El actual protocolo detalla un método para medir la actividad de las enzimas funcionalmente homóloga deubiquitinating. Sondas especializadas modifican covalentemente la enzima y permiten la detección. Este método tiene el potencial de identificar nuevas dianas terapéuticas.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Método para medir la actividad de enzimas deubiquitinating en líneas celulares y muestras de tejido
En este artículo
Resumen
Resumen
El sistema ubiquitina-proteasoma ha sido recientemente implicada en diversas patologías que incluyen enfermedades neurodegenerativas y cáncer. A la luz de esto, las técnicas para estudiar el mecanismo de regulación de este sistema son esenciales para elucidar los procesos celulares y moleculares de las enfermedades mencionadas anteriormente. El uso de hemaglutinina derivado sondas ubiquitina descritos en este documento sirve como una valiosa herramienta para el estudio de este sistema. Este documento detalla un método que permite al usuario realizar ensayos que dan una visualización directa de deubiquitinating actividad de la enzima. Enzimas deubiquitinating control de la degradación proteasomal y comparten homología funcional a sus sitios activos, que permite al usuario investigar la actividad de múltiples enzimas en un ensayo. Los lisados se obtienen a través suave ruptura celular mecánica y se incubaron con sitio activo sondas dirigidas. Enzimas funcionales etiquetados con las sondas mientras enzimas inactivas permanecen sin unir. Por plazoNing este ensayo, el usuario obtiene información tanto sobre la actividad y la expresión potencial de múltiples enzimas deubiquitinating de una manera rápida y fácil. El método actual es significativamente más eficiente que el uso de anticuerpos individuales para los predichos cien enzimas deubiquitinating en la célula humana.
Introducción
El sistema ubiquitina-proteasoma (UPS) sirve como una de las principales vías de degradación en la célula de mamífero. Sustratos con destino a la degradación en el proteasoma etiquetados de forma covalente con polímeros de ubiquitina (Ub) 1. Antes de que el sustrato elegido como diana entra en el proteasoma para la degradación, la etiqueta de poli-ubiquitina debe ser eliminado. Una clase de enzimas conocidas como deubiquitinating enzimas (DUBs) es responsable de la eliminación y el reciclaje de moléculas de ubiquitina 2. Se ha predicho desde el genoma humano que hay cerca de un centenar DUBs que trabajan en la celda 3. Con un gran núm....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
1. Lisis Preparación Buffer
- Disolver la sacarosa en agua desionizada (DI) agua para hacer una solución stock de 2 M. Filtrar una solución de sacarosa 2 M usando un vacío impulsado 0,22 micras de fluoruro de polivinilideno (PVDF) de filtro.
- Disolver ditiotreitol (DTT) en agua DI para hacer una solución madre 500 mM y almacenar en condiciones anaeróbicas. Disolver el cloruro de magnesio (MgCl2) en agua DI para hacer una solución madre 100 mM. Disolver el trifosfato de adenosina (ATP) hidrato disódico en agua DI para hacer una solución madre 50 mM.
- Hacer una solución de Tris a pH 7,4 mediante la disolución de clorhidrato de Triz....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
Células M17 y HeLa cultivadas se recogieron usando el método detallado en la (recolección de células 3.) protocolo y el tejido médula espinal de ratón se obtuvo. El / tejido de la médula espinal sedimento de células se colocó en un tubo con el tampón de lisis descrito en la sección de preparación de reactivos. Los sedimentos celulares se lisaron usando perlas de vidrio (Figura 1A) y muestras de tejido de médula espinal de ratón se homogeneizó usando el homogeneizador (Figura 1B). Despué.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
Desde ubiquitinación es una actividad celular fundamental, la comprensión de los mecanismos de regulación podría ser la clave para sacar a la luz los procesos de la enfermedad y la patología. El uso de HA etiquetada sitio dirigido sondas activas derivadas de Ub aquí presentados proporcionan un método sencillo, pero muy aplicable para el estudio de la degradación de proteínas mediada por Ub. Este método es más rápido y menos costoso que el estudio de cada uno de los DUBs individualmente.
En e.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Nos gustaría dar las gracias al laboratorio de Lee, de la Universidad de Minnesota para proporcionar las muestras de tejido de la médula espinal de ratones que fueron utilizados. Este trabajo fue apoyado por el Departamento de Programa de Defensa de ovario de Investigaciones Oncológicas (OCRP) OC093424 a MB, por el Fondo de Investigación del Cáncer y la Comunidad Randy máquina de afeitar de MB y por el cáncer ovárico de Alianza Minnesota (MOCA) a MB. Los financiadores no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión de publicar o preparación del manuscrito.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| PowerGen 125 (homogeneizador) | Fischer Scientific | 14-261-02P | |
| Filtros accionados por vacío 0,22 y micro; m | BPV2210 | ||
| Perlas de vidrio, lavadas con ácido ≤ 106 y micro; m (~ 140 tamiz de EE. UU.) | Sigma-aldrich | G4649-10G | |
| Sacarosa | Fischer Scientific | S6-212 | |
| DL-ditiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Cloruro de magnesio | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Adenosina 5'-trifosfato sódico sódico hidrato | Sigma-Aldrich | A26209 | |
| Clorhidrato de trizma | Sigma-Aldrich | T3253 | |
| Águila modificada de Dulbecco Medio Life | Technologies | 11965-092 | |
| Solución salina tamponada con fosfato | Life Technologies | 10010-023 | |
| Matraz para cultivo de tejidos 75 cm2 con vaso de filtro 250 ml 120/cs | Cellstar | T-3001-2 | |
| 0,05% Tripsina-EDTA (1x) | Life Technologies | 25300-054 | |
| HI FBS | Life Technologies | 16140-071 | |
| Anticuerpo monoclonal anti-HA producido en ratón | Sigma-Aldrich | H9658 | |
| Ubiquitina vinil sulfona (HA-tag) | Enzo Life Sciences | BML-UW0155-0025 | |
| Tampón de muestra SDS de Laemmli (4x, reductor) | Boston BioProducts | BP-110R | |
| Pierce BCA Protein kit de ensayo | Thermo Scientific | 23225 |
Referencias
- Ovaa, H., Kessler, B. M., Rolén, U., Galardy, P. J., Ploegh, H. L., Masucci, M. G. Activity- based ubiquitin-specific (USP) profiling of virus-infected and malignant human cells. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (8), 2253-2258 (2004).
- Wilkinson, K. D.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
Etiquetas
