Abstract
Rat adulte et les cellules humaines de la moelle épinière neurales souches / progénitrices (NSPCs) cultivées dans un milieu de croissance enrichi en facteur permet la prolifération des multipotentes, et les cellules souches neurales expansibles auto-renouvellement. Dans des conditions sérum, ces NSPCs multipotentes seront différencier, générer des neurones, des astrocytes et des oligodendrocytes,. Le tissu prélevé est enzymatiquement dissocié dans une solution de papaïne-EDTA et ensuite dissocié mécaniquement et séparés par un gradient de densité discontinu pour obtenir une suspension cellulaire unique, qui est plaqué dans un milieu neurobasal additionné de facteur de croissance épidermique (EGF), facteur de croissance basique des fibroblastes (bFGF ), et de l'héparine. Rats adultes de la moelle épinière NSPCs sont cultivées comme neurosphères flottants et adultes humains NSPCs de la moelle épinière sont cultivées comme cultures adhérentes. Dans ces conditions, adultes de la moelle épinière NSPCs prolifèrent, marqueurs expresses de cellules précurseurs, et peuvent être élargies en permanence lors du passage. Ces cellules peuvent be étudiée in vitro en réponse à divers stimuli, et des facteurs exogènes peuvent être utilisés pour promouvoir restriction de la lignée d'examiner la différenciation des cellules souches neurales. Multipotentes NSPCs ou leur progéniture peuvent également être transplantées dans divers modèles animaux pour évaluer la réparation régénérative.
Introduction
NSPCs cellules multipotentes sont commis à la lignée de neurones qui peut auto renouveler et élargir facilement in vitro. Nous nous référons à ces cellules comme une population mixte de cellules souches / progénitrices neurales car ils présentent des propriétés de cellules souches multipotentes auto-renouvellement et les progéniteurs plus restreints. NSPCs se trouvent à la fois dans le cerveau du fœtus et de l'adulte et la moelle épinière 1,2. Chez l'adulte, NSPCs sont normalement repos et résident dans des niches spécifiques, y compris la zone sous-ventriculaire qui tapisse les ventricules latéraux 2-4, et dans la région périventriculaire entourant le canal central de la moelle épinière de 5,6.
Typiquement, NSPCs sont cultivées comme neurosphères flottants ou comme monocouches adhérentes dans un milieu sans sérum supplémenté avec de l'EGF et bFGF, qui sélectionnent mitogenes pour les populations de cellules souches / progénitrices. Le dosage de neurosphère initialement développé par Reynolds et Weiss 2, est le plus couramment utilisé pour la culture etdévelopper des cellules souches neurales. NSPCs montrent multipotence quand ils sont étalées dans un milieu contenant du sérum exempt de facteur de croissance, se différencier en neurones, astrocytes, oligodendrocytes et. Multipotentes, NSPCs d'auto-renouvellement peuvent être isolés et mis en culture à partir du rongeur adulte moelle épinière lorsque le tissu en culture comprend les régions du canal central 6,7. Un avantage potentiel dans l'utilisation de NSPCs générées lors de la moelle épinière adulte, par opposition à générer des cellules provenant d'autres régions est que ces cellules spécifiques d'un tissu ressemblent plus étroitement les cellules de la moelle épinière qui sont perdues ou endommagées après une blessure ou d'une maladie.
Des travaux antérieurs ont montré que neurosphères dérivées de la moelle épinière adulte humaine ne pouvaient pas être propagées à long terme ou des passages pour générer un nombre suffisant de cellules 8,9. Cependant, avec des modifications dans des conditions de culture, nous avons signalé l'expansion et la transplantation de NSPCs adultes de la moelle épinière humaine dérivés, ce qui démontre que l'auto-renouvellementNSPCs multipotentes et peuvent être isolées à partir de moelle épinière de l'adulte humain de donneurs de transplantation d'organes 10. En premier lieu, l'élimination de la majeure partie de la matière blanche au cours de la dissection et la culture de ces cellules adhérentes sur un substrat dans un milieu de croissance enrichi en facteur choisi pour adultes humains en prolifération NSPCs de la moelle épinière. Dans ce protocole, nous décrivons la récolte de la moelle épinière de rats adultes et à partir de donneurs humains de transplantation d'organes, la dissection du tissu péri-ventriculaire, et l'isolement, la culture et l'expansion de NSPCs.
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Protocol
Toutes les procédures d'animaux sont approuvés par le Comité de protection des animaux de l'University Health Network, Toronto ON Canada, en conformité avec les politiques établies dans le Manuel sur le soin et l'utilisation des animaux d'expérimentation préparés par le Conseil canadien de protection des animaux. Pour la récolte de tissus de la moelle épinière humaine, l'approbation a été obtenue du comité d'éthique de la recherche du University Health Network et de la Trillium-cadeau Life Foundation qui supervise le don d'organes en Ontario, Canada.
1. Préparation de dissection tampons et de la culture des médias
- Pour l'isolement de moelle épinière de rat, de préparer 100 ml de tampon de dissection (PBS 1x + 0,6% de glucose + 2% de pénicilline-streptomycine) et réfrigérer. Pour moelle épinière humaine préparer 100 ml de tampon de dissection (1x HBSS + 0,6% de glucose + 2% de pénicilline-streptomycine) et réfrigérer.
- Préparez 100 ml de milieu sans sérum (SFM) et chaude à 37 ° C. Pour préparer la GFD, ajouter 2 mM de L-glutamine, 100 ug / ml pénicilline-streptomycine, B27 2%, et 10% à l'hormone mélange Neurobasal-A milieu. Pour préparer hormone mélange, faire un rapport 1: milieu / F12 1 DMEM contenant 0,6% de glucose, 3 mM de NaHCO 3, HEPES 5 mM, 25 ug / ml d'insuline, 100 ug / ml d'apo-transferrine, 10 uM de putrescine, 30 nM de sélénium, et 20 nM progestérone.
- Préparez le support de placage de croissance EFH facteur enrichi (à la GDF ajouter 20 ng / ml d'EGF, 20 ng / ml de bFGF, et 2 pg / ml d'héparine) et chaude à 37 ° C. Assurez-vous que EFH humain contient des facteurs de croissance recombinants humains (voir le tableau des matériaux).
2. La récolte et la dissection des adultes Rat périventriculaire moelle épinière Tissue
- Stériliser les instruments de dissection dans l'éthanol et rincer dans une solution saline stérile ou instruments autoclave à l'avance. Donnez rat (6 - 8 semaines) une injection létale de pentobarbital de sodium (1 cc à 65 mg / ml) ou de surdose d'anesthésique (c.-à 4% isofluorane) selon son institution a approuvé le protocole de l'animal. RÉOuse le dos du rat avec 70% d'éthanol et enlever la peau sur la surface dorsale avec de grands ciseaux de dissection.
- Tenir les ciseaux perpendiculaires à la surface dorsale, coupée transversalement la colonne vertébrale au-dessus des membres postérieurs. Utilisez de petits ciseaux pour couper longitudinalement le muscle dorsal recouvrant la colonne vertébrale dans une direction rostrale pour exposer les apophyses épineuses.
- À partir de l'extrémité caudale exposée, insérez rongeurs ou d'un petit instrument de coupe osseuse émoussée extradurally dans la face latérale du canal rachidien dans l'espace entre la moelle épinière et la colonne vertébrale. Faire de petites coupures dans la lame (arcs osseux gauche et à droite des apophyses épineuses de chaque côté des vertèbres) et soigneusement décoller la lame pour exposer la moelle épinière (figure 1A-D). Assurez l'angle des pales est peu profonde et parallèle à la corde afin de la moelle épinière sous-jacente ne soit pas endommagé.
- Continuer laminectomie en direction rostrale aux Expose la moelle épinière thoracique et cervical.
- Exciser doucement la moelle épinière de la colonne vertébrale avec une pince de tissus contondants et utilisation microciseaux à couper soigneusement les racines pour libérer le cordon. Placez la moelle épinière excisée dans une boîte de Pétri contenant 4 ° C tampon de dissection du rat stérile (décrit ci-dessus en 1.1). Rincez le tissu dans un tampon C à dissection 4 ° fraîchement préparé et l'aide de ciseaux coupent la moelle épinière transversalement en segments de 1 cm (figure 1E).
- Pour chaque segment de tissu, utiliser une main pour tenir le tissu avec des pinces fines. Avec l'autre main, utiliser microciseaux à retirer soigneusement les méninges qui recouvrent, la matière blanche, et la plupart de la matière grise à l'aide d'un microscope à dissection. Sinon, utilisez une pince fine (Dumont N ° 4) à se décoller plus de la matière grise et blanche, ne laissant que la région périventriculaire de la moelle épinière qui comprend l'épendyme et une petite quantité de la matière environnante gris (figure 1F-H).
- Mutualiser le tissu périventriculaire disséqué dans un plat de 10 cm de Petri stérile contenant un tampon de dissection du rat froid.
3. La récolte et la dissection des adultes de la moelle épinière humaine périventriculaire Tissue
Remarque: les tissus de la moelle épinière humaine est récolté à partir de donneurs de greffes d'organes adultes (donateurs étaient âgés de 2 à 60 ans) après les autres organes ont été prélevés pour la transplantation d'organes. Le Trillium-cadeau Programme Life du obtient le consentement pour l'élimination des tissus à des fins de recherche de la famille du patient et informe notre équipe de récolte en temps opportun de sorte que nous avons été en mesure de récolter les cordons dans les 2 heures de clampage aortique. Donneurs adultes mâles et femelles ayant une sérologie négative et aucune infection sont acceptées.
- Tissus récolte de façon stérile dans la salle d'opération par une approche antérieure en utilisant la même exposition antérieure déjà disséqué pour le prélèvement d'organes par le transp d'organeséquipe de récolte lant.
- Exposer la colonne vertébrale antérieure par rétraction avec de grandes épandeurs de côtes et grands écarteurs de paddle des tissus et des organes restants, y compris les gros vaisseaux sanguins.
- Utiliser une scie sternale monté avec une longue lame pour couper à travers les disques intervertébraux aux extrémités rostrale et caudale de la longueur désirée de la colonne vertébrale à réséquer. Angle de la scie environ 45 ° dedans pour couper un creux triangulaire de la partie latérale des corps vertébraux arrêt juste avant le canal rachidien.
- Retirer en bloc les aspects médiaux des corps vertébraux des segments souhaités à l'aide d'ostéotomes courbes et un maillet en prenant soin d'éviter de couper à travers la dure-mère. Ensuite, soulevez délicatement la dure recouvert la moelle épinière avec une pince à griffes et fortement inciser les extrémités rostrale et caudale de la moelle. Utilisez longs ciseaux et des pinces à sectionner bilatéralement les racines individuelles.
- Placer le segment excisé de la moelle épinière dans 4 °; Tampon stérile C (1x HBSS + 0,6% de glucose + 2% de pénicilline-streptomycine) dans un grand tube à essai pour le transport vers la chambre de culture de tissu.
- Remarque: En règle générale, un 3 - segment de 6 cm de la moelle épinière de la colonne thoracique supérieure et / ou la mi-à-faible niveau thoracique est enlevé dans la salle d'opération dans des conditions stériles dès que possible après l'arrêt de la circulation et placé dans un tampon stérile froide . Le temps écoulé entre la cessation de la circulation et la suppression de la moelle épinière varie avec le temps nécessaire pour récolter les organes ciblés pour don et a varié de 45 min à 2 h. Si le cœur et les poumons ont également été enlevés, la dissection peut être pris loin rostralement de récolter une partie de la moelle cervicale inférieure ainsi.
- Disséquer les tissus de la moelle épinière humaine dès que possible après la récolte, généralement dans les 3 heures. Retirer la dure-mère et les méninges autres avec une pince. Rincer le tissu de la moelle épinière fraîchement préparé dans du tampon de dissection C à 4 ° C etcouper transversalement en segments de 1 cm.
- Avec l'aide d'un microscope à dissection, exciser les méninges qui recouvrent, la matière blanche, et la plupart de la matière grise en utilisant des pinces de tissus, pinces fines et microciseaux pour chaque segment de tissu. Mutualiser le tissu disséqué périventriculaire, qui comprend l'épendyme et une petite quantité de la matière environnante gris, dans un plat de 10 cm de Petri stérile contenant tampon froid de dissection humaine.
4. Isolement et culture des adultes et Rat NSPCs de la moelle épinière de l'homme
- Effectuez les étapes suivantes de manière aseptique dans une hotte à flux laminaire.
- Émincer le rat ou le tissu disséqué périventriculaire humain dans 1 mm 3 pièces avec microciseaux.
- Enzymatique dissocier le tissu haché avec des enzymes protéolytiques en utilisant le kit de dissociation papaïne comme indiqué dans le tableau des matériaux / réactifs. Note: les composants réactifs comprennent 4 flacons; Vial 1: solution saline équilibrée de Earle (EBSS), Vial 2: containin Papaing L-cystéine et de l'EDTA, Vial 3: désoxyribonucléase I (DNase), Vial 4: inhibiteur ovomucoïde protease avec de l'albumine de sérum bovin (BSA).
Remarque: Remarque: La papaïne est une protéase sulfhydryle qui a une large spécificité pour des substrats protéiques. La papaïne ici est dérivé du latex à partir de la plante de papaye Carica et dégrade la plupart des substrats protéiques plus largement que les protéases pancréatiques. Pendant le processus de dissociation, il ya de l'ADN causant des dommages aux cellules d'être libérés dans le milieu de dissociation qui va augmenter la viscosité et de faire pipetage difficile. Ainsi, la DNase est inclus dans la procédure d'isolement des cellules à digérer l'ADN sans endommager les cellules intactes. Ovomucoïdes glycoprotéine sont des inhibiteurs de protéase utilisés pour inhiber l'activité de la papaïne après l'étape de dissociation.
- À la première utilisation, reconstituer le mélange inhibiteur albumine ovomucoïde (flacon 4) avec 32 ml d'EBSS (1 flacon), puis stocker à 4 ° C et à utiliser pour les isolements ultérieures.Remarque: On obtient ainsi une solution à une concentration efficace de 10 mg d'inhibiteur ovomucoïde et 10 mg d'albumine par ml.
- Ajouter 5 ml d'EBSS (flacon 1) de la papaïne un flacon (flacon 2), ce qui donne une solution à 20 unités de papaïne / ml dans 1 mM de L-cystéine avec 0,5 mM d'EDTA. Vérifier que la solution de papaïne semble clair quand il est complètement dissous, sinon placer le flacon dans un bain d'eau à 37 C ° d'une dizaine de minutes jusqu'à ce que la papaïne est complètement dissous pour assurer la pleine activité de l'enzyme.
- Ajouter 500 ul d'EBSS (flacon 1) dans un flacon de DNase (flacon 3) et mélanger doucement DNase est sensible à la dénaturation par cisaillement. Ajouter 250 ul de la solution de DNase dans le flacon contenant la papaïne, ce qui entraîne une concentration finale d'environ 20 unités / ml de papaïne et 0,005% de DNase. Sauvegardez l'équilibre de la fiole de DNase à utiliser plus tard.
- Placez le rat hachée ou un tissu humain dans la solution de papaïne tel que préparé à l'étape 4.4 ci-dessus. Pour l'isolement de tissu humain, diviser le tissu haché à parts égales entre deuxflacons de papaïne (environ 0,2 g / fiole).
- Incuber à 37 ° C avec agitation constante sur une plate-forme à bascule pour dissocier le tissu dans la solution de papaïne activée. Incuber tissu de rat pendant 45 minutes à 1 heure, et le tissu humain pendant 1 à 2 heures en fonction de la quantité de tissu haché, environ 0,2 à 0,4 g respectivement.
- Triturer le mélange avec une pipette 10 ml de dissocier les morceaux de tissu restants pour donner une suspension de cellules trouble. Transférer la suspension cellulaire (ne pas inclure tous les morceaux de tissu non dissocié) dans un tube stérile conique de 15 ml et centrifuger à 300 g pendant 5 min à température ambiante.
- Remettre en suspension le culot cellulaire dans du milieu contenant de l'ovomucoïde, un inhibiteur de la papaïne.
- Préparer la solution par mélange de l'ovomucoïde 2,7 ml EBSS (flacon 1) avec 300 ul de la solution d'inhibiteur de l'albumine ovomucoïde reconstituée (flacon 4) dans un tube conique de 15 ml. Ajouter 150 pi de solution de DNase (flacon 3) enregistrés à l'étape 4.4 ci-dessus.
- Jeter le surnageant deles cellules en culot et immédiatement remettre en suspension le culot cellulaire dans le mélange d'albumine d'inhibiteur dilué DNase.
- Séparer les cellules intactes les membranes cellulaires par centrifugation à travers une seule étape à gradient de densité discontinu.
- Préparer le gradient de densité discontinu par addition de 5 ml de solution d'albumine-inhibiteur (flacon 4) à un tube de 15 ml, et en utilisant une pipette de 5 ml, doucement et la couche lentement la suspension cellulaire (préparé comme décrit ci-dessus à l'étape 4.8) au-dessus de la solution d'albumine-inhibiteur.
- Centrifuger à 70 g pendant 6 min à température ambiante.
- Remarque: L'interface entre les deux couches de la pente doit être clairement visible, bien que le mélange à cette limite minimal n'a aucune incidence sur le résultat. Fragments membranaires restent à l'interface et cellules dissociées culot au fond du tube.
- Pour les cellules de rat, jeter le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire dans 1 ml de rat moyenne EFH (pré-chauffé à 37 ° C).Compter densité cellulaire en temps réel avec un hémocytomètre et la plaque les cellules dans un flacon de culture T25 à une densité de 10 cellules / ul dans EFH. Le rendement typique de cellules provenant de tissu de rat est d'environ 2 x 10 6 cellules avec environ 80% viability.If cultures clonales sont désirés, les cellules de semence à une densité inférieure à 10 cellules / ul. Incuber les flacons à 37 ° C dans 5% de CO 2 et de permettre aux cultures de se développer au repos pendant 1 semaine pour éviter l'agrégation des sphères.
- Pour les cellules humaines, éliminer le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire dans 10 ml de milieu EFH humaine (pré-chauffé à 37 ° C). On filtre la suspension de cellules à travers un filtre cellulaire en nylon de 40 pm a suivi avec 30 ml d'EFH pour éliminer les fragments de myéline et la membrane cellulaire. Centrifugeuse à 300 g pendant 5 minutes et remettre en suspension le culot cellulaire dans 1 ml de milieu EFH.
- Comptez densité de cellules vivantes avec un hémocytomètre et plaque les cellules humaines dans des plaques de culture à 6 puits à une densité de 10 5 cellules / puits dans un volume total5 ml EFH / puits. Le rendement typique de cellules provenant de tissu humain est d'environ 1 x 10 6 cellules avec environ 70% de viabilité. Puits pré-manteau avec un substrat adhérente comme Matrigel (voir note ci-dessous). Diluer à un ratio de 40 ul Matrigel: 1 ml GDF.
- Remarque: En variante, d'autres substrats tels que adhérentes poly-D-lysine / laminine, la fibronectine, le collagène ou peuvent être utilisés.
- Incuber les plaques à 37 ° C dans 5% de CO 2 et de permettre aux cultures de se développer au repos pendant 1 semaine.
5. Le repiquage du rat adulte et NSPCs de la moelle épinière humains
- NSPCs Rat formeront de petits neurosphères environ 70 m de diamètre à 1 semaine d'ensemencement initial; NSPCs hebdomadaires par la collecte de la suspension cellulaire, la centrifugation à 300 xg pendant 5 min, et trituration mécanique de la boulette de cellules de neurosphères passage dissocier les rats.
- Ensemencer les cellules dissociées dans des flacons T25 contenant rat milieu frais EFH. Alternativement,utiliser milieu de rat climatisé de 50% pour les passages. Le rendement typique de NSPCs de rats à des passages est d'environ 5 x 10 6 cellules qui augmente de façon exponentielle avec le nombre de passages.
- Pour les cultures humaines, une semaine après le dépôt initial, remplacer la moitié du milieu de culture frais avec EFH deux fois par semaine pour permettre aux cellules d'adhérer au substrat. En général, 1 à 2 semaines plus tard, une fois que les cellules ont fixé au substrat, remplacer l'ensemble du volume du milieu de culture deux fois par semaine avec EFH frais.
- cellules Subculture avant d'atteindre la confluence entre 4 - 8 semaines.
- des cellules de sous-culture de cellules détacher du substrat enzymatique (voir le tableau des matériaux) avec 2 ml d'enzyme par puits incubés pendant environ 10 min à 37 ° C. Recueillir suspension cellulaire, centrifuger à 300 g pendant 5 min, et remettre doucement le culot cellulaire dans 1 ml de milieu fraîchement préparé EFH.
- Compter les cellules vivantes avec un hémocytomètre et plaque les cellules dans des plaques de culture à 6 puits (pré-coATED comme ci-dessus à l'étape 4.12) à une densité de 10 5 cellules / puits dans un volume total de 5 ml EFH / puits. Le rendement typique de NSPCs humaines à des passages est d'environ 2 x 10 6 cellules et généralement cela va doubler avec le passage. Généralement, de maintenir les cultures avec 50% de milieu EFH conditionné 2 - 3 fois par semaine entre passages.
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Representative Results
Rats adultes de la moelle épinière cellules cultivées dans une culture en suspension dans un milieu EFH se former de petites neurosphères (colonies de cellules non différenciées) dans 1 semaine de placage initial. Dans les cultures primaires, la plupart des cellules étalées mourront et les cellules souches du facteur sensible croissance va proliférer et sont choisis dans le milieu EFH. Par passage 3, il y aura de nombreux neurosphères flottant librement à environ 100 m de diamètre (figure 2A). Neurosphères sont ronds et de la phase-lumineux, et à fort grossissement, MICROspikes ciliées sont considérés comme faisant saillie à partir de cellules à l'extérieur des sphères qui sont caractéristiques de neurosphères contrairement amas de débris cellulaires (figure 2B). Le rendement typique des cellules de tissu de rat est d'environ 2 x 10 6 cellules avec environ 80% de viabilité. Les neurosphères ne doivent pas être ensemencées à une densité trop élevée pour éviter l'agrégation d'amas cellulaires. En outre, de grandes neurosphères deviennent difficiles à dissocier et les cellules deviendrontnécrotique dans le centre de la sphère. Ce sera également se produire si les cultures sont laissées trop longtemps avant repiquage. Dans la culture EFH, rat adulte NSPCs prolifération de la moelle épinière (figure 2C) et expriment la nestine (figure 2D) un marqueur pour des cellules précurseurs, et de faibles niveaux de marqueurs neuronaux matures (données non présentées).
Moelle épinière adulte humaine CNPS cultures ne poussent pas aussi rapidement que les cultures CNPS de rat. Si des cellules humaines de la moelle épinière sont initialement mises en culture en suspension, ils vont former des agrégats et des amas irréguliers de petits nombres de cellules associées à débris (Figure 3A). Après des passages de ces cultures ne favorise pas l'enrichissement de la population NSPC. Toutefois, lorsque les cellules humaines sont ensemencées dans EFH sur une monocouche adhérente, les NSPCs de facteur de croissance sensible adhèrent au substrat (figure 3B) et le remplacement ultérieur de médias supprime la myéline et des débris cellulaires (figure 3C). Le rendement typique de caunes de tissu humain est d'environ 1 x 10 6 cellules avec environ 70% de viabilité. Lorsque les cultures CNPS humains est bien établi comme un monocouche adhérente, les NSPCs aussi peuvent être étalées dans des cultures en suspension pour former des neurosphères flottant librement. Dans la culture EFH, NSPCs adultes de la moelle épinière humains prolifèrent (Figure 3D) et expriment la nestine (figure 3E) et Sox2 (figure 3F), un facteur de transcription montré à être exprimé par les cellules souches neurales et de très faibles niveaux de marqueurs neuronaux matures (données pas montré).
Figure 1. laminectomie de moelle épinière de rat et la dissection de la région périventriculaire. (A) à l'extrémité caudale exposée de la moelle épinière, rongeurs sont insérés extradurally dans la face latérale du canal rachidien. (B) les petites coupures sont faites dans la lamina sur chaque side des vertèbres et de la lame est soigneusement décollée pour exposer la moelle épinière. (C) La moelle de la moelle cervicale exposée après laminectomie. (D) Schéma de section vertébrale thoracique montrant la moelle épinière et l'emplacement des coupes faites pour laminectomie (représenté avec des lignes en pointillés rouges). Les lames et apophyse épineuse (région ombragée) sont supprimés. (E) La moelle épinière est coupée transversalement en segments de 1 cm. (F) Les méninges recouvrant, la matière blanche, et la plupart de la matière grise est soigneusement enlevé en utilisant microciseaux. (G ) tissus périventriculaire hachée. (H) transversale de la section de moelle épinière de rat taché de luxol rapide hématoxyline et de l'éosine bleu et avec des pointillés montrant région périventriculaire disséqué. S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Adulte rat NSPCs de la moelle épinière. (A) par le passage 3, de nombreux neurosphères sont vu quand rat épinière NSPCs de la moelle sont cultivés en flottement libre-culture en suspension. (B) Neurosphères sont en phase lumineux et MICROspikes dépassant des neurosphères (flèches ) sont visibles à fort grossissement. (C) (neurosphères dissociées passage 3, 4 jours) sont étalées sur des puits revêtus Matrigel en milieu EFH, fixes, et immunocolorées et de contraste avec Hoechst pour visualiser noyaux (bleu). Dans des conditions EFH, rat adulte NSPCs moelle épinière prolifèrent (comme montré avec Ki67 immunologique), et (D) de la nestine principalement express. S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Figure 3. adultes humains NSPCs de la moelle épinière. (A) Lorsque initialement plaquées dans des flacons de culture, adultes humains NSPCs de la moelle épinière ne poussent pas bien. Les cultures primaires flottant librement dans un milieu EFH (13 jours après placage) montrent des agrégats de cellules et les débris. (B) En revanche, dans les cultures adhérentes primaires dans EFH, NSPCs ont fixé au substrat Matrigel (flèches), représenté à 17 jours après placage, et (C) à 41 jours in vitro. (D) dans un milieu EFH, adultes humains NSPCs de la moelle épinière prolifèrent, comme montré avec Ki67 immunocoloration (26 jours in vitro présentées), et principalement express (E) de la nestine (26 jours à vitro présentées) et (F) Sox2 (66 jours in vitro présentées). Noyaux sont contre avec Hoechst (bleu)./ftp_upload/52732/52732fig3large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Au cours de la dissection de la moelle épinière soins de tissu de rat doivent être prises pour ne pas endommager la moelle épinière tout en effectuant la laminectomie. Il est plus facile d'isoler le tissu périventriculaire lorsque les segments de la moelle épinière sont intacts. Les segments de tissus devraient être complètement immergés dans un tampon de dissection et les méninges recouvrant la matière blanche et peuvent être découpées en bandes longitudinales avec microciseaux. Alternativement, forceps de tissu fines peuvent être utilisés pour peler la matière blanche loin.
Pour la procédure d'isolement pour NSPCs, nous avons utilisé une méthode de dissociation de la papaïne, de l'EDTA combiné à une trituration mécanique de dissocier le rat et le tissu de la moelle épinière humaine. Comparé à d'autres protéases, la papaïne est moins dommageable, mais efficace, comme indiqué précédemment avec dissociation de rat postnatal neurones corticaux 11. Nous avons trouvé que la dissociation avec seulement trituration mécanique, souvent utilisé avec des tissus foetaux, ne soit pas aussi efficace avec les tissus de l'adulte. Après èmee dissociation enzymatique, la trituration mécanique est important de briser les fragments de tissus restants. Une trituration avec de dispersion de cellules avec une pipette répétitive doit être effectuée de sorte qu'il n'y a pas de fragments de tissus intacts restants résultant en une suspension de cellules trouble. Cependant, la trituration ne doit pas être effectuée trop fortement pour éviter la formation de bulles de suspension cellulaire et la mort cellulaire résultant.
Pour les passages, neurosphères de rat sont dissociées en une suspension cellulaire unique par trituration mécanique, comme cela a été décrit à l'origine 2. Cependant, neurosphères peuvent également être dissociées en utilisant des procédés enzymatiques tels que la trypsine-EDTA qui ne sera pas endommager les récepteurs de surface cellulaire ou d'interférer avec la formation de sphère dans la mesure où l'exposition est brève 12 enzymatique.
Il existe un certain nombre d'avantages en utilisant l'essai de culture de neurosphères NSPCs. Il est relativement simple, reproductible, et permet l'expansion rapide de cel souches neuralesls 2,12. Cependant, neurosphères sont hétérogènes composé principalement de cellules progénitrices qui sont plus restreinte et seulement un petit nombre de cellules souches. Plusieurs facteurs tels que la densité de cellules et la technique de passages susceptibles d'affecter le phénotype de la culture, et peuvent également former des neurosphères à partir de cellules progénitrices 13. Neurosphères sont très mobiles et peuvent fusionner, même dans des conditions de faible densité cellulaire 14. Ainsi, le nombre de neurosphères en culture ne représente pas le nombre de cellules souches. Pour distinguer les cellules souches neurales à partir de cellules progénitrices, on devrait utiliser le neural formant colonie essai de cellule 15,16.
Rats adultes de la moelle épinière NSPCs poussent bien que neurosphères en culture en suspension dans EFH complétées moyen et sont facilement extensibles. En revanche, nous avons constaté que NSPCs adultes de la moelle épinière humaine poussent mieux comme une monocouche adhérente 10. Cellules souches neurales humaines dérivé du cerveau peuvent être maintenus à long terme dans monocouche culteure dans un milieu chimiquement défini, en présence d'agents mitogenes qui favorisent leur capacité proliférative 17,18. Comme décrit dans ce protocole, NSPCs peuvent être isolées de la moelle épinière adulte humaine à partir de donneurs de greffes d'organes et de passages et élargis comme une monocouche adhérente en présence d'EGF, bFGF, et l'héparine 10. Il est plus facile d'isoler NSPCs de moins de donneurs plus âgés que les cellules développer plus rapidement, même si NSPCs pourraient encore être isolés à partir de donneurs à notre âge maximum de 60 ans 10. Nous avons examiné une variété de substrats tels que adhérentes Matrigel, de la fibronectine, du collagène de type I, et la poly-D-lysine / laminine, et ceux-ci ont trouvé pour être efficace pour l'adhérence de la moelle épinière adulte humaine NSPCs 10. Initialement, les deux cultures de neurosphères et adhérentes contiennent des agrégats cellulaires, les débris et les cellules mortes. Cependant ces débris est progressivement éliminé avec repiquage et de la croissance à moyen neurobasal facteur enrichi sélectionne pour les NSPCs proliférantes. Aussi les débris et la contamination de la myéline peuvent être réduits avec dissection minutieuse et l'enlèvement de la matière blanche des segments de tissu de la moelle épinière. Filtrage de la suspension de cellules résultante à travers un filtre avant le placage supprime également la myéline.
Nous avons cultivées adultes humains NSPCs de la moelle épinière que monocouches adhérentes pour au moins 9 mois impliquant environ 10 passages, bien que dans les cultures anciennes, il ya un risque accru d'anomalies chromosomiques. Nous avons effectué l'analyse du caryotype sur NSPCs humains cultivés pendant 4 mois et a trouvé un caryotype diploïde normal sans anomalies chromosomiques (données non présentées). Nous avons également constaté que la prolifération des cellules et la capacité de se différencier en oligodendrocytes ont diminué avec l'augmentation du temps dans la culture. Par exemple, le pourcentage de cellules positives par rapport O4 est passée de 1,3% à 1 mois de culture à 0,01% à 4 mois en culture 10. Le rat et le NSPCs humains se prêtent à la cryoconservation utilisant congélation norme rencontréauges et montrent aucune différence significative dans le profil phénotypique.
L'isolement et l'expansion de NSPCs pluripotentes en culture pendant plusieurs permet dans les applications in vitro, y compris l'examen des divers facteurs sur la différenciation des cellules souches neurales adultes. Augmentation du nombre de NSPCs peuvent être générés in vitro et transplantées comme une blessure de la moelle épinière, les AVC et les maladies neurodégénératives pour examiner la réponse réparatrice de ces cellules souches neurales in vivo dans des modèles animaux.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x PBS | Life Technologies | #10010023 | Dissection buffer |
| 1x HBSS | Life Technologies | #14175095 | Dissection buffer |
| D-glucose | Sigma | # G-6152 | Prepare 30% glucose stock solution for dissection buffer and hormone mix |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | #15140-148 | Dissection buffer and culture medium |
| Neurobasal-A | Life Technologies | #10888-022 | Culture medium |
| L-glutamine, 200 mM | Life Technologies | #25030-081 | Culture medium |
| B27 | Life Technologies | #12587010 | Culture medium |
| DMEM | Life Technologies | #11885084 | Hormone mix |
| F12 | Life Technologies | #21700-075 | Hormone mix |
| NaHCO3 | Sigma | # S-5761 | Prepare 7.5% NaHCO3 stock solution for hormone mix |
| HEPES | Sigma | #H9136 | Prepare 1M HEPES stock solution for hormone mix |
| Insulin | Sigma | #I-5500 | Hormone mix |
| Apo-transferrin | Sigma | #T-2252 | Hormone mix |
| Putrescine | Sigma | # P7505 | Hormone mix |
| Selenium | Sigma | #S-9133 | Hormone mix |
| Progesterone | Sigma | #P-6149 | Hormone mix |
| EGF, mouse | Sigma | #E4127 | Prepare 100 μg/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium |
| EGF, human recombinant | Sigma | #E9644 | Prepare 100 μg/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium |
| bFGF, human recombinant | Sigma | #F0291 | Prepare 100 μg/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium |
| Heparin, 10,000 U | Sigma | #H3149 | Prepare 27.3 mg/ml stocks in hormone mix and aliquot; EFH medium |
| Papain dissociation kit | Worthington Biochemicals | #LK003150 | Contains EBSS, papain, DNase, ovomucoid protease inhibitor with BSA |
| Sodium Pentobarbital | Bimeda – MTC Animal Health Inc | DIN 00141704 | |
| Tissue Forceps: Addisons | Fine Science Tools | #11006-12 | Serrated standard tip; micro-tip also available |
| Fine Forceps: Dumont #4 | Fine Science Tools | #11241-30 | |
| Microscissors | Fine Science Tools | #15024-10 | Round-handled Vannas |
| Rongeurs | Bausch & Lomb | N1430 | |
| 10 mm Petri dishes | Nunc | 1501 | |
| T25 Culture flasks | Nunc | 156367 | |
| 40 μm nylon cell strainer | VWR | CA21008-949 | |
| 6 well plates | Nunc | CA73520-906 | |
| Matrigel, growth factor reduced (100x) | Corning | 354230 | Thaw according to directions and freeze aliquots; use diluted at a ratio of 40 μl Matrigel: 1 ml SFM |
References
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