracción de ADN genómico que se utilizará para el 8-oxo-dGuo cuantificación 22. Varios investigadores han observado que las condiciones asociadas con la extracción con fenol estándar pueden introducir oxidación dGuo no deseado por lo tanto el aumento de los niveles de referencia 1,9. Para abordar este problema, celular y animal de ADN genómico se puede extraer y se purificó usando un protocolo modificado DNAzol 22. DNAzol contiene altas concentraciones de tiocianato de guanidina, y estudios previos 9 han señalado nivel basal menor formación de 8-oxo-dGuo cuando se utiliza DNAzol comparación con fenol tradicional y los métodos de extracción basados en Nal. El compuesto quelante de hierro DFO se utiliza para minimizar la producción de ROS y la oxidación del ADN durante la preparación de la muestra. Como se señaló anteriormente, los niveles de 8-oxo-dGuo en las células A549 no acentuadas (Figura 7A) fueron muy similar a lo que se midió mediante un método basado en MS 13. Esto sugiere que la incorporación de precauciones descritas para los métodos basados en MS 13 permite la minimización de la oxidación del ADN indeseable durante la preparación y análisis de la muestra para lograr la cuantificación precisa 8-oxo-dGuo por HPLC-ED. Momento de células de cultivo de necropsia o recolección después del tratamiento pro-oxidante puede ser otro factor importante, como se ve aquí por la disminución de 8-oxo-dGuo nivelesen el bazo a las 24 horas frente a 4 horas después del último tratamiento (Figura 7B). Esto puede ser debido a la activación de la reparación por escisión de base para eliminar el daño del ADN.
Las dos limitaciones obvias del método descrito son: (1) el requisito de que en lugar de grandes cantidades de ADN (aproximadamente 80 g por muestra para conseguir tres repeticiones técnica), y (2) la interferencia potencial a partir de compuestos co-elución. Se encontró que sólo una muy pequeña (es decir, aproximadamente 15 mg) pedazo de bazo (aproximadamente 15% del peso total del tejido) era suficiente para obtener 80 g de ADN, dejando una cantidad suficiente de tejido para la otra (por ejemplo, la expresión génica) los análisis. La cantidad de ADN extraído es otro parámetro crítico que afecta a la oxidación del ADN artefactual 23,24,25. Por lo tanto, el trabajo con bastante grande (~ 80 mg / muestra) que sugerimos aquí es consistente con las recomendaciones anteriores de la utilización de> 30 mg para minimizar la oxidación del ADN artifactual 25.Para tejidos más pequeños (por ejemplo, el hipocampo), se podría reducir la amplitud del protocolo para comenzar con 20-30 g de ADN, ya que esto debería ser suficiente para 2-3 carreras. Las cantidades más grandes de ADN presumiblemente facilitan la resolución de picos por encima del ruido de fondo, pero esto aún no se ha verificado experimentalmente la presencia de sustancias potencialmente interferentes se puede abordar en una base de caso por caso, y es esencial incluir siempre muestra de ADN de simultánea in vitro o en los tratamientos in vivo con un control positivo que se sabe que inducen daño oxidativo del ADN (véase la Figura 7).
Aunque el fosfato en tampones de fosfato ha sido reportado para reducir la actividad de la fosfatasa alcalina, experimentos de optimización método (Figura 5) confirmaron que tampón de fosfato podría ser utilizado fácilmente. Desde tampón de fosfato está contenido en la fase móvil, su uso en la preparación de muestras reduce el ruido del detector debido a solventilar la mezcla. , Composición del tampón, la extracción de ADN así tensión y la digestión se optimizaron y controles positivos fueron incluidos. Además, se ofrece un resumen expondrá cómo estas variables se pueden optimizar aún más por los laboratorios individuales. Nuestro objetivo era producir un método que podría ser útil para laboratorios especializados destinados a desarrollar un ensayo para la detección y cuantificación de 8-oxo-dGuo.
Sin embargo, observamos que se requiere validación formal del método, como se indica bajo las validaciones pasos recomendados por la Conferencia Internacional sobre Armonización de los Requisitos Técnicos para el Registro de Productos Farmacéuticos para Uso Humano (ICH) para la validación de los procedimientos analíticos (es decir, ICH Q2 ( R1) 26). En pocas palabras, los elementos de validación cuantitativa deben examinar del ensayo: 1) la precisión (que se puede lograr mediante la inclusión de muestras con diferentes cantidades de 8-oxo-dGuo pinchos-en; 2) gama y la linealidad (respuesta lineal a través de extconcentración de analito composición; 3) la precisión (repetibilidad y reproducibilidad); 4) límite de detección (en general, el punto en el que la relación señal a ruido es mayor o igual 2-3; esto puede ser dependiente de la matriz); 5) límite de cuantificación (concentración a la que la respuesta se reúne algunos niveles predeterminados tales como 2 x desviación estándar de control; puede ser dependiente de la matriz); 6) la selectividad / especificidad (capacidad de detectar el analito en muestras complejas frente a soluciones ordenadas); 7) la reproducibilidad (la capacidad de conseguir el mismo resultado en diferentes laboratorios con diferentes operadores); y 8) la robustez y la idoneidad del sistema. Dado que el propósito de la validación recomendado por el ICH es demostrar que es "adecuado para los fines previstos" y muchos laboratorios probablemente tendrá diferentes propósitos, los usuarios potenciales de este ensayo tendría que validar esta a la medida que se considere necesario. La cuantificación precisa de 8-oxo-dGuo es deseable en la toxicología y el pecado medicina molecularCE, ha puede mejorar la comprensión de cómo el estrés oxidativo, y más específicamente la oxidación del ADN, está mecánicamente y empíricamente vinculada a efectos adversos para la salud.
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Acknowledgments
Esta investigación fue financiada por la Iniciativa de Salud de Canadá Genómica Investigación y Desarrollo (GRDI) y la Estrategia de Regulación Canadiense de Biotecnología (letras CRSB). Los autores no tienen ningún conflicto de intereses.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-oxo-dGuo standard | Cayman Chemical Company | 89320 | Inappropriately referred to as "8-hydroxy-2'-deoxy Guanosine"; see Fig. 1 and text for details. |
| Alkaline phosphatase | Sigma-Aldrich | P5931 | From E. coli |
| Chelex 100 | Sigma-Aldrich | C7901 | Chelates heavy metals |
| Desferoxamine mesylate | Sigma-Aldrich | D9533 | |
| dGuo standard | Sigma-Aldrich | D7145 | |
| Dibasic sodium phosphate | Sigma-Aldrich | S9390 | |
| DNA from salmon sperm | Sigma-Aldrich | D1626 | Sodium salt |
| DNase I | Sigma-Aldrich | D4527 | TypeII, from bovine pancreas |
| DNAzol | Invitrogen | 10503-27 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma-Aldrich | E4884 | The compound would not completely dissolve until solution pH is adjusted to 8.0 (e.g. with NaOH) |
| F12-K media | ATCC | 30-2004 | |
| Foetal bovine serum | ATCC | 30-2020 | |
| Guard column | Chromatographic Specialties | YBA 99S03 0204GC | Protects colum from contamination; may also lead to pressure build-up |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Monobasic sodium phosphate | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline | Invitrogen | 15190-250 | |
| Phosphodiesterase I enzyme | Sigma-Aldrich | P3243 | Type II from Crotalus adamaneus venom |
| Teflon homogenizer | Thomas Scientific | 7724T-1 or 7724T-5 for 1 or 5 mL, respectively | Volume (holding capacity) depends on the amount of sample to be processed. |
| Trypsin | Invitrogen | 15050-065 | |
| YMC-BASIC column with bonded spherical silica | Chromatographic Specialties | YBA 99S03 1546WT |
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