Artículo de método

Análisis De Las Funciones De Los MastOcitos In Vivo Usando ' MastCell Knock-in' Ratones

DOI:

10.3791/52753

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27 de mayo de 2015

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1Department of Pathology, Stanford University School of Medicine, 2Department of Microbiology & Immunology, Stanford University School of Medicine

En este artículo

Resumen

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Describimos un método para la generación de células de mástil derivadas in vitro, su engraftment en ratones célula-deficientes del mástil, y el análisis del fenotipo, de los números y de la distribución de las células de mástil engrafted en diversos sitios anatómicos. Este protocolo se puede utilizar para evaluar las funciones de los mastocitos in vivo.

Resumen

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Los mastocitos (MCs) son células hematopoyéticas que residen en diversos tejidos, y son especialmente abundantes en sitios expuestos al medio externo, como la piel, las vías respiratorias y el tracto gastrointestinal. Mejor conocidos por su papel perjudicial en las reacciones alérgicas dependientes de IgE, los MCs también han surgido como actores importantes en la defensa del huésped contra el veneno y las bacterias y parásitos invasores. El fenotipo y la función del mc pueden ser influenciados por los factores microambientales que pueden diferir según la localización anatómica y/o basado en el tipo o la etapa del desarrollo de inmunorespuestas. Por esta razón, nosotros y otros hemos favorecido los acercamientos in vivo sobre métodos ines vitro para ganar la penetración en funciones de la bujía métrica. Aquí, se describen los métodos para la generación de ratón derivado de la médula ósea cultivada MCs (BMCMCs), su transferencia adoptiva en ratones genéticamente deficientes en MC, y el análisis de los números y la distribución de MCs transferidos adoptivamente en diferentes sitios anatómicos. Este método, denominado el enfoque'mast cell knock-in', se ha utilizado ampliamente en los últimos 30 años para evaluar las funciones de los MC y los productos derivados de MC in vivo. Discutimos las ventajas y las limitaciones de este método, a la luz de los acercamientos alternativos que se han desarrollado en los últimos años.

Introducción

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Los mastocitos (MCs) son células hematopoyéticas que surgen de progenitores pluripotentes de la médula ósea1-3. Después de la egressión de la médula ósea, los progenitores de las MCs migran a varios tejidos donde se convierten en MCs maduros bajo la influencia de factores de crecimiento locales1-3. Los MCs residentes en tejidos están estratégicamente ubicados en interfaces huésped-ambiente, como la piel, las vías respiratorias y el tracto gastrointestinal, donde se comportan como una primera línea de defensa contra los insultos externos3-6. Los MCs se subclasifiquen a menudo basados en sus características fenotípicas de la "línea de fo....

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Protocolo

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Todo el cuidado y la experimentación animal se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices de los Institutos Nacionales de Salud y con la aprobación específica del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Stanford.

1. Generación y Caracterización De Mastocitos Cultivados Derivados De La Médula Ósea (BMCMCs).

Nota: Los BMCMCs dispensadores de aceite se deben generar de las células de la médula del mismo fondo genético que los ratones MC-deficientes receptores. BMCMCs donante Varón-derivado no es conveniente para el engraftment de ratones femeninos. Los BMCMCs donantes derivados de mu....

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Resultados

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En la Figura 1se muestra una visión general del enfoque de'knock-in de mastocitos'e incluye la generación de BMCMCs, el número de células que deben injertrse i.p., i.d. o i.v. en ratones deficientes en MC (el número puede variar si se indica en función del diseño experimental) y el intervalo entre el injerto y el experimento dependiendo del sitio de inyección (este intervalo también puede variar, si se indica; por ejemplo,el contenido de mediadores almacenados en los gránulos citoplasmá.......

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Discusión

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Casi 30 años después de su descripción inicial38, el enfoque'mast cell knock-in'sigue proporcionando información valiosa sobre lo que los MCs pueden o no pueden hacer in vivo. Las funciones de MCs eran de largo probablemente limitadas a su papel en alergia. Los datos generados utilizando el enfoque'mast cell knock-in'han cambiado esta visión, al proporcionar evidencia de que los MCs pueden, entre otras funciones, desempeñar papeles críticos en la defensa del huésped contra ciertos pa.......

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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N.G. ha recibido becas de la "Fondation pour la Recherche Médicale FRM" francesa y de la Fundación Philipp; R.S. cuenta con el apoyo de la Fundación Lucile Packard para la Salud infantil y el premio CTSA de los NIH/NCRR de Stanford número UL1 RR025744; P.S. cuenta con el apoyo de una beca Max Kade de la Fundación Max Kade y la Academia Austríaca de Ciencias y una beca Schroedinger del Fondo Austriaco para la Ciencia (FWF): J3399-B21; S.J.G. reconoce el apoyo de las subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud U19 AI104209, NS 080062 y del Programa de Investigación de Enfermedades Relacionadas con el Tabaco de la Universidad de California; L.L.R. reconoce el apoy....

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Solución Antibiótica-Antimicótica al 1%Corning cellgro30-004-Cl
3 ml JeringaFalcon309656
35 mm x 10 mmPlato Corning cellgro430588
5 ml Poliestireno Tubo de Fondo RedondoFalcon352058
Ácido Acético GlacialFisher ScientificA35-500
Azul Alcián 8GXRowley Biochemical Danver33864-99-2
Allegra 6R CentrífugaBeckman
Anti-ratón CD16/32 (clon 93) PurificadoeBioscience14-0161-81
2-MercaptoethanolSigma AldrichM7522
BD 1 ml TB JeringaBD Jeringa BD309659
BD 22 G x 1 (0,7 mm x 25 mm) AgujasBD Aguja Precision Glide205155
BD 25 G 5/8 AgujasBD Jeringa305122
BD 30 G x 1/2 AgujasBD Precision Glide305106
Azul MAX Jr, 15 ml Polipropileno Tubo cónicoFalcon352097
CloroformoFisher ScientificC298-500
Cytoseal 60 Medio de montajeRichard-Allan Scientific8310-4
Cytospin3ShandonNA
DakoPluma de citomaciónDakoS2002
Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) 1xCorning cellgro15-013-CM
EtanolSigma AldrichE 7023-500ml
Suero Fetal Bovino Inactivado por Calor SigmaAldrichF4135-500ml
FITC IgG2b K Conjugado Control de Isotipo de RataeBioscience14-4031-82
Isotiocianato de fluoresceína (FITC) KIT anti-ratón conjugado (CD117; clon 2B8)eBioscience11-1171-82
FormaldehídoFisher ScientificF79-500
Giemsa Tinción Sigma ModificadaAldrichGS-1L
IsothesiaHenry Schein Salud Animal29405
May-Grunwald TinciónSigma AldrichMG-1L
Multipocillo 6 placas de pocillosFalcon35 3046
Microscopio Olympus BX60OlympusNA
Paraplast Plus Medio de inclusión de tejidosFisher Brand23-021-400
PE Conjugado IgG Hámster Armenio Control de isotiposeBioscience12-4888-81
Solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1xCorning cellgro21-040-CV
Ficoeritrina (PE) Conjugada Anti-ratón FceRIa (clon MAR-1)eBioscience12-5898-82
Solución de tinción de yoduro de propidioeBioscience00-6990-50
Ratón recombinante IL-3Peprotech213-13
Certificado Safranin-oSigma AldrichS8884
Matraces de cultivo de tejidos T25 25 cm2Beckton Dickinson353109
Matraces de cultivo de tejidos T75 75 cm2Beckton Dickinson353110
Azul de toluidina 1% acuosoLabChem-IncLC26165-2
SCF de ratón recombinantePeprotech250-03

Referencias

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  1. Kitamura, Y. Heterogeneity of mast cells and phenotypic change between subpopulations. Annu. Rev. Immunol. 7, 59-76 (1989).
  2. Galli, S. J., Borregaard, N., Wynn, T. A. Phenotypic and functional plasticity of cells of innate immunity....

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Etiquetas

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