El uso de ultra-alta MRI Field en Modelos pequeño roedor de la enfermedad renal poliquística para<em&gt; En Vivo</em&gt; Fenotipificación de Drogas y Vigilancia

Resumen

Se describe el uso de la resonancia magnética de campo ultra alto como una forma no invasiva de obtener información fenotípica de modelos de roedores para la enfermedad renal poliquística y para monitorear las intervenciones. En comparación con el enfoque histológico tradicional, las imágenes de resonancia magnética se pueden adquirir in vivo, lo que permite un seguimiento longitudinal.

Resumen

Varios estudios preclínicos in vivo en la Enfermedad Renal Poliquística (PKD) utilizan modelos de roedores ortólogos para identificar y estudiar los mecanismos genéticos y moleculares responsables de la enfermedad, y son muy convenientes para la detección rápida de fármacos y las pruebas de terapias prometedoras. Un factor limitante en estos estudios suele ser la falta de métodos eficaces y no invasivos para analizar secuencialmente los cambios anatómicos y funcionales en el riñón. La resonancia magnética (RM) es la técnica de imagen estándar de oro actual para el seguimiento de pacientes con enfermedad renal poliquística autosómica dominante (PQRAD), proporcionando un excelente contraste de tejidos blandos y detalles anatómicos y permitiendo mediciones del volumen renal total (TKV). Una de las principales ventajas de la resonancia magnética en modelos de PKD en roedores es la posibilidad de obtener imágenes in vivo, lo que permite realizar estudios longitudinales con el mismo animal y, por lo tanto, reducir el número total de animales necesarios. En este manuscrito, nos centraremos en el uso de la resonancia magnética de campo ultra alto (UHF) para adquirir de forma no invasiva imágenes in vivo de modelos de roedores para PKD. El objetivo principal de este trabajo es introducir el uso de la resonancia magnética como herramienta para la caracterización fenotípica in vivo y el seguimiento de fármacos en modelos de roedores para PKD.

Introducción

Enfermedad renal poliquística (PKD) incluye un grupo de enfermedades monogénicas que se caracterizan por el desarrollo de quistes renales. Entre ellos se encuentran autosómica dominante enfermedad renal poliquística (PQRAD) y la enfermedad renal poliquística autosómica recesiva (ARPKD), que representan los tipos más comunes ^1,2. PQRAD, la forma más frecuente de las enfermedades quísticas renales hereditarias, se origina por mutaciones en los genes PKD1 o PKD2. Se caracteriza por la aparición tardía, múltiples quistes renales bilaterales, acompañado por quistes extrarrenales variables, así como anomalías esqueléticas cardiovasculares y musculares. ARPKD, la mayoría de los recién nacidos comúnmente afectan a niños y jóvenes, es causada por mutaciones en PKHD1 y se caracteriza por los riñones ecogénicos agrandados y la fibrosis hepática congénita ^3.

Es importante destacar que la PQRAD se caracteriza por la heterogeneidad, tanto en el gen (génica) y la mutación (alélica) niveles, lo que resulta en p sustancialvariabilidad henotypic. Las mutaciones en el gen PKD1 se asocian con la presentación clínica severa (numerosos quistes, el diagnóstico precoz, la hipertensión y hematuria), así como la rápida progresión a fase terminal de la enfermedad renal (20 años antes que los pacientes con mutaciones PKD2) ^4. La enfermedad grave del hígado poliquístico (PLD) y anormalidades vasculares pueden estar asociados con mutaciones en ambos PKD1 y PKD2 ^5. La mayoría de las complicaciones renales de la PQRAD surgen principalmente como consecuencia de la expansión del quiste junto con la inflamación y la fibrosis asociada. Desarrollo quiste comienza en el útero y continúa a través del curso de la vida del paciente. Los riñones normalmente mantienen su forma reniforme a pesar de que podrían alcanzar más de 20 veces el volumen normal del riñón. La mayoría de los pacientes presentan la distribución bilateral de quistes renales, pero en algunos casos inusuales, quistes pueden desarrollar en un patrón unilateral o asimétrica.

Un challen importantege para nefrólogos siguientes pacientes con PQRAD o la aplicación de terapias es la historia natural de la enfermedad. Durante la mayor parte de su curso, la función renal permanece normal y por el tiempo de la función renal comienza a disminuir, la mayoría de los riñones han sido sustituidos por los quistes. Cuando terapias se aplican en etapas posteriores, es menos probable que tenga éxito ya que el paciente ya puede haber alcanzado un punto de no retorno en la enfermedad renal crónica. En contraste, cuando las terapias se inician en las primeras etapas, es difícil identificar una respuesta basada únicamente en la tasa de filtración glomerular. Como resultado, la noción de volumen de riñón como un marcador de progresión de la enfermedad ganó la atención.

El Consorcio de Estudios por imágenes radiológicas de estudio renal poliquística Enfermedades (CRISP) ha demostrado que en los pacientes con PQRAD el aumento de los volúmenes de los riñones y del quiste se correlaciona directamente con el deterioro de la función renal, lo que subraya el potencial del volumen renal total (TKV) como comomarcador urrogate de ^6,7 progresión de la enfermedad. En consecuencia, TKV se utiliza actualmente como punto final primario o secundario en múltiples ensayos clínicos para PQRAD ^2,8,9.

Múltiples modelos murinos incluyendo mutaciones espontáneas y la ingeniería genética han arrojado luz sobre la patogénesis de la PKD ^10,11. Modelos PKD1 o PKD2 (mutaciones en cualquiera Pkd1 o PKD2) se han convertido en los más populares, ya que las enfermedades humanas perfectamente mímica. Además, los modelos de roedores con mutaciones en genes distintos de los genes PKD1 o PKD2 se han utilizado como una plataforma experimental para elucidar las rutas de señalización relacionadas con la enfermedad. Además, varios de estos modelos se han utilizado para probar posibles terapias. Sin embargo, un factor limitante en muchos estudios de roedores para la PKD es a menudo la falta de métodos no invasivos eficientes para analizar secuencialmente los cambios anatómicos y funcionales en el riñón.

R magnéticaimágenes esonance (RM) es la técnica de imagen actual estándar de oro para el seguimiento de pacientes con PQRAD, que proporciona un excelente contraste de tejidos blandos y detalles anatómicos, y permitiendo mediciones TKV. A pesar de que la RM está bien establecido para obtener imágenes anatómicas en los animales y los seres humanos más grandes, pequeños roedores de imágenes in vivo implica desafíos técnicos adicionales, en los que la capacidad de adquirir imágenes de alta resolución puede limitar su utilidad. Con la introducción de Ultra-alta de campo (UHF) MRI (7-16,4 T) y el desarrollo de gradientes fuertes, ahora es posible para lograr una mayor relación señal a ruido y la resolución espacial de las imágenes de resonancia magnética con una calidad de diagnóstico similares a la obtenido en los seres humanos. En consecuencia, el uso de UHF MRI para formación de imágenes in vivo de pequeños modelos de roedores para la PKD se ha convertido en una herramienta poderosa para los investigadores.

Protocolo

Antes de iniciar cualquier procedimiento con animales vivos, los protocolos experimentales deben ser aprobados por el cuidado de los animales y el uso comité institucional (IACUC).

1. Configuración del escáner

1. Antes de empezar, asegúrese de que el calentador esté en la posición OFF.
2. Seleccione el Mini gradiente de imágenes y bobina de RF 38 mm y mini titular de imágenes.
3. En el orificio central del soporte de instalar el conjunto de temperatura variable.

2. Preparación de los animales

1. Para los experimentos de resonancia magnética, lograr óptimos usando anestesia isoflurano vaporizado. Para la inducción de la anestesia, colocar los animales en una cámara de inducción forrada con un papel absorbente. Ajuste el medidor de flujo del vaporizador de isoflurano a 2,0-2,5 L / min, y el isoflurano al 3% en oxígeno.
2. Retire cualquier etiqueta de metal u otro objeto metálico en esta etapa. Aplique un ungüento veterinario en los ojos de los animales para evitar la sequedad mientras que bajo anestesia.
3. Una vez que el animalha alcanzado el plano quirúrgico de anestesia (es decir, la pérdida de la retirada reflejo de pizca dedo del pie), coloque el animal en un soporte con su nariz insertada en un cono de la nariz. Ajuste el flujo de aire anestesia en la sonda a 2,0-2,5 ml / min y la concentración de isoflurano a 1,5-2,0% en oxígeno. La anestesia se entregará a través del cono de la nariz durante el procedimiento. Periódicamente ajustar la concentración de isoflurano dependiendo de la edad y el peso del animal para mantener una tasa de respiración de ~ 40 lpm.
4. Utilice los titulares de animales para asegurar que el animal en su lugar y evitar el movimiento durante el experimento de resonancia magnética. Variar el tipo de soporte de los animales en función de la zona del cuerpo que va a escanear.
   Nota: Los titulares personalizados de plásticos de laboratorio (polipropileno, teflón, poliestireno, policarbonato) se pueden hacer para acomodar experimento específico y para ajustarse al tamaño de los animales (de ratón recién nacido a 160 g rata).
5. Coloque el termómetro rectal en el animal para supervisar la temperatura corporal del animal. Durante la experiment, mantener al animal a 35-37 ° C, utilizando una corriente de aire caliente. Ajuste de temperatura del aire (30-38 ° C) y el flujo (1.200-2.000 L / hr) basado en la retroalimentación de la temperatura corporal del animal.
6. Conecte un sensor de presión respiratoria globo al abdomen del animal para controlar la tasa de respiración.
7. Asegure el animal en el centro de la bobina de RF y coloque cuidadosamente la bobina de RF con el animal en la RM escáner.

3. MRI Experimento

1. Tune y coincide con la bobina de RF antes de comenzar los experimentos para minimizar la potencia de RF utilizado y la relación señal-ruido para maximizar. Para iniciar el juego / tuning:
   1. Abra la herramienta de control espectrómetro haciendo clic en el icono de herramientas.
   2. En la herramienta de control espectrómetro clic Adquisición → Wobble. Una ventana Acq / Reco se abrirá mostrando la curva de oscilación.
   3. Alternativamente ajustar la afinación y que coinciden con los condensadores (utilizando la afinación y su adecuación a las barras) en pequeños pasos hasta que la potencia RF reflejadase reduce al mínimo. El objetivo es ver una curva con un mínimo en el eje vertical colocado en cero en el eje horizontal.
   4. Cuando la calibración de la bobina se ha logrado con éxito, pulse el botón Detener en la ventana Acq / Reco.
2. Adquirir imágenes de scouts en los tres planos ortogonales para crear imágenes axiales, coronales y sagitales. Utilice una secuencia de imágenes rápido como Intra Puerta Shot ángulo bajo Rápido (IG-FLASH) para adquirir las imágenes de scouts ^12. Utilice las imágenes de scouts para establecer la geometría adecuada para la proyección de imagen real.
3. En función de los objetivos específicos de investigación, seleccione secuencia de imagen adecuada y los parámetros e iniciar el análisis con un semáforo. Esto calibrar canal de RF, calzar el imán, ajuste la frecuencia portadora de resonancia para el agua y ajustar la ganancia del receptor, todo automáticamente.
   1. Para los estudios anatómicos y T2 imágenes ponderadas, adquirir en el modo 3D rebanada de múltiples 2D o. Para acortar el tiempo de experimento para una resolución espacial dado, mantener el campo-de-visión (FOV) lo más pequeña posible, pero lo suficientemente grande como para evitar artefactos envolventes (2,56 a 3,2 cm).
4. Mantenga el ciclo de la secuencia seleccionada ligeramente más corto que el ciclo de la respiración animal mediante la selección apropiada de tiempo de repetición (TR) y / o el número de rebanadas. Esto asegura que los datos se recogen durante período de silencio animales.
   1. Por ejemplo, para las imágenes abdominales, mantenga la frecuencia respiratoria del animal en ~ 30 lpm; es decir alrededor de 2.000 mseg por respiración. Use un Turbo rápida adquisición de Mejora Relajación secuencia (RARE) y adquirir 11-19 cortes coronales, con TR / TE 1500/9 ms, el factor RARO 8 y (matriz de 256 x 256, FOV 2,56 x 2,56 cm, grosor de corte de 0,75 mm) .
      Nota: Al ajustar el TR a 1500 ms, y mantener la frecuencia respiratoria del animal ~ 30 lpm (2000 ms por la respiración), nos aseguramos de que los datos se recogen durante el período de calma animales.
5. Después de todo adquisición de la imagen se ha completado, coloque el animal escaneadaen el cojín de calefacción y monitorear hasta ambulatoria. Después de la recuperación, devolver el animal a la jaula y monitoreado por lo menos durante 1 hora antes de volver a la instalación de animales.

Resultados

En este manuscrito, nuestro objetivo es mostrar la utilidad de UHF RM como una herramienta para la caracterización fenotípica en vivo o un control de drogas en modelos de roedores de PKD y otras enfermedades renales. Todos los experimentos fueron parte de los protocolos experimentales aprobados por la IACUC.

En fenotipo vivo de pequeños modelos de roedores para PKD usando UHF MRI:

Todos los estudios de imagen se realizaron en animales vivo...

Discusión

Este manuscrito muestra la viabilidad del uso de UHF MRI como herramienta para la caracterización fenotípica in vivo o un control de drogas en modelos de roedores para la PKD.

Se describe experimentos realizados en 16,4 T con un amplio orificio Avance III alta resolución espectrómetro de RMN equipado con accesorios de micro y mini imagen. El espectrómetro fue impulsado por el software de adquisición y procesamiento TopSpin2.0PV controlado por Paravision 5.1 software de imágenes. Deb...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
AVANCEIII-700 (16.4 T)	Bruker	BH067206	Espectrómetro multinuclear de dos canales de gran diámetro equipado con accesorios de miniimagen y microimagen para la adquisición de imágenes in vivo pequeños roedores
TopSpin2.0PV	Bruker	H9088TA2	Espectrómetro
software de procesamiento Paravision 5.1	Bruker	T10314L5	Imaging VTU
BVT 3000 digital	Controlador	de	temperatura

Bruker W1101095