La investigación de la migración temprana de células endoteliales (EEC) es importante para comprender la fisiopatología de ciertas enfermedades y para identificar potencialmente nuevas estrategias para la intervención terapéutica. El siguiente protocolo describe las técnicas para evaluar la migración celular que han sido adaptadas para la investigación de la EEC.
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Artículo de método
Evaluación de la migración de células endoteliales después de la exposición a sustancias químicas tóxicas
En este artículo
Resumen
Resumen
La exposición a sustancias químicas (incluyendo alquilantes agentes de guerra química, como mostazas de azufre y nitrógeno) causa una gran cantidad de síntomas clínicos incluyendo trastorno de cicatrización de heridas. El proceso fisiológico de la cicatrización de la herida es muy compleja. La formación de tejido de granulación es un paso clave en este proceso resulta en un cierre de la herida preliminar y proporcionar una red de nuevos vasos sanguíneos capilares - ya sea a través de la vasculogénesis (formación de novela) o la angiogénesis (crecimiento de vasos existentes). Tanto vasculopatía y la angiogénesis requieren funcional, la migración dirigida de células endoteliales. Por lo tanto, la investigación de la migración temprana de células endoteliales (CEE) es importante para comprender la fisiopatología de los trastornos inducidos química herida curativa y potencialmente identificar nuevas estrategias para la intervención terapéutica.
Se evaluó la alteración de la cicatrización de la herida después de la exposición alquilantes agente y probado compuestos candidatos potenciales para el tratamiento. Se utilizó un conjunto de técnicas descritas en este protocolo. Una cámara de Boyden modificada para investigar cuantitativamente chemokinesis del CEE se describe. Además, se ilustra el uso de la cicatrización de la herida ensayo en combinación con el análisis de pista para evaluar cualitativamente la migración. Finalmente, se demuestra el uso de la TMRM colorante fluorescente para la investigación del potencial de membrana mitocondrial para identificar los mecanismos subyacentes de la migración celular perturbada. El siguiente protocolo describe las técnicas básicas que han sido adaptados para la investigación de la CEE.
Introducción
La migración celular es importante en muchos procesos fisiológicos y fisiopatológicos, incluyendo el desarrollo, diversas enfermedades, y curación de heridas después de una lesión de la piel.
Después de una lesión de la piel, la inflamación elimina unidades de tejido de granulación y dañadas o necróticas cierre de la herida preliminar y permite la formación de una red de nuevos capilares a través de la vasculogénesis (formación de novela) o la angiogénesis (surgimiento de vesículas existentes) 1-3. Tanto vasculopatía y la angiogénesis requieren migración de las células endoteliales. La creciente red de vasos sanguíneos es esenc....
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Protocolo
El siguiente protocolo describe técnicas para la investigación de los principios de la migración celular endotelial. El cultivo apropiado de las células endoteliales vasculares requiere pre-revestimiento de frascos de cultivo celular con gelatina para asegurar la proliferación y el mantenimiento de un fenotipo endotelial.
1. Pre-recubrimiento de frascos de cultivo celular
- Disolver la gelatina en PBS 0,1 M a una concentración final de 0,1%.
- Autoclave la solución con parámetros para autoclave líquido (para más detalles ver las instrucciones del autoclave específico).
- Añadir un volumen suficiente de la solución....
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Resultados
La exposición dérmica a los agentes alquilantes provoca eritema, formación de ampollas y la ulceración dérmica que está asociada con un trastorno de cicatrización de la herida. La cicatrización de heridas requiere vasculogénesis y angiogénesis, que se basa en la migración de las células endoteliales. Migración cuantitativa se puede evaluar mediante el uso del ensayo de cámara de Boyden. Como se muestra en la Figura 1C de la exposición a la CEE clorambucil agente alquilante dado lugar a una disminución s.......
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Discusión
La exposición dérmica a productos químicos tóxicos a menudo resulta en el trastorno de la cicatrización de heridas graves. Los mecanismos subyacentes son en gran parte desconocido. La cicatrización de heridas es un proceso complejo que consta de diferentes fases (hemostasia, inflamación, proliferación y remodelación). La migración celular está involucrado en cada fase, sin embargo, es de suma importancia para la formación del tejido de granulación. Aquí, los nuevos vasos sanguíneos se forman ya sea por angio- o vasculog.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por el Ministerio de Defensa de Alemania (Subvención No. M-SAB1-6-A009).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Cámara de Boyden | |||
| Insertos tratados con cultivo de tejidos (TC) Corning FluoroBlok, 24 pocillos - 3 y micro; m | Corning Incorporated | #351151 | |
| Insertos tratados con Corning FluoroBlok Tissue Culture (TC), 24 pocillos - 8 y micro; m | Ciencias de la Vida | #351152 | |
| (para usar con Falcon Insert 24 pocillos Companion Plate (353504) | |||
| cicatrización de heridas | |||
| Platos con fondo de vidrio | Word Precision Instruments, Inc. | #FD35-100 | |
| Evaluación del potencial | |||
| TMRM (tetrametilrodamina metil éster) | Life Technologies | #T669 | |
| Cultivo | |||
| Accutase | PAA, Pasching, Austria | # L11-007 | |
| α-Ácido linolénico | Fluka (Sigma), Steinheim, Alemania | # L2376 | |
| Chlorambucil | Fluka (Sigma), Steinheim, Alemania | # 23125 | |
| Gelatina | Sigma-Aldrich, Steinheim, Alemania | # G2500-100G |
Referencias
- Bauer, S. M., Bauer, R. J., Velazquez, O. C. Angiogenesis, vasculogenesis, and induction of healing in chronic wounds. Vascular and Endovascular Surgery. 39, 293-306 (2005).
- Reinke, J. M., Sorg, H. Wound....
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Reimpresiones y permisos
