Se describe una ELISA que ofrece un enfoque cuantitativo novedoso. Detecta específicamente alfa-sinucleína asociada a la enfermedad (αSD) en un modelo de ratón transgénico (M83) de sinucleinopatía utilizando varios anticuerpos contra la forma de alfa-sinucleína fosforilada en Ser129 o la parte C-terminal de la proteína.
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Artículo de método
La detección de la enfermedad asociada-α-sinucleína por ELISA mejorada en el cerebro de ratones transgénicos que sobreexpresan A53T humano mutado α-sinucleína
En este artículo
Resumen
Resumen
Además de los métodos establecidos como Western blot, se necesitan nuevos métodos para cuantificar rápida y fácilmente asociado a la enfermedad α-sinucleína (aS D) en modelos experimentales de synucleopathies. Una línea de ratón transgénico (M83) sobre-expresión de los aS A53T humanos y desarrollar espontáneamente un fenotipo clínico dramática entre ocho y 22 meses de edad, que se caracterizan por síntomas que incluyen pérdida de peso, postración, y deterioro motor severa, se utilizó en este estudio. Para los análisis moleculares de aS D (aS asociado a la enfermedad) en estos ratones, un ELISA fue diseñado para cuantificar específicamente aS D en ratones enfermos. Análisis del sistema nervioso central en este modelo de ratón mostró la presencia de aS D principalmente en las regiones cerebrales caudal y la médula espinal. No hubo diferencias en la distribución aS D entre diferentes condiciones experimentales que conducen a la enfermedad clínica, es decir, en uninoculado y normalmente envejecimiento ratones transgénicos y en ratones inoculados con extractos de cerebro de ratones enfermos. La detección específica de aS D inmunorreactividad utilizando un anticuerpo contra la Ser129 fosforilada aS por ELISA esencialmente correlacionados con la obtenida por Western blot e inmunohistoquímica. Inesperadamente, se observaron resultados similares con varios otros anticuerpos contra la parte C-terminal de aS. La propagación de aS D, lo que sugiere la participación de un mecanismo de "-prión como", de este modo se puede monitorizar y cuantificar en este modelo de ratón utilizando un enfoque ELISA fácilmente.
Introducción
La mayoría de los métodos actuales para detectar la α-sinucleína asociada a enfermedades (αSD) en modelos experimentales de la enfermedad de Parkinson (EP), como la inmunohistoquímica o el Western blot, son lentos y no cuantitativos. Esta enfermedad neurodegenerativa se caracteriza por la agregación de alfa-sinucleína principalmente en forma de inclusiones que contienen una forma agregada de la proteína presináptica normalmente soluble αS1,2 (cuerpos de Lewy y neuritas de Lewy). Normalmente solo marginalmente fosforilada, αS está hiperfosforilada en su residuo de serina 129 en estas inclusiones3 y puede ser monitoreada por anticuerpos ....
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Protocolo
Todos los procedimientos y protocolos con animales estaban en conformidad con la Directiva 86/609 / CEE del Consejo y ratificado por venir, el Comité Nacional Francés para la consideración de la ética en la experimentación animal (protocolo de 11 a 0043) de la CE. Los animales fueron alojados y atendidos en ANSES aprobada de instalaciones experimentales en Lyon (aprobación B 69387 0801).
1. Preparación de ratones
- La eutanasia a los ratones mediante una inyección intraperitoneal de dosis letal de pentobarbital de sodio.
- Recuperar todo el cerebro del cráneo del ratón y colocarlo en un 35 mm placa Petri de plástico en el....
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Resultados
En este estudio, las pruebas ELISA utilizadas específicamente identificados aS enfermedades asociadas (aS D) en homogeneizados de cerebro preparados en un tampón de alta sal de ratones enfermos M83. El uso de un anticuerpo que reconoce específicamente pSer129 aS (p = 0,0074), el ELISA distingue fácilmente de edad, ratones enfermos (> 8 meses de edad) de los jóvenes (2-5 meses de edad), los ratones sanos M83 (Figura 1). Varios otros anticuerpos mostraron igualmente altos señales (> 0,6 O.......
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Discusión
El uso de un ELISA se demostró para detectar específicamente aS D directamente a partir de homogeneizados de cerebro de ratón durante la enfermedad en el modelo de ratón transgénico M83. De hecho, este ELISA podría distinguir fácilmente los ratones M83 enfermos de ratones sanos M83 utilizando homogeneizados de cerebro solamente enteros en tampón elevado de sal.
Los pasos más importantes para los resultados exitosos que utilizan este ELISA son: disección correctamente las diferente.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses para divulgar.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer a Damien Gaillard para inoculaciones y el seguimiento de los experimentos con animales. Este trabajo fue apoyado por la ANSES (Agencia Francesa para la Alimentación, Medio Ambiente y Salud Ocupacional y Seguridad) y por una beca de la Fundación France Parkinson.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| LB509 | Abcam | ab27766 | Anticuerpo de detección 1/2,000 |
| AS11 | Producido en Anses | Anticuerpo de detección 1/1,000 | |
| 4D6 | Abcam | ab1903 | Anticuerpo de detección 1/2,000 |
| PSer129 | Abcam | ab59264 | Anticuerpo de detección 1/3,000 |
| PSer129 EP1536Y | Abcam | ab51253 | Anticuerpo de detección 1/1,000 |
| syn514 | Abcam | ab24717 | Anticuerpo de detección 1/500 |
| clone 42 | BD Biosciences | 610787 | Anticuerpo de recubrimiento y detección (1/2,000) |
| 8A5 | Proporcionado por el Dr. Anderson | Anticuerpo de detección 1/2,000 | |
| anticuerpo policlonal anti-α-syn | Millipore | AB5038P | Anticuerpo de recubrimiento |
| Conjugado HRP anti-IgG de ratón | Southern Biotech | 1010-05 | |
| Conjugado HRP anti-IgG de conejo | Southern Biotech | 4010-05 | |
| Conjugado HRP anti-IgG de cabra de ratón | Dianova | 115-035-164 | |
| HS buffer | Ajustar a pH 7.5 y mantener a 4 °C | ||
| Euromedex | 26-128-3094-B | |
| Euromedex | 1112-A | |
| Euromedex | EU0007-B | |
| Sigma | 43815 | |
| PBS | Ajustar a pH 7.5 | ||
| Euromedex | 1309 | |
| Euromedex | 2018 | |
| Euromedex | 1112-A | |
| Euromedex | P017 | |
| Tween 20 | Euromedex | 2001-C | |
| BSA | Sigma | A7906 | |
| DTT 1 mM | Sigma | 43815 | Solución stock 100 mM, tóxico |
| 1% cóctel de fosfatasa | Pierce | 78428 | |
| 1% cóctel inhibidor de proteasa | Roche | 04 693 132 001 | 50x concentrado |
| Microplaca MaxiSorpTM | Thermo Scientific | 442404 | |
| Tampon carbonato 50 mM pH 9.6 | |||
| Sigma | 71360 | 2.86 g/L |
| Merk | 6329 | 3.36 g/L, pH 9.6 |
| Buffer de bloqueo Superblock T20 PBS | Pierce | E6423H | 10x concentrado |
| TMB | Sigma | T0440 | Usado para ELISA |
| TMB | Analytik Jena AG | 847-0104200302 | Usado para mapeo de epítopos |
| HCl 1 N | Chimie plus | 40030 | |
| Ribolyser | Thermo | Fast prep FP120 | mantener en hielo en este paso |
| Tubos de molienda | Biorad | 355-1197 | |
| Lavador de placas | Tecan | Columbus Pro | |
| Lector de placas | Biorad | Model 680 | |
| Lente de aumento de baja potencia | VWR | 630-1062 | 8X aumento |
| Pinza Dumont#7 | WPI | 14097 | Para pasos de disección |
| Pipeta de transferencia 1ml Samso | Samso | 043231 | |
| Tubos de 1.5 ml | Dutscher | 033290 |
Referencias
- Goedert, M., Spillantini, M. G., Del Tredici, K., Braak, H. 100 years of Lewy pathology. Nat Rev Neurol. 9, 13-24 (2013).
- Waxman, E. A., Giasson, B. I. Specificity and regulation of casein kinase-mediated phosphorylation of alpha-synuclein. J Neuropathol Exp Neurol. 6....
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Reimpresiones y permisos
