Artículo de método

Método para medir la actividad de enzimas deubiquitinating en líneas celulares y muestras de tejido

DOI:

10.3791/52784

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10 de mayo de 2015

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1Department of Neuroscience, University of Minnesota, 2Institute for Translational Neuroscience, University of Minnesota, 3Department of Obstetrics, Gynecology, and Women’s Heath, University of Minnesota, 4Masonic Cancer Center, University of Minnesota

En este artículo

Resumen

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El actual protocolo detalla un método para medir la actividad de las enzimas funcionalmente homóloga deubiquitinating. Sondas especializadas modifican covalentemente la enzima y permiten la detección. Este método tiene el potencial de identificar nuevas dianas terapéuticas.

Resumen

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El sistema ubiquitina-proteasoma ha sido recientemente implicada en diversas patologías que incluyen enfermedades neurodegenerativas y cáncer. A la luz de esto, las técnicas para estudiar el mecanismo de regulación de este sistema son esenciales para elucidar los procesos celulares y moleculares de las enfermedades mencionadas anteriormente. El uso de hemaglutinina derivado sondas ubiquitina descritos en este documento sirve como una valiosa herramienta para el estudio de este sistema. Este documento detalla un método que permite al usuario realizar ensayos que dan una visualización directa de deubiquitinating actividad de la enzima. Enzimas deubiquitinating control de la degradación proteasomal y comparten homología funcional a sus sitios activos, que permite al usuario investigar la actividad de múltiples enzimas en un ensayo. Los lisados ​​se obtienen a través suave ruptura celular mecánica y se incubaron con sitio activo sondas dirigidas. Enzimas funcionales etiquetados con las sondas mientras enzimas inactivas permanecen sin unir. Por plazoNing este ensayo, el usuario obtiene información tanto sobre la actividad y la expresión potencial de múltiples enzimas deubiquitinating de una manera rápida y fácil. El método actual es significativamente más eficiente que el uso de anticuerpos individuales para los predichos cien enzimas deubiquitinating en la célula humana.

Introducción

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El sistema ubiquitina-proteasoma (UPS) sirve como una de las principales vías de degradación en la célula de mamífero. Sustratos con destino a la degradación en el proteasoma etiquetados de forma covalente con polímeros de ubiquitina (Ub) 1. Antes de que el sustrato elegido como diana entra en el proteasoma para la degradación, la etiqueta de poli-ubiquitina debe ser eliminado. Una clase de enzimas conocidas como deubiquitinating enzimas (DUBs) es responsable de la eliminación y el reciclaje de moléculas de ubiquitina 2. Se ha predicho desde el genoma humano que hay cerca de un centenar DUBs que trabajan en la celda 3. Con un gran número de DUBs que controlan los procesos celulares mediados por Ub tal, el estudio de estas enzimas presenta un desafío ya que las técnicas de ARNm no dan información sobre la actividad y el Western Blot sólo da información sobre los niveles de expresión.

El uso de la hemaglutinina de la gripe (HA) etiquetada, Ub derivada de sitio dirigido sondas activas permite un mod covalenteficación de los DUBs funcionales y por lo tanto da una visualización directa de la actividad de estas enzimas en un Western blot 4. Las sondas tienen un grupo reactivo tiol C-terminal que sirve como un sustrato suicida para la cisteína residuo sitio activo 5. Con estas sondas, es posible estudiar la actividad y la expresión potencial de muchos DUBs bajo las dos estados patológicos y fisiológicos de la célula.

Cambios en la actividad DUB han sido implicados en una amplia gama de condiciones patológicas tales como Parkinson, Alzheimer, anemia y diversos tipos de cáncer 6-10. Esta técnica proporciona una poderosa herramienta para el estudio de la enfermedad. En el presente trabajo, se muestra la aplicación de esta técnica en las células HeLa y M17 que han sido lisadas usando perlas de vidrio. Además, se describe cómo utilizar este método en muestras de tejido de la médula espinal de ratón. La información obtenida de esta técnica se puede utilizar como punto de partida para la identificación dedianas terapéuticas así como el establecimiento de modelos para el estudio de diferentes condiciones de la enfermedad. La verdadera utilidad de esta técnica radica en su capacidad para proporcionar información sobre múltiples DUBs en un único ensayo.

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Protocolo

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1. Lisis Preparación Buffer

  1. Disolver la sacarosa en agua desionizada (DI) agua para hacer una solución stock de 2 M. Filtrar una solución de sacarosa 2 M usando un vacío impulsado 0,22 micras de fluoruro de polivinilideno (PVDF) de filtro.
  2. Disolver ditiotreitol (DTT) en agua DI para hacer una solución madre 500 mM y almacenar en condiciones anaeróbicas. Disolver el cloruro de magnesio (MgCl2) en agua DI para hacer una solución madre 100 mM. Disolver el trifosfato de adenosina (ATP) hidrato disódico en agua DI para hacer una solución madre 50 mM.
  3. Hacer una solución de Tris a pH 7,4 mediante la disolución de clorhidrato de Trizma en agua DI y ajustando el pH usando hidróxido de sodio (NaOH).
  4. Combinar porciones de las soluciones madre en agua DI para hacer un tampón de lisis con una concentración de sacarosa de 250 mM, una concentración de DTT de 1 mM, una concentración de MgCl 2 de 5 mM, una concentración de ATP de 1 mM y una concentración de Tris de 50 mM . Por ejemplo, mezclar 535,3 l de tris, 500 l de MgCl2, 1,25 ml de sacarosa, 20 l de la TDT, 200 l de ATP y 7,4947 ml de agua DI para hacer 10 ml de tampón de lisis. Esto se puede utilizar durante aproximadamente 20 experimentos.

2. Las células de cultivo para el Experimento

  1. Hacer alícuotas de los medios de comunicación por 30 ml de DMEM + 10% tubo cónico de suero bovino fetal (FBS) en un 50 ml.
  2. Traslado células M17 o HeLa congelados de almacenamiento de nitrógeno líquido a un vaso pequeño con agua tibia.
  3. Transferencia de las células para el tubo cónico de 50 ml. En primer lugar, añadir algunos medios de comunicación para el vial de células. A continuación, traslado a las células resuspendidas en 5 seg de descongelación.
  4. Centrifugar la suspensión celular a 450 xg durante 5 minutos para obtener un sedimento celular. Añadir 20 ml de medio en un matraz T75.
  5. Retire el papel de las células por medio de succión. Añadir 5 ml de medio fresco al sedimento celular y resuspender.
  6. Transferir la suspensión 5 ml de células a las 20 ml de medio en el matraz T75 y se incuba a 37 ° C. Change los medios de comunicación cada 3 días.

3. La recolección de la célula

  1. Retire los medios de comunicación a través de succión, con cuidado de no tocar las células.
  2. Lavar las células con 5 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS). Retire PBS utilizando succión.
  3. Añadir 3 ml de tripsina-ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) al matraz T75 e incubar a 37 ° C durante 3 min.
  4. Añadir 6 ml de medio fresco al matraz y resuspender las células.
  5. Transferir la suspensión a un tubo cónico de 15 ml y centrifugar a 290 xg durante 5 minutos.
  6. Eliminar el sobrenadante y añadir 5 ml de PBS. Golpee suavemente la parte inferior del tubo para romper la pastilla. Centrifugar a 290 xg durante 5 min.
  7. Repita el paso 3.6 de tres veces.
  8. Retirar PBS y resuspender las células en 1 ml de PBS fresco. Traslado al tubo Eppendorf (1,5 ml). Girar a 290 xg durante 5 min.

4. Lisis Celular

  1. Medir el volumen aproximado de la pastilla usando una pipeta unad pesar cuentas de vidrio en una masa: relación en volumen de 1: 1. Añadir dos veces el volumen del sedimento en tampón de lisis.
    Nota: Añadir el búfer antes de añadir las perlas de vidrio.
  2. Lisar las células en el tubo de Eppendorf a la máxima agitación durante 30 min a 4 ° C por agitación en una habitación fría.
  3. Brevemente Centrifugar a 200 xg durante 30 segundos para resolver las cuentas. Recoger el sobrenadante.
  4. Añadir el mismo volumen de perlas de vidrio como antes para el sobrenadante.
  5. Vortex una vez más a la máxima agitación durante 30 min a 4 ° C.
  6. Brevemente Centrifugar a 200 xg durante 30 segundos para resolver las perlas de vidrio. Recoger el sobrenadante.
  7. Centrifugar a 5030 xg durante 5 min para eliminar los núcleos, membranas y las células intactas. Recoger el sobrenadante, que es el lisado celular.

La homogeneización 5. Tejido

  1. Hacer una masa: volumen de 1: 9 solución de tejido de la médula espinal de ratón a tampón de lisis.
    Nota: Este método es aplicable a una variedad de diferirmuestras de tejido ENT.
  2. Homogeneizar el tejido usando un ajuste de nivel 2 en el homogeneizador durante 30 segundos para asegurar que no hay trozos restantes.
  3. Haga girar hacia abajo a 5030 xg durante 3 minutos para eliminar los núcleos, membranas y células intactas.
  4. Recoger el sobrenadante, que es el lisado.

La derivación 6. Muestra

  1. Realizar un ácido bicinconínico (BCA) en un análisis de placa de 96 pocillos para determinar la concentración de proteína del lisado de tejido usando un lector de placas de 96 pocillos colorimétrico según lo especificado por el protocolo del kit de ensayo de proteínas Pierce BCA.
  2. Llevar una alícuota correspondiente a 20 g de proteína total a 50 l usando (DI) de agua desionizada.
  3. Añadir 2 l de 1,35 M de HA-Ub-Vinil sulfona (VS) a la solución y se incuba durante 1 hora a 37 ° C. Esto da como resultado 20 g de lisado a 50 nM de sonda en la mezcla de reacción final. Esto está en gran exceso molar para asegurar el etiquetado de DUBs funcionales.
  4. YOncubate la muestra en tampón de muestra de Laemmli durante 5 minutos a 95 ° C. Para un 52 l reacción uso volumen 26 l de tampón de muestra 2x, 13 l de tampón de muestra 4x o 8,87 l de tampón de muestra 6x.
  5. Enfriar en hielo antes de cargar el gel.

7. Western Blot

  1. Cargar un 12 pocillos 4-20% de gel-tris glicina con 40 l de la muestra preparada
  2. Ejecute el gel a 95 V hasta que el frente de iones alcanza el fondo.
  3. Llevar a cabo una transferencia durante la noche del gel a una membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF).
  4. Incubar la membrana en la mancha negro amido y escanear el membane para obtener una imagen que muestra la cantidad de proteína en cada carril.
  5. Destain la membrana y se incuban en 5% de leche en PBS durante 1 hr a bloquear.
  6. Incubar la membrana en el anticuerpo primario anti-HA a una concentración de 1: 10.000 en leche 5% en PBS, ya sea durante la noche a 4 ° C o durante 4 horas a temperatura ambiente.
  7. Realizar 3 lavados fo 5 min cada uno en PBS con 0,1% de Tween-20 detergente.
  8. Incubar la membrana en un ratón peroxidasa de rábano picante a una concentración de 1: 10.000 en leche 5% en PBS durante al menos 2 hr.
  9. Realizar 3 lavados de 5 minutos cada uno en PBS con 0,1% de Tween-20 detergente.
  10. Realizar 1 lavado durante 5 min en PBS.
  11. Incubar la membrana en un reactivo de detección quimioluminiscente durante 10 min y detectar usando un detector quimioluminiscente. Utilice el ajuste en el detector automático de exposición.

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Resultados

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Células M17 y HeLa cultivadas se recogieron usando el método detallado en la (recolección de células 3.) protocolo y el tejido médula espinal de ratón se obtuvo. El / tejido de la médula espinal sedimento de células se colocó en un tubo con el tampón de lisis descrito en la sección de preparación de reactivos. Los sedimentos celulares se lisaron usando perlas de vidrio (Figura 1A) y muestras de tejido de médula espinal de ratón se homogeneizó usando el homogeneizador (Figura 1B). Despué...

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Discusión

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Desde ubiquitinación es una actividad celular fundamental, la comprensión de los mecanismos de regulación podría ser la clave para sacar a la luz los procesos de la enfermedad y la patología. El uso de HA etiquetada sitio dirigido sondas activas derivadas de Ub aquí presentados proporcionan un método sencillo, pero muy aplicable para el estudio de la degradación de proteínas mediada por Ub. Este método es más rápido y menos costoso que el estudio de cada uno de los DUBs individualmente.

En e...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Nos gustaría dar las gracias al laboratorio de Lee, de la Universidad de Minnesota para proporcionar las muestras de tejido de la médula espinal de ratones que fueron utilizados. Este trabajo fue apoyado por el Departamento de Programa de Defensa de ovario de Investigaciones Oncológicas (OCRP) OC093424 a MB, por el Fondo de Investigación del Cáncer y la Comunidad Randy máquina de afeitar de MB y por el cáncer ovárico de Alianza Minnesota (MOCA) a MB. Los financiadores no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión de publicar o preparación del manuscrito.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
PowerGen 125 (homogeneizador)Fischer Scientific14-261-02P
Filtros accionados por vacío 0,22 y micro; mBPV2210
Perlas de vidrio, lavadas con ácido ≤ 106 y micro; m (~ 140 tamiz de EE. UU.)Sigma-aldrichG4649-10G
SacarosaFischer ScientificS6-212
DL-ditiothreitolSigma-AldrichD0632
Cloruro de magnesioSigma-AldrichM8266
Adenosina 5'-trifosfato sódico sódico hidratoSigma-AldrichA26209
Clorhidrato de trizmaSigma-AldrichT3253
Águila modificada de Dulbecco Medio LifeTechnologies11965-092
Solución salina tamponada con fosfatoLife Technologies10010-023
Matraz para cultivo de tejidos 75 cm2 con vaso de filtro 250 ml 120/csCellstarT-3001-2
0,05% Tripsina-EDTA (1x)Life Technologies25300-054
HI FBSLife Technologies16140-071
Anticuerpo monoclonal anti-HA producido en ratónSigma-AldrichH9658
Ubiquitina vinil sulfona (HA-tag)Enzo Life SciencesBML-UW0155-0025
Tampón de muestra SDS de Laemmli (4x, reductor)Boston BioProductsBP-110R
Pierce BCA Protein kit de ensayoThermo Scientific23225

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ovaa, H., Kessler, B. M., Rolén, U., Galardy, P. J., Ploegh, H. L., Masucci, M. G. Activity- based ubiquitin-specific (USP) profiling of virus-infected and malignant human cells. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (8), 2253-2258 (2004).
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  3. Ziad, M. E., Wilkinson, K. D. Regulation of proteolysis by human deubiquitinating enzymes. Biochim Biophys Acta. 1843 (1), 114-128 (2014).
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  7. Poon, W. W., et al. β-Amyloid (Aβ) oligomers impair brain-derived neurotrophic factor retrograde trafficking by down-regulating ubiquitin C-terminal hydrolase UCH-L1. J Biol Chem. 288 (23), 16937-16948 (2013).
  8. Nijman, S. M., et al. The deubiquitinating enzyme USP1 regulates the Fanconi anemia pathway. Mol Cell. 17 (3), 331-339 (2005).
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Actividad de la enzima desubiquitinasasondas derivadas de HAan lisis por Western blotpreparaci n de lisado celularlisis celular mec nicaensayo de concentraci n de prote nasdetecci n quimioluminiscentemarcado del sitio activoperfilado de la actividad enzim ticatransferencia a membrana de PVDF

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