La médula espinal de los mamíferos adultos contiene células madre/progenitoras neurales (NSPCs) que pueden ser aisladas y expandidas en cultivo. Este protocolo describe la recolección, el aislamiento, el cultivo y el paso de NSPC generados a partir de la región periventricular de la médula espinal adulta de la rata y de donantes de trasplante de órganos humanos.
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Artículo de método
Aislamiento de células neurales madre / progenitoras de la región periventricular de la rata de Adultos y de la médula espinal humana
En este artículo
Resumen
Resumen
Rata adulta y células humanas de la médula espinal neurales madre / progenitoras (NSPCs) cultivadas en medio enriquecido factor de crecimiento permite la proliferación de, y células madre neurales expandibles auto-renovación multipotentes. En condiciones de suero, estas NSPCs multipotentes se diferenciarán, generar neuronas, astrocitos y oligodendrocitos. El tejido recogido se disocia enzimáticamente en una solución de papaína-EDTA y luego disociado mecánicamente y se separa a través de un gradiente de densidad discontinuo para producir una única suspensión celular que se sembró en medio neurobasal suplementado con factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF ), y heparina. Rata adulta NSPCs médula espinal se cultivan como neuroesferas que flotan libremente y adultos NSPCs médula espinal humanos se cultivan como cultivos adherentes. En estas condiciones, NSPCs de la médula espinal del adulto proliferan, marcadores expresas de células precursoras, y se pueden ampliar de forma continua durante el paso. Estas células pueden abe estudió in vitro en respuesta a diversos estímulos, y los factores exógenos puede ser utilizado para promover restricción linaje neural para examinar la diferenciación de células madre. Multipotentes NSPCs o su progenie también pueden ser trasplantadas en diversos modelos animales para evaluar la reparación regenerativa.
Introducción
NSPCs son células multipotentes comprometidas con el linaje neuronal que puede auto renovar y ampliar fácilmente in vitro. Nos referimos a estas células como una población mixta de células madre / progenitoras neurales ya que presentan propiedades de las células madre multipotentes auto-renovación y progenitores más restringidas. NSPCs se encuentran tanto en el cerebro fetal y adulto y la médula espinal 1,2. En el adulto, NSPCs son normalmente quiescente y residen en nichos específicos, incluyendo la zona subventricular recubre los ventrículos laterales 2-4, y la región periventricular que rodea el canal central de la médula espinal
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Protocolo
Todos los animales procedimientos son aprobados por el Comité de Cuidado de Animales de la Universidad Health Network, Toronto ON Canadá, de acuerdo con las políticas establecidas en la Guía para el Cuidado y Uso de Animales Experimentales preparados por el Consejo Canadiense de los Animales. Para la recolección de tejido de la médula espinal humana, la aprobación se obtuvo de la Junta Ética de la Investigación Red de Salud de la Universidad y de la Trillium-regalo de la Fundación Vida, que supervisa la donación de órganos en Ontario, Canadá.
1. Preparación de Disección Los tampones y medios de cultivo
- Para el aislamiento de mé....
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Resultados
Las células de la médula espinal de ratas adultas cultivadas en cultivo en suspensión en un medio EFH formarán pequeños neuroesferas (colonias de células indiferenciadas) dentro de 1 semana de chapado inicial. En cultivos primarios, la mayoría de las células sembradas morirán y las células madre de factor de respuesta de crecimiento se proliferan y se seleccionan en el medio EFH. Por el paso 3, habrá numerosos neuroesferas que flotan libremente alrededor de 100 micras de diámetro (Figura 2A). Neuroesfer.......
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Discusión
Durante la disección de la médula espinal de ratas cuidado el tejido se debe tomar para no dañar la médula espinal en el desempeño de la laminectomía. Es más fácil de aislar el tejido periventricular cuando los segmentos de la médula espinal están intactos. Los segmentos de tejido deben sumergirse plenamente en el tampón de disección y las meninges que recubren y la materia blanca se pueden cortar a medida que tiras longitudinales con micro tijeras. Alternativamente, fórceps de tejidos finos se pueden utilizar para pela.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer el apoyo de Spinal Cord Injury Ontario, el Fondo de Investigación e Innovación de Ontario-China, la Fundación del Hospital General y Occidental de Toronto y la Fundación Physicians' Services Incorporated. Los autores agradecen al Dr. Tasneem Zahir por su asesoramiento experto en el cultivo de NSPC de la médula espinal humana, y a las Dras. Cindi Morshead e Iris Kulbatski por su asesoramiento experto en el aislamiento de NSPC de la médula espinal de rata.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 1x PBS | Life Technologies | #10010023 | Tampón de disección |
| 1x HBSS | Life Technologies | #14175095 | Tampón de disección |
| D-glucosa | Sigma | # G-6152 | Prepare una solución madre de glucosa al 30% para tampón de disección y mezcla de hormonas |
| Penicilina-estreptomicina | Life Technologies | #15140-148 | Tampón de disección y medio de cultivo |
| Neurobasal-A | Life Technologies | #10888-022 Medio de | cultivo |
| L-glutamina, 200 mM | Life Technologies | #25030-081 Medio de | cultivo |
| B27 | Life Technologies | #12587010 | Medio de cultivo |
| DMEM | Life Technologies | #11885084 | Mezcla de hormonas |
| F12 | Life Technologies | #21700-075 Mezcla de | hormonas |
| NaHCO 3 | Sigma | # S-5761 | Prepare una solución madre de NaHCO<3/sub> al 7,5% para la mezcla de hormonas |
| HEPES | Sigma | #H9136 | Prepare 1M de solución madre HEPES para mezcla de hormonas |
| Insulina | Sigma | #I-5500 | Mezcla de hormonas |
| Apo-transferrina | Sigma | #T-2252 | Mezcla de hormonas |
| Putrescina | Sigma | # P7505 | Hormona |
| mix Selenio | Sigma | #S-9133 Mezcla de | hormonas |
| Progesterona | Sigma | #P-6149 Mezcla de | hormonas |
| EGF, Sigma de ratón#E4127 | Prepare 100 μ existencias de g/ml en B27 y alícuotas; Medio EFH | ||
| EGF, Sigma recombinante humano#E9644 | Prepare 100 μ existencias de g/ml en B27 y alícuotas; Medio EFH | ||
| bFGF, Sigma recombinante humano#F0291 | Prepare 100 μ existencias de g/ml en B27 y alícuotas; Medio EFH | ||
| Heparina, 10.000 U | Sigma | #H3149 | Preparar existencias de 27,3 mg/ml en mezcla de hormonas y alícuota; |
| Kit de disociación de papaína | Worthington Biochemicals | #LK003150 | Contiene EBSS, papaína, DNasa, inhibidor de la proteasa ovomucoide con BSA |
| Pentobarbital sódico | Bimeda – Pinzas | DIN 00141704 | |
| HealthInc: Addisons | Fine Science Tools | #11006-12 | Punta estándar dentada; micropunta también disponible |
| Pinzas finas: Dumont #4 | Fine Science Tools | #11241-30 | |
| Microtijeras | Fine Science Tools | #15024-10 | Vannas |
| Rongeurs | Bausch & Mango redondo Lomb | N1430 | |
| 10 mm Placas de Petri | Nunc | 1501 | |
| T25 Matraces de cultivo | Nunc | 156367 | |
| 40 μ m filtro de células de nylon | VWR | CA21008-949 | |
| 6 placas de pocillos | Nunc | CA73520-906 | |
| Matrigel, factor de crecimiento reducido (100x) | Corning | 354230 | Descongele según las instrucciones y congele las alícuotas; use diluido en una proporción de 40 μ l Matrigel: 1 ml SFM |
Referencias
- Gage, F. H. Mammalian neural stem cells. Science. 287, 1433-1438 (2000).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Gritti, A., et al.<....
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Reimpresiones y permisos
