Análisis cuantitativo de los Defectos de escalada en un modelo de Drosophila de enfermedades neurodegenerativas

Summary

Presentamos un ensayo de geotaxis negativo optimizado, barato y fiable en Drosophila melanogaster como modelo para trastornos neurodegenerativos. Al ser más sensible a los defectos locomotores leves, este ensayo ayudará a detectar posibles interacciones genéticas y objetivos farmacológicos.

Abstract

Defectos locomotores resultantes de trastornos neurodegenerativos pueden ser un síntoma de aparición tardía de la enfermedad, después de años de degeneración subclínica, y por lo tanto las estrategias actuales de tratamiento terapéutico no son curativos. Mediante el uso de toda la secuenciación del exoma, un número creciente de genes han sido identificados para jugar un papel en la locomoción humana. A pesar de la identificación de estos genes, no se sabe cómo estos genes son cruciales para el funcionamiento normal locomotora. Por lo tanto, un ensayo fiable, que utiliza organismos modelo para dilucidar el papel de estos genes con el fin de identificar nuevas dianas de interés terapéutico, se necesita más que nunca. Hemos diseñado una versión sensibilizada del ensayo geotaxis negativas que permite la detección de defectos más leves anteriormente y tiene la capacidad para evaluar estos defectos en el tiempo. El ensayo se realiza en un cilindro de vidrio, que se sella con una película de barrera de cera se graduó. Al aumentar la distancia de umbral para ser subido a 17,5 cm y el aumento de la duración de la prueba a 2 min hemos observado una mayor sensibilidad en la detección de disfunciones de movilidad suaves. El ensayo es rentable y no requiere de una amplia formación para obtener resultados altamente reproducibles. Esto hace que sea una excelente técnica para el cribado de fármacos candidatos en los mutantes de Drosophila con defectos de locomoción.

Introduction

Trastornos neurodegenerativos devastadores como la enfermedad de Parkinson, la esclerosis lateral amiotrófica, y la paraplejía espástica hereditaria se reconocen cada vez más. Desafortunadamente, la mayoría de estos trastornos neurodegenerativos siguen sin tratamientos. El uso clínico generalizado de las pruebas genéticas, imparciales en todo el genoma como la secuenciación del exoma conjunto ha llevado a un creciente número de genes están implicados en los trastornos locomotores humanos. A pesar de este progreso, la progresión patológica desde temprano a las etapas finales de los años, sigue siendo difícil de alcanzar en estos trastornos. Drosophila ofrece uno con las herramientas genéticas para el estudio de requerimiento de genes de una manera espacial y temporal controlada. Además, Drosophila ha demostrado ser útil en el cribado de fármacos para enfermedades neurológicas como el Parkinson ^{1, 2} Alzheimer, discapacidad intelectual y epilepsia ^{3,4 5,6} entre otros. Nuestro objetivo era desarrollar un rentabley ensayo fiable que permita análisis de alto rendimiento que todavía sería lo suficientemente sensible para detectar pequeños cambios en el rendimiento del motor.

Hay varios ensayos utilizados para cuantificar los efectos de la mutación genética y / o condición ambiental en el comportamiento de escalada Drosophila. La mayoría de los ensayos de sacar provecho de la tendencia natural de las moscas para subir, conocidos como geotaxis negativos, o el ensayo de escalada. Benzer ⁷ sugirió en 1967 que el aparato de contracorriente utilizado para el estudio de phototaxis también podría ser utilizado para estudiar gravitaxis. Desde entonces, Ganetsky ⁸ y muchos otros ^{9 -12} se han basado en el ensayo inicial. El principio es colocar un número conocido de moscas en un vial y toque el vial firmemente contra una superficie dura, haciendo que las moscas que caen al fondo del vial. Como se trata de un comportamiento innato, las moscas se intentan subir a la parte superior del vial, se opuso a la gravedad. Este ensayo es cuantitativo y measures cuántas moscas han subido más allá de un marcador en el vial durante un período de tiempo asignado. Medida de la velocidad en lugar del número total de moscas escalada se ha convertido en un parámetro fiable y se muestra defectos en los casos en que el número de criterios moscas no fue significativa ^13.

El ensayo de escalada ha demostrado ser útil en el estudio de muchos trastornos neurodegenerativos incluyendo la enfermedad de Parkinson ^14. Sin embargo, hemos observado que los defectos de locomotoras pueden no ser detectables en el momento en que la neurodegeneración ya se ve en los estudios patológicos ^14. Así, el uso del ensayo tradicional puede limitar la capacidad de estudiar las primeras etapas de la patogénesis de la enfermedad. La aparición de defectos de locomotoras durante las etapas posteriores de la patología puede reflejar una enfermedad cuya progresión es demasiado avanzado para el rescate completo.

Esto plantea un problema potencial con la sensibilidad del ensayo tradicional de escalada. La incapacidad potencial de la tradicióncional escalada ensayo para detectar defectos leves de la locomotora se puede atribuir a la altura a la que se requieren las moscas a subir. Los tradicionales ensayo de ^15,16 mide el número de moscas que subir con éxito más de una altura de 2 a 5 cm de 10 a 20 seg.

Protocol

La investigación sobre Drosophila melanogaster se encontraba en cumplimiento con la Universidad de las pautas de investigación de Alberta.

1. Fly Colección

1. Suma 20 moscas utilizando CO _{2 (g)} anestesia y colocar en un vial de recogida 25 mm x 95 mm que contiene alimentos.
2. Tienda viales que contienen moscas horizontalmente para evitar atrapar moscas en cualquier líquido que pueda acumularse en la parte inferior del vial.
3. Incubar las moscas durante al menos 21 horas a 22 ° C a 45% de humedad en una incubadora durante aproximadamente durante 15 horas. Establezca la incubadora con una luz de 12 horas: oscuridad ciclo.

Ensayo 2. Escalada

1. A la mañana siguiente, la transferencia de 20 moscas de un solo vial en un vaso de 250 ml cilindro graduado. Marque la posición del cilindro para mantenerla constante todos los días. Utilice un cilindro de vidrio por genotipo para evitar la contaminación cruzada entre los genotipos. Lavar al final de cada experimento y roTate los entre los genotipos.
   1. Llevar a cabo los experimentos en la luz ambiental (o luz roja si hay un posible defecto en la visión) a la temperatura y la humedad de 22 ° C y 40% respectivamente. Para evitar confundir ritmo circadiano, siempre realizar experimentos en el mismo momento del día.
2. Selle la parte superior del cilindro con una película de barrera (película de cera) para evitar cualquier escape de las moscas (Figura 2).
3. Configure la cámara de vídeo en un trípode. Cámara Enfoque en la línea de 190 ml de los 250 ml cilindro graduado (17,5 cm).
4. Contar el número de moscas muertas en la parte inferior del cilindro y en los viales de alimentos. Anote este número como la mortalidad.
5. Muy golpee suavemente el cilindro contra una almohadilla de espuma de célula cerrada en varias ocasiones con la fuerza suficiente para desplazar a las moscas a la superficie inferior interna. Toque 5-10 veces, mientras con la otra mano para presionar registro en la cámara.
6. Pulse el botón "Grabar" en la cámara.
7. Inicie la video grabación de la cámara y toque el cilindro de seis veces en un patrón no-rítmica distinta.
8. Llevar a cabo cada ensayo durante 2 minutos desde el momento en que las moscas están última intervenidos y registre el número de moscas que cruzan la altura de 17,5 cm (190 ml) en cada punto de tiempo elegido (cuantificar cada 10 seg). Nota: La ml marcado en el cilindro variará de un modelo de cilindro a otro dependiendo de diámetro. Para evitar errores, medir la altura de cada cilindro utilizado.
9. Una vez que el juicio ha terminado, a disponer de moscas en etanol al 95%.
10. Repita los pasos 2.1 a 2.9 hasta que todas las réplicas se han probado con moscas frescos en todo momento.
    Nota: Aunque 5 repeticiones pueden ser lo suficientemente con una mutación que tiene un fuerte efecto sobre la locomoción, 10 réplicas biológicas de 20 moscas (moscas) 200 se recomienda para detectar diferencias más pequeñas.
11. Al finalizar el experimento, lavar los cilindros en el lavavajillas de laboratorio y O seco N para ser reutilizado /.

3. Análisis

1. Analyvídeos ze de cada vuelan juicio. Cada 10 segundos, registra el número total de moscas que pasan la línea de meta.
   1. Si una mosca sube de nuevo hacia abajo o se cae, ficha que vuelan como -1 y contar la próxima marcha para cruzar la línea de meta como el mismo número que la mosca que subió de nuevo hacia abajo o cayó. Por ejemplo, si el 15 ^de mosca cae por debajo de la línea de meta, la próxima marcha para cruzar la línea (los 16 ^º vuelan) se considera la marcha 15 ^y no ^el 16.
2. Reste la mortalidad por el número total de moscas (20) para obtener el número de moscas que permanecen en el juicio. En cada punto de tiempo, obtener la fracción de moscas por encima de la línea de meta.
3. Sinopsis cada porcentaje en cada momento (ver Figura 3).
4. Analizar el rendimiento en el punto de datos 120 seg y realice estudiante t-test cuando 2 grupos están presentes o ANOVA y un post-test para comparaciones múltiples (con modificación de Bonferroni para planificarse y Tukey para co no planificadomparisons). La prueba de Kolmogorov-Smirnov ¹⁷ también se lleva a cabo para determinar la normalidad y la igualdad de varianza, sino también para comparar las distribuciones del grupo mutante con el control.
5. Para presentar los datos sobre el envejecimiento, trazar el porcentaje de moscas subiendo a 120 seg con moscas de diferentes edades (2 días, 1 semana, 2 semanas) para ver si hay un déficit progresivo (Figura 4).

Results

La escalada es un comportamiento fuerte y reproducible. De hecho, un día de edad de tipo salvaje moscas alcanzan el rendimiento escalada distancia objetivo rápidamente (25-30 seg). Moscas mutantes presentan una gama de rendimiento de leves (o retardada) para completar la imposibilidad de subir a la meta. Ilustramos esta aquí con dos alelos mutantes diferentes. El primero es un alelo severa de la Spastin gen causado por una deleción completa del gen Spastin (balnearios ^{5,75) 18.} En esta línea (balnearios ^...

Discussion

Drosophila ya ha demostrado ser un excelente modelo en la enfermedad ¹⁴ y otras condiciones neurodegenerativas ^1,2 de Parkinson. Además de las herramientas genéticas disponibles en Drosophila, su genoma está altamente conservada de genes implicados en los trastornos neurológicos ^19. El advenimiento de los métodos de detección genética del genoma de ancho (incluyendo la secuenciación del exoma) es probable que continúe para proporcionar una lista más grande de genes cand...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
		de Drosophila	Las poblaciones se seleccionan en función de los experimentos. La temperatura y la humedad en la habitación y en la incubadora deben ser controladas y constantes para evitar que las moscas estén demasiado estáticas o demasiado húmedas.
Cámara de			Cualquier videocámara digital servirá. Asegúrese de que puedan enfocar objetos cercanos.
Cilindro graduado	Kimble	20028W	Los diferentes modelos de cilindro graduado pueden tener diferentes diámetros. Por lo tanto, es importante medir la altura.
Computadora			Cualquier modelo servirá. Usamos la computadora para monitorear el ascenso de las moscas y registrar el número de moscas en cada punto de tiempo.