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La detección de la enfermedad asociada-α-sinucleína por ELISA mejorada en el cerebro de ratones transgénicos que sobreexpresan A53T humano mutado α-sinucleína

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DOI:

10.3791/52752

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30 de mayo de 2015

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1Neurodegenerative Diseases Unit, ANSES - French Agency for Food, Environmental and Occupational Health & Safety, 2Indicia Production, 3AJ Roboscreen GmbH, 4Epidemiology Unit, ANSES - French Agency for Food, Environmental and Occupational Health & Safety, 5Experimental Facilities, ANSES - French Agency for Food, Environmental and Occupational Health & Safety

En este artículo

Resumen

Se describe una ELISA que ofrece un enfoque cuantitativo novedoso. Detecta específicamente alfa-sinucleína asociada a la enfermedad (αSD) en un modelo de ratón transgénico (M83) de sinucleinopatía utilizando varios anticuerpos contra la forma de alfa-sinucleína fosforilada en Ser129 o la parte C-terminal de la proteína.

Resumen

Además de los métodos establecidos como Western blot, se necesitan nuevos métodos para cuantificar rápida y fácilmente asociado a la enfermedad α-sinucleína (aS D) en modelos experimentales de synucleopathies. Una línea de ratón transgénico (M83) sobre-expresión de los aS A53T humanos y desarrollar espontáneamente un fenotipo clínico dramática entre ocho y 22 meses de edad, que se caracterizan por síntomas que incluyen pérdida de peso, postración, y deterioro motor severa, se utilizó en este estudio. Para los análisis moleculares de aS D (aS asociado a la enfermedad) en estos ratones, un ELISA fue diseñado para cuantificar específicamente aS D en ratones enfermos. Análisis del sistema nervioso central en este modelo de ratón mostró la presencia de aS D principalmente en las regiones cerebrales caudal y la médula espinal. No hubo diferencias en la distribución aS D entre diferentes condiciones experimentales que conducen a la enfermedad clínica, es decir, en uninoculado y normalmente envejecimiento ratones transgénicos y en ratones inoculados con extractos de cerebro de ratones enfermos. La detección específica de aS D inmunorreactividad utilizando un anticuerpo contra la Ser129 fosforilada aS por ELISA esencialmente correlacionados con la obtenida por Western blot e inmunohistoquímica. Inesperadamente, se observaron resultados similares con varios otros anticuerpos contra la parte C-terminal de aS. La propagación de aS D, lo que sugiere la participación de un mecanismo de "-prión como", de este modo se puede monitorizar y cuantificar en este modelo de ratón utilizando un enfoque ELISA fácilmente.

Introducción

La mayoría de los métodos actuales para detectar la α-sinucleína asociada a enfermedades (αSD) en modelos experimentales de la enfermedad de Parkinson (EP), como la inmunohistoquímica o el Western blot, son lentos y no cuantitativos. Esta enfermedad neurodegenerativa se caracteriza por la agregación de alfa-sinucleína principalmente en forma de inclusiones que contienen una forma agregada de la proteína presináptica normalmente soluble αS1,2 (cuerpos de Lewy y neuritas de Lewy). Normalmente solo marginalmente fosforilada, αS está hiperfosforilada en su residuo de serina 129 en estas inclusiones3 y puede ser monitoreada por anticuerpos específicamente dirigidos contra αS fosforilado en Ser129, proporcionando así un marcador confiable de la patología.

Investigaciones recientes sugieren que un mecanismo "tipo prion" podría estar involucrado en la propagación de la agregación de αS dentro del sistema nervioso de un paciente afectado4,5. Estos estudios informaron la aceleración de una sinucleinopatía mediante la inoculación de extractos cerebrales que contienen αSD en un modelo de ratón transgénico (M83) que expresa una proteína αS humana mutada A53T asociada con un deterioro motor severo que ocurre a medida que los ratones envejecen6. De la misma manera, la inoculación intracerebral de αS recombinante agregado en el mismo modelo de ratón M83 confirmó la aceleración de la agregación5. La inducción de depósitos de αS fosforilado también se ha reportado después de la inoculación de ratones C57Bl/6 de tipo silvestre con αS recombinante fibrilar o extractos cerebrales de pacientes humanos con DBL7,8. Sacino et al.9 recientemente señalaron que después de la inyección de αS humano fibrilar, se podría inducir una formación generalizada y progresiva de inclusiones de αS cerebral en ratones M83, pero no en ratones transgénicos E46K o ratones no transgénicos en los que las inclusiones de αS inducidas eran transitorias y principalmente restringidas al sitio de inyección. Estudios recientes en monos confirmaron la propagación de agregados de αS después de la inoculación de extractos derivados de EP en especies más cercanas a los humanos10.

El vínculo entre las alteraciones de αS y la enfermedad de Parkinson sugiere que αSD es un biomarcador potencial para la enfermedad de Parkinson11. Un estudio reciente mostró la detección de agregados solubles oligoméricos de α-sinucleína en el líquido cefalorraquídeo (LCR) humano y el plasma como un biomarcador potencial para la enfermedad de Parkinson basado en un sistema ELISA de sándwich convencional que utiliza el mismo anticuerpo para capturar y detectar αS12. Basándose en el mismo método, se reconocieron proteínas multiméricas en muestras biológicas, incluyendo el cerebro, porque hay múltiples copias de epítopos presentes en las formas ensambladas13. Muy recientemente, se detectó αS patológico en el LCR de pacientes con una patología de cuerpos de Lewy probada utilizando tanto un kit ELISA con un anticuerpo altamente específico contra αSD (5G4) como un ensayo de inmunoprecipitación14. Estos métodos podrían diferenciar a los pacientes con EP/DBL de otros tipos de demencia.

La propagación "tipo prion" de la agregación de αS se estudió más a fondo en el modelo de ratón transgénico M83 utilizando un enfoque ELISA diseñado para identificar específicamente αSD15. En este estudio, informamos el protocolo ELISA detallado utilizado para detectar cuantitativamente αSD en ratones enfermos (ya sea inoculados o no con αSD de ratones M83 enfermos) y más especialmente en las regiones cerebrales específicamente dirigidas por el proceso patológico en este modelo de ratón transgénico M834.

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Protocolo

Todos los procedimientos y protocolos con animales estaban en conformidad con la Directiva 86/609 / CEE del Consejo y ratificado por venir, el Comité Nacional Francés para la consideración de la ética en la experimentación animal (protocolo de 11 a 0043) de la CE. Los animales fueron alojados y atendidos en ANSES aprobada de instalaciones experimentales en Lyon (aprobación B 69387 0801).

1. Preparación de ratones

  1. La eutanasia a los ratones mediante una inyección intraperitoneal de dosis letal de pentobarbital de sodio.
  2. Recuperar todo el cerebro del cráneo del ratón y colocarlo en un 35 mm placa Petri de plástico en el hielo hasta la extracción.
  3. Se extrae la médula espinal cervical.
    NOTA: aS Extraer ya sea desde una de las mitades del cerebro después de la sección sagital o de cerebros de ratón disecados, disponible después de los experimentos enumerados en la Tabla 1.
Experiment Ratones
Inóculo (cerebro equivalente) 		Período de supervivencia
(Dpi) 		La mediana / supervivencia máxima
(días de edad) 		aS d detección por ELISA
/ BM / IHC
1 Los ratones inoculados 441 ± 166 419/736 8/8
2 Ratones inoculados (0,2 mg) 150 ± 52 140/241 9/9

Tabla 1. Lista de experimentos realizados en ratones M83. Las inoculaciones se realizaron a las 6 semanas para el experimento 2 en la zona cortical-estriado con 20 l de un homogeneizado de cerebro de un ratón enfermo (1% peso / vol en glucosa al 5%), después de anestesia de 6 semanas de edad ratones homocigotos M83 en un 3% la inhalación de isoflurano. dpi: días después inoculación.

2. aS Extracción de Brain Mitades

  1. Sagitalmente cortó el cerebro para obtener dos mitades. Pesar cada mitad en un tubo que contiene ribolysis bolas de molienda.
  2. Preparar elevado de sal (HS) tampón que contiene 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, NaCl 750 mM, EDTA 5 mM, DTT 1 mM, 1% de fosfatasa inhibidores de la proteasa y cócteles. Añadir tampón elevado de sal a las mitades del cerebro para obtener 20% (peso / volumen) homogeneizados.
  3. Preparar las muestras de las mitades del cerebro utilizando un homogeneizador mecánico a 6,0 m / s para 23 seg dos veces. Después de la primera homogeneización 23 seg, colocar los tubos que contienen los homogeneizados en hielo durante 2 minutos antes de que el segundo ciclo de 23 seg.
  4. Centrifugar las muestras a 1000 xg durante 5 min para eliminar fragmentos cerebrales no molidos. Recuperar los sobrenadantes, se dividen en 200 ml de alícuotas y mantenerlos a -80 ° C para el análisis ELISA posterior.

3. aS Extracción de diseccionado cerebrales Regiones

  1. Diseccionar untodo el cerebro en un 35 mm placa Petri de plástico en el hielo con una lupa de baja potencia (ampliación 8X) utilizando dos forcipes cuyos extremos se mantienen juntos, excepto cuando la disección del hipocampo. No exceda de 10 minutos para preservar la integridad del cerebro. Coloque el cerebro boca arriba y recuperar las regiones cerebrales siguientes en este orden:
    1. Separar una de las dos bulbos olfatorios utilizando fórceps colocados justo detrás de la bombilla. Separe desde el cerebro por un movimiento hacia abajo. Repita esta operación para el segundo foco.
    2. Cuña suavemente las pinzas entre las dos cortezas y moverlo hacia delante para facilitar la disociación de las dos cortezas. Mantener el cerebro en su lugar con uno fórceps, utilizar otra para separar la corteza del hipocampo.
    3. Coloque la pinza 2 mm por debajo de la corteza. Mantener una presión suave sobre las pinzas hasta la parte superior del hipocampo es visible. Despegar la primera parte de la corteza, y repetir con la segunda parte. Utilice las pinzas para separar las dos cortezascomenzando en el hipocampo y moviéndose hacia la parte delantera del cerebro.
    4. Coloque las pinzas abiertas alrededor de uno de los hipocampos. Cierre la pinza en la parte inferior del hipocampo luego retire suavemente, recuperando tanto como sea posible. Repita el procedimiento para el segundo hipocampo.
    5. Coloque las pinzas abiertas debajo de uno de los cuerpos estriados y suavemente separarlo del cerebro. Utilice las pinzas para quitar cualquier corteza restante del cuerpo estriado. Repita este procedimiento para el segundo cuerpo estriado.
    6. Usa los fórceps para deprimir suavemente por 2 mm el contorno del cerebelo para facilitar la separación del cerebelo del cerebro. Coloque la pinza justo detrás del cerebelo y quitarlo moviendo la pinza hacia adelante.
    7. Utilice la parte ancha de las pinzas para levantar el mesencéfalo con el fin de ver claramente donde se une con el tallo cerebral. Hacer una incisión vertical en la unión luego retire el tallo cerebral.
    8. Coloque la pinza detrás del mesencéfalo, que is compuesta de cuatro estructuras redondeadas. Una incisión vertical hasta el mesencéfalo ha sido completamente separado del cerebro restante.
  2. Preparar homogeneizados de% variable (peso / volumen) en tampón HS, dependiendo de la cantidad de tejidos disponibles, es decir, 5% homogeneizado para un peso entre 10 y 30 mg, 10% para un peso entre 30 y 80 mg, y 20% para un peso por encima de 80 mg.
    1. Añadir un volumen adecuado de tampón HS a las regiones cerebrales disecadas para obtener el% esperado de homogeneizado.
    2. Vortex y comprobar que los tejidos están completamente inmersos en el búfer HS.
    3. Homogeneizar las muestras preparadas a partir de las regiones cerebrales disecadas o la médula espinal cervical con un triturador de tejidos compuesta de un tubo de vidrio de borosilicato y dos manos de mortero, A y B.
    4. Verter cada región del cerebro de ser aplastado directamente en el tubo. Inserte mano de mortero A en el tubo y retraerlo. Repita este movimiento alrededor de diez veces para disociar el tejido. A continuación, utilice la maja B para continuac moliendo el tejido con 20 movimientos. La transferencia de los homogeneizados en un tubo de 1,5 ml con una pipeta de transferencia 1 ml.
  3. Centrifugar las muestras a 1000 xg durante 5 min a 4 ° C para eliminar cualquier fragmento cerebrales no molidos. Recuperar los sobrenadantes, dividirlos en 200 ml de alícuotas y mantenerlos a -80 ° C para el análisis ELISA posterior.

4. Detección de aS por ELISA

  1. Diluir los anticuerpos de recubrimiento de 0,01 ng / ml. Utilice-aS policlonal anti conejo o monoclonal clon 42 de anticuerpos en 50 mM Na 2 CO 3 / NaHCO3 (pH 9,6).
  2. Escudo del microplacas de 96 pocillos con 100 l por pocillo de esta solución de revestimiento, y dejar a 4 ° CO / N. Utilice el anticuerpo policlonal de conejo anti-aS en la solución de recubrimiento para ELISA utilizando anticuerpos de detección syn514, clonar 42, LB509, AS11, 4D6 o 8A5. Utilice el clon de anticuerpo monoclonal anti-aS 42 como una solución de revestimientoen combinación con el anticuerpo de detección anti-pSer129 aS.
    NOTA: Si es necesario, las placas pueden mantenerse a 4 ° C durante una semana antes de la prueba ELISA se lleva a cabo.
  3. Utilice un lavador de placas para lavar las placas cinco veces con 300 l de solución salina tamponada con fosfato con 0,05% de Tween 20 (PBST) por pocillo. A partir de este paso hacia adelante, la incubación es a TA.
  4. Añadir 200 l de PBS T20 tampón de bloqueo por pocillo. Agitar durante 1 hora a 150 rpm. Lavar las placas cinco veces con PBST.
  5. Diluir los homogeneizados de cerebro (dilución 1: 100 de los homogeneizados de 20%, 01:50 de los homogeneizados de 10% y 1:25 de los homogeneizados de 5% en PBST BSA 1%), y añadir 100 l a cada pocillo. A continuación se incuba durante 2 horas con agitación a 150 rpm. Lavar las placas cinco veces con PBST.
  6. Añadir los diferentes anticuerpos de detección aS en PBST con BSA 1% en las diluciones mencionadas en la Lista de materiales. Incubar durante 1 hora a 150 rpm. Lavar las placas cinco veces con PBST.
  7. Añadir o bien contra-Ratón o anti-conejo conjugados HRP IgG diluyeron 1: 8000 en PBST suplementado con BSA 1% durante 1 h con agitación a 150 rpm. Lavar las placas cinco veces con PBST.
  8. Añadir 100 l de 3,3 ', solución de 5,5'-tetrametilbencidina (TMB) a cada pocillo e incubar durante 15 min en la oscuridad con agitación a 150 rpm.
  9. Detener la reacción mediante la adición de 100 l de HCl 1 N por pocillo luego medir la absorbancia a 450 nm con el lector de microplacas.
  10. Para el análisis de datos, restar el valor de DO obtenido en un pozo con todos los reactivos excepto las muestras de cerebro de ratón (así en blanco) de los valores de la DO medidos para cada una de las muestras analizadas.

5. Epitope Mapping

  1. Realizar el mapeo de epítopos de acuerdo con el método descrito por Osman 16. En pocas palabras, los péptidos del punto de la secuencia de α-sinucleína humana contiene 12 aminoácidos de nitrocelulosa con 10 aminoácidos que se solapan.
  2. Bloque con 50 mM Tris / tampón NaCl 150 mM pH 10 que contiene 0,05% de Tween 20 y 5% de leche en polvo. Incubar el anticuerpo en solución de bloqueo a una concentración de 2 mg de anticuerpo por ml a 2-10 ° CO / N.
  3. Se lava la membrana tres veces con 50 mM Tris / NaCl 150 mM pH del tampón 10 que contiene 0,05% de Tween 20. Incubar con el anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón conjugado HRP. Lavar la membrana otros cinco veces con el mismo tampón a continuación mancha usando un kit de tinción blot TMB occidental.

6. Análisis estadístico

  1. Utilice el paquete de software de R y nlme para realizar regresiones de efectos mixtos para modelar OD. Para cada comparación, lleve a cabo un modelo de regresión efecto mixto. Use un efecto fijo para distinguir los síntomas de los grupos asintomáticos.
  2. Utilice un efecto aleatorio para reflejar la variabilidad de repeticiones para un ratón dado. Compruebe homocedasticidad mediante el examen de los residuos y, si es necesario, utilice las funciones de varianza para modelar la estructura de la varianza de los errores dentro de los grupos de acuerdo con Pinheiro y Bates 17. Establecer 0,05 como el umbral de significación de P.

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Resultados

En este estudio, las pruebas ELISA utilizadas específicamente identificados aS enfermedades asociadas (aS D) en homogeneizados de cerebro preparados en un tampón de alta sal de ratones enfermos M83. El uso de un anticuerpo que reconoce específicamente pSer129 aS (p = 0,0074), el ELISA distingue fácilmente de edad, ratones enfermos (> 8 meses de edad) de los jóvenes (2-5 meses de edad), los ratones sanos M83 (Figura 1). Varios otros anticuerpos mostraron igualmente altos señales (> 0,6 O...

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Discusión

El uso de un ELISA se demostró para detectar específicamente aS D directamente a partir de homogeneizados de cerebro de ratón durante la enfermedad en el modelo de ratón transgénico M83. De hecho, este ELISA podría distinguir fácilmente los ratones M83 enfermos de ratones sanos M83 utilizando homogeneizados de cerebro solamente enteros en tampón elevado de sal.

Los pasos más importantes para los resultados exitosos que utilizan este ELISA son: disección correctamente las diferente...

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Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses para divulgar.

Agradecimientos

Los autores desean agradecer a Damien Gaillard para inoculaciones y el seguimiento de los experimentos con animales. Este trabajo fue apoyado por la ANSES (Agencia Francesa para la Alimentación, Medio Ambiente y Salud Ocupacional y Seguridad) y por una beca de la Fundación France Parkinson.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
LB509Abcamab27766Anticuerpo de detección 1/2,000
AS11Producido en AnsesAnticuerpo de detección 1/1,000
4D6Abcamab1903Anticuerpo de detección 1/2,000
PSer129Abcamab59264Anticuerpo de detección 1/3,000
PSer129 EP1536YAbcamab51253Anticuerpo de detección 1/1,000
syn514Abcamab24717Anticuerpo de detección 1/500
clone 42BD Biosciences610787Anticuerpo de recubrimiento y detección (1/2,000)
8A5Proporcionado por el Dr. AndersonAnticuerpo de detección 1/2,000
anticuerpo policlonal anti-α-synMilliporeAB5038PAnticuerpo de recubrimiento
Conjugado HRP anti-IgG de ratónSouthern Biotech1010-05
Conjugado HRP anti-IgG de conejoSouthern Biotech4010-05
Conjugado HRP anti-IgG de cabra de ratónDianova115-035-164
HS bufferAjustar a pH 7.5 y mantener a 4 °C
  • Tris-HCl 50 mM
Euromedex26-128-3094-B
  • NaCl 750 mM
Euromedex1112-A
  • EDTA 5 mM
EuromedexEU0007-B
  • DTT 1 mM
Sigma43815
PBSAjustar a pH 7.5
  • Na2HPO4 1 mM
Euromedex1309
  • KH2PO4 1.5 mM
Euromedex2018
  • NaCl  137 mM
Euromedex1112-A
  • KCl 2.7 mM
EuromedexP017
Tween 20Euromedex2001-C
BSASigmaA7906
DTT 1 mMSigma43815Solución stock 100 mM, tóxico
1% cóctel de fosfatasaPierce78428
1% cóctel inhibidor de proteasaRoche04 693 132 00150x concentrado
Microplaca MaxiSorpTMThermo Scientific442404
Tampon carbonato 50 mM pH 9.6
  • Na2CO3, 10H2O
Sigma713602.86 g/L
  • NaHCO3
Merk63293.36 g/L, pH 9.6
Buffer de bloqueo Superblock T20 PBSPierceE6423H10x concentrado
TMBSigmaT0440Usado para ELISA
TMBAnalytik Jena AG847-0104200302Usado para mapeo de epítopos
HCl 1 NChimie plus40030
RibolyserThermoFast prep FP120mantener en hielo en este paso
Tubos de moliendaBiorad355-1197
Lavador de placasTecanColumbus Pro
Lector de placasBioradModel 680
Lente de aumento de baja potencia VWR630-10628X aumento
Pinza Dumont#7WPI14097Para pasos de disección
Pipeta de transferencia 1ml SamsoSamso043231
Tubos de 1.5 mlDutscher033290

Referencias

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