Kvantitativ analyse av Klatring Defekter i en Drosophila Model nevrodegenerative lidelser

Abstract

Lokomotiv defekter som følge av nevrodegenerative lidelser kan være en sen debut symptom på sykdom, etter år med subklinisk degenerasjon, og dermed dagens terapeutiske behandlingsstrategier ikke er kurativ. Gjennom bruk av hele exome sekvensering, er det identifisert et økende antall gener for å spille en rolle i human bevegelse. Til tross for å identifisere disse genene, er det ikke kjent hvordan disse genene er avgjørende for normal lokomotiv fungerer. Derfor kan en pålitelig analyse som benytter modellorganismer for å belyse rollen til disse gener for å identifisere nye mål av terapeutisk interesse, trengs mer enn noensinne. Vi har utviklet en sensitivisert versjon av den negative geotaxis analysen som gir mulighet for påvisning av defekter mildere tidligere og har evnen til å evaluere disse feilene over tid. Analysen utføres i en glassmålesylinder, som er forseglet sammen med en voks barrierefilm. Ved å øke terskelen avstanden som skal klatret til 17,5 cm og øke eksperiment varighet til 2 min vi har observert en større følsomhet i å oppdage milde mobilitet dysfunksjoner. Analysen er kostnadseffektivt og krever ikke omfattende opplæring for å oppnå meget reproduserbare resultater. Dette gjør det til et utmerket teknikk for screening kandidat narkotika i Drosophila mutanter med locomotion defekter.

Introduction

Ødeleggende nevrodegenerative sykdommer som Parkinsons sykdom, amyotrofisk lateral sklerose, og arvelig spastisk paraplegi blir stadig mer anerkjent. Dessverre, de fleste av disse nevrodegenerative lidelser er fortsatt uten behandling. Den utbredte klinisk bruk av genom-wide, objektive genetiske tester som hele exome sekvensering har ført til et økende antall gener som blir innblandet i menneskelige lokomotiv lidelser. Til tross for denne fremgangen, den patologiske progresjon fra tidlig til sene stadier, fortsatt ukjent i disse lidelsene. Drosophila gir ett med de genetiske verktøy for å studere gen krav på en kontrollert romlig og tidsmessig måte. I tillegg, har vist seg nyttig i Drosophila screening av legemidler for nevrologiske tilstander så som Parkinsons ^1, Alzheimers ^2, utviklingshemming ^3,4 og epilepsi ^5,6 blant andre. Vårt mål var å utvikle en kostnadseffektivog pålitelig analyse som ville tillate høy gjennomstrømning analyse som fortsatt vil være følsom nok til å detektere små forandringer i motorytelse.

Det er flere analyser som brukes til å kvantifisere effektene av genetisk mutasjon og / eller miljøtilstanden på Drosophila klatring atferd. De fleste av analysene kapitalisere på den naturlige tendens fluer å klatre, kjent som negative geotaxis eller klatre analysen. Benzer ⁷ foreslått i 1967 at motstrømsapparat som brukes for å studere phototaxis kan også brukes til å studere gravitaxis. Siden da har Ganetsky ⁸ og mange andre, ^{9 -12} bygget på den innledende analysen. Prinsippet er å plassere et kjent antall fluer i hetteglass og trykk ampullen sterkt mot en hard overflate, forårsaker fluene til å falle til bunnen av flasken. Som det er en medfødt oppførsel, vil fluene forsøker å klatre til toppen av beholderen, i motsetning til tyngdekraften. Denne analysen er kvantitativ og måleres hvor mange fluer har klatret forbi en markør på hetteglasset under en tidsfristen. Måling av hastigheten istedenfor totale antall fluer klatring har blitt en pålitelig parameter og vist defekter i de tilfeller hvor antall fluer kriterier var ikke signifikant ^13.

Klatre analysen har vist seg nyttige ved studiet av flere neurodegenerative forstyrrelser inkludert Parkinsons sykdom ^14. Men vi bemerket at lokomotiv feil ikke kan påvises på tidspunktet hvor neurodegenerering allerede sett i patologiske studier ^14. Således kan bruk av den tradisjonelle analysen begrense muligheten til å studere de tidlige stadier av sykdommen patogenesen. Utseendet til lokomotiv mangler i senere stadier av patologi kan gjenspeile en sykdom som har progresjon er for avansert for komplett redning.

Dette reiser et potensielt problem med følsomheten til den tradisjonelle klatring analysen. Potensialet manglende evne til tradielle klatring assay for å påvise mild lokomotiv defekter kan tilbakeføres til den høyde til hvilken fluene er nødvendig for å klatre. De tradisjonelle assay ^15,16 måler antall fluer for å kunne klatre over en høyde på 2 til 5 cm i 10 til 20 sek.

Protocol

Forskning på Drosophila melanogaster var i samsvar med Universitetet i forsknings retningslinjer Albertas.

1. Fly Collection

1. Samle 20 fluer ved hjelp av CO _{2 (g)} anesthetization og plasser i en 25 mm x 95 mm samling hetteglass med mat.
2. Oppbevar hetteglass som inneholder fluer horisontalt for å unngå overlapping fluer i noen form for væske som kan akkumuleres i bunnen av flasken.
3. Inkuber fluer i minst 21 timer ved 22 ° C ved 45% fuktighet i en inkubator i omtrent i 15 timer. Sett kuvøse med en 12 timers lys: mørke syklus.

2. Klatring analysen

1. Følgende morgen, overføre 20 fluer fra en enkelt hetteglass i en 250 ml glass målesylinder. Markere posisjonen til sylinderen for å holde den konstant hver dag. Bruk en glassylinder per genotype for å hindre krysskontaminering mellom genotypene. Vask huden ved slutten av hvert forsøk og rotate dem mellom genotyper.
   1. Gjennomføre eksperimenter i omgivelseslyset (eller rødt lys hvis det er en potensiell feil i synet) på temperatur og luftfuktighet på 22 ° C og 40% henholdsvis. For å unngå døgnrytme forvirre, alltid utføre eksperimenter på samme tid på døgnet.
2. Forsegle toppen av sylinderen med en barrierefilm (voksfilm) for å forhindre utslipp av fluer (figur 2).
3. Sett opp videokameraet på et stativ. Fokus kamera på 190 ml linje av de 250 ml målesylinder (17,5 cm).
4. Tell antall døde fluer i bunnen av sylinderen og i maten ampuller. Spill dette antallet som dødeligheten.
5. Veldig lett trykk sylinderen mot en lukket celle skum pad gjentatte ganger med nok kraft til å fortrenge fluene til den indre bunnen. Pek på 5 - 10 ganger mens du bruker den andre hånden til å trykke record på kameraet.
6. Trykk på "Record" -knappen på kameraet.
7. Start video kamera opptak og trykk på sylinderen seks ganger i en distinkt ikke-rytmiske mønster.
8. Gjennomføre hvert forsøk for 2 min fra tiden fluene er siste tappet og registrere antall fluer krysser høyde på 17,5 cm (190 ml) ved hvert tidspunkt valgt (kvantifisere hver 10 sek). Merk: ml markering på sylinderen vil variere fra én sylinder modell til en annen avhengig av diameter. For å unngå feil, måle høyden på hver sylinder benyttes.
9. Når rettssaken er avsluttet, kast fluer i 95% etanol.
10. Gjenta trinn 02.01 til 02.09 før alle kopiene har blitt testet med nye fluer hver gang.
    Merk: Selv om fem gjentak kan være nok med en mutasjon som har en sterk effekt på bevegelse, er 10 biologiske replikater av 20 fluer (200 fluer) anbefales for å oppdage mindre forskjeller.
11. Ved fullføring av forsøket, vask sylindrene i laboratoriet oppvaskmaskin og tørr O / N for å brukes på nytt.

3. Analyse

1. Analyze videoer av hvert fly rettssaken. Hvert 10 sek, ta det totale antall fluer som passerer målet linjen.
   1. Hvis et fly klatrer ned eller faller, registrere at fly som -1 og telle neste fly å krysse mål-linjen som samme nummer som den flua som klatret ned igjen eller falt. For eksempel, hvis 15 ^th fly faller under målet linjen, til det neste fly krysser linjen (16 ^th fly) blir betraktet ^15. fly og ikke de 16 ^th.
2. Trekk dødeligheten av det totale antallet fluer (20) for å få antallet fluer som forblir i rettssaken. På hvert tidspunkt, få brøkdel av fluer over målet linjen.
3. Plotte hver prosentandel ved hvert tidspunkt (se figur 3).
4. Analysere resultatene på 120 sek datapunkt og utføre student t-test når to grupper er tilstede eller ANOVA og post-test for multiple sammenligninger (med Bonferroni modifikasjon for planlagte og Tukey for uplanlagt comparisons). Den Kolmogorov-Smirnov-tester ¹⁷ er også utført for å fastslå normalitet og lik varians, men også for å sammenligne de fordelinger av det mutante gruppen med kontrollen.
5. Å presentere data over aldring, plotte andelen av fluer klatring på 120 sek med fluer i ulike aldre (2 dager, 1 uke, 2 uker) for å se om det er en progressiv underskudd (figur 4).

Representative Results

Klatring er en sterk og reproduserbar atferd. Faktisk er en dag gamle villtype fluer nå målet avstand klatring ytelse raskt (25 - 30 sek). Mutant fluer presentere et utvalg av ytelse fra mild (eller forsinket) for å fullføre manglende evne til å klatre til målet. Vi illustrerer dette her med to forskjellige mutante alleler. Den første er en alvorlig allel av genet spastin forårsaket av et fullstendig delesjon av genet (spastin spas ^{5,75) 18.} I denne linjen (spas ^5,75 med TM6b) en dag trenger gamle fluer ikke nå WT klatring ytelse selv etter 2 min. Dette mutant linje presenterer med alvorlige defekter, selv når du bruker hetteglasset metoden (figur 1A, B). Fordelen med fremgangsmåten som presenteres her blir mer tydelig når studere en mutant av det samme genet, men med en ufullstendig sletting publisert av samme gruppe (spas ^17-7 med TM3) ^18. I så fall ytelse på opptil 8 dager er normalt (figur 1C-F (figur 3) eller genetisk interaksjon. For ytterligere bevis, inkluderer redning av atferds fenotype med uttrykket av en vill-type protein for genet studert. For interaksjonsstudier, sammenligne fluer som er heterozygote for begge mutasjoner av interesse med fluer som bare har én mutasjon av interesse. Analysen gir også en å overvåke progresjon av klatringen feilen over tid, et viktig aspekt i modellering progressive lokomotoriske forstyrrelser (figur 4). I tillegg, 2 min for å tillate bedre se progresjon av klatring i alvorlige mutanter.

Figur 1. Sammenligning av ulike klatre analyser. For alvorlige mutasjoner ulike grader av klatring defekt kan sees ved hjelp av ulike metoder, men mildere mutasjoner kan ikke påvises med noen analyser. For å demonstrere dette har vi brukt to publiserte mutant linjer for genet spastin:. Spastin ^5-75, som inneholder en fullstendig delesjon av genet og spastin spastin ^17-7, som inneholder en partiell delesjon av spastin genet (A) Først blir klatring vurderes ved å ha fluer klatre til toppen av en tom mat hetteglass. Antall fluer på toppen etter 18 sek er registrert. Ved hjelp av denne protokollen en betydelig defekt er sett i Spast ^5-75 / TM6b sammenlignet med villtype-kontroller (N = 10, p <0,001). (B) Deretter klatreevne blir vurdert ved hjelp av metoden beskrevet her. Klatring er også d efective i samme genotype Spast ^5-75 / TM6b. Forskjellen i ytelse er meget signifikant (N = 5, p <0,001), men gapet i ytelse er større. For mutasjonene vist seg å ha mindre effekt tanken (som inneholder Spast ^17-7 en partiell delesjon av spastin genet), sylinderen metoden presentert her kan være mer sensitive. (C) Ingen signifikant feil er observert med tre dager gamle spast ^17-7 / TM3 med hetteglasset metode (n = 5). (D) Ingen signifikant feil er observert med tre dager gamle spast ^17-7 / TM3 med sylinderen metode (n = 5). (E) en ikke-statistisk trend er kjent med 8 dager gamle spast ^17-7 / TM3 fluer (N = 5). (F), men en betydning er observert i 8 dager gamle spast ^17-7 / TM3 testet med sylinderen fremgangsmåten som presenteres for samme antall replikater (N = 5, p <0,001).rget = "_ blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2. Skjematisk fremstilling av den eksperimentelle oppstilling. 20 fluer blir satt inn i en glassylinder og deretter lukket med en voks barrierefilm. Fluene blir så tappet til bunnen og antall fluer som krysser midtlinjen er tatt opp med et kamera for 120 sek. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3. Representative resultater av klatring forsøket. Prosentandelen av fluer etter å ha passert terskelen linje representeres hvert 10 sekund i løpet av de duratipå av analysen. I dette eksperimentet, 3 genetisk passende kontroller (vill-type, UAS spas -RNAi / +, Elav-GAL4 / +) blir sammenlignet med transgene fluer som inneholder både UAS og GAL4 komponenter (Elav-GAL4 / UAS spa -RNAi). Den UAS spas-RNAi er fra VDRC # 108739. Denne representasjonen åpner for vurdering av graden av klatring for hver genotype. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4. Representant grafen for den aldrende profil. Siden mange lokomotiv lidelser er progressive, er det viktig å skildre utviklingen over tid. På denne grafen er WT fluer i forhold til heterozygot mutanter (spas / vekt) og trans-heterozygote mutanter (spast5-75 / spast17-7) på 2 dager (A) og 8 dager (B)(N = 10, p <0,001). Resultatene er også vist over tid for 120 sek. tidspunkt (C). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Drosophila har allerede vist seg å være en utmerket modell på Parkinsons sykdom ¹⁴ og andre nevrodegenerative tilstander ^1,2. I tillegg til de genetiske verktøy tilgjengelig i Drosophila, er dens genom svært konservert for gener involvert i nevrologiske lidelser ^19. Ankomsten av genom brede genetisk screening metoder (inkludert hele exome sekvensering) vil trolig fortsette å gi en større liste over kandidat gener assosiert med menneskelige bevegelsesforstyrrelser. Utviklingen av behandlinger for disse forholdene vil kreve dyremodeller for å øke vår forståelse av patologien involvert i de tidlige stadiene av neurodegeneration. Bruken av Drosophila og negative geotaxis analysen gir en rimelig og pålitelig metode for å identifisere gener som er involvert i lokomotiv defekter og senere screene kandidat narkotika for fenotype redning. Dette legger til molekylære, elektrofysiologisk, og bildebehandling prøvetrykk tlue kan også bli oppnådd i den samme dyremodell. Bruke klatring analysen, andre har lykkes gjengitt motorfeil på fluer mutant for gener forstyrrende menneskelig bevegelse. Likevel har tidligere forskning vist at patologiske endringer kan gå forut for påvisning av lokomotiv feil av flere dager ^14. Dette fenomenet er også observert i humane nevrodegenerative tilstander der vi snakker om subklinisk endringer. Vi tror at ved å forstå og deretter behandle disse subkliniske forandringer, ville sykdommen modifisering forbedres betraktelig.

Vi presenterer her en modell som gjør det mulig for påvisning av mild locomotion defekter som kan hjelpe med å forstå overgangen fra "presymptomatic til symptomatisk" av nevrodegenerativ patologi ved hjelp av en Drosophila modell. Mange grupper har brukt en kort klatring avstand (5-10 cm), men vi økte avstanden til 17,5 cm som i Palladino et al. ^20. Selv om denne forskjellenmellom klatre høyder kan virke mindre, ble økningen i høyden ment å øke analyse vanskelighetsgrad, og dermed hjelpe til med identifiseringen av de relativt små klatre defekter. Også noen metoder valgt for å belyse toppen av sylinderen med en fiberoptisk lampe, for å dra nytte av phototaxic responsen av voksen Drosophila. Imidlertid kan lyskilden forårsake lysrefleksjon i sylinderen; Dermed er en diffus indirekte fluorescerende lyskilde brukes i stedet. I tillegg kan mutasjon i gener involvert nevrodegenerasjon i øyet påvirke funksjonen og dermed kan påvirke resultatene. Økningen i prøvestørrelse 10 til 20 fluer øker den statistiske kraften i hvert forsøk. I første omgang økte vi dette tallet til så høyt som 30 fluer, men det ble senere redusert for å minimere overbefolkning og samspilleffekter mellom fluer. Prøvene kastes etter en gangs bruk, snarere enn å bli drevet for fire gjentatte forsøk pr prøve, for å eliminere possibility av læring eller tretthet. På grunn av fluer med ekstremt dårlig klatring ytelse, var det mot sin hensikt å ta den tiden som kreves for 50% av fluene å krysse mål-linjen for det kan ta en betydelig mengde tid for disse kriteriene være oppfylt. Snarere fluer ble gitt en varighet på 2 minutter for å krysse mål-linjen. Antall fluer for å krysse linjen ble tatt opp og binned i trinn på 10s, og den resulterende verdi uttrykt som en prosentandel.

Disse forholdene skaper er en mer sensitiv vurdering av en voksen flueklatremuligheter. Mens andre utforminger av analysen er likevel nyttig, kan dette paradigmet vurderes i tilfeller hvor milde tidlige defekter er undersøkt. I tillegg kan denne analysen bidra til å oppdage små endringer i forbindelse med legemiddelforsøk.

En viktig sak er at den negative geotaxis atferd er basert på fluene som blir utnyttet til bunnen av sylinderen. Det er Therefmalm viktig å vurdere andre former for bevegelse, for eksempel på et flatt underlag eller fly. Andre aspekter som motivasjon og sosial interaksjon må vurderes som potensielt forvirre. En annen påminnelse er at analysen presenteres kun tillater en å vurdere bevegelse hos voksne fluer. Dette begrenser muligheten til å skaffe neuropatologiske korrelat for den observerte oppførsel som er meget viktig for å forstå patogenesen av en sykdom. Faktisk har de fleste neuroimaging arbeid er gjort på larven nevromuskulære krysset så langt i Drosophila. Innhenting locomotion atferd i larve kan være et viktig skritt for å trekke direkte sammenheng mellom atferd og patologiske forandringer.

Det er svært viktig å regulere temperaturen og luftfuktigheten ved hvilken fluene er hevet og testet. I tillegg til virkningen på fly utvikling, disse faktorene hatt en viktig effekt på stigning av fluer heves og som er lagret i ikke-ideelle forhold. I presence av økt statisk elektrisitet eller fuktighet, gjorde fluer ikke fungere optimalt. Denne effekten ble ikke lik for alle genotyper, mutant fluer vanligvis blir mer påvirket av slike faktorer enn kontrollene. I tillegg sylindere må vaskes og tørkes skikkelig mellom hvert forsøk.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Drosophila stocks			The stocks are selected depending on the experiments. The temperature and humidity in the room and in the incubator must be controled and consistent to avoid flies being too staticky or too wet.
Video camera			Any digital camcorder will do. Make sure they can focus on close object.
Graduated cylinder	Kimble	20028W	Different models of graduated cylinder may have different diameter. It is therefore imporant to measure the height.
Computer			Any model will do. We used the computer to monitor the climbing of the flies and record the number of flies at each time point.