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Summary

Here, we describe a semi-invasive optical microscopy approach for the induction of a Rose Bengal photothrombotic clot in the somatosensory cortex of a mouse in vivo. The technical aspects of the imaging procedure are described from induction of a photothrombotic event to application and data collection.

Abstract

In vivo imaging techniques have increased in utilization due to recent advances in imaging dyes and optical technologies, allowing for the ability to image cellular events in an intact animal. Additionally, the ability to induce physiological disease states such as stroke in vivo increases its utility. The technique described herein allows for physiological assessment of cellular responses within the CNS following a stroke and can be adapted for other pathological conditions being studied. The technique presented uses laser excitation of the photosensitive dye Rose Bengal in vivo to induce a focal ischemic event in a single blood vessel.

The video protocol demonstrates the preparation of a thin-skulled cranial window over the somatosensory cortex in a mouse for the induction of a Rose Bengal photothrombotic event keeping injury to the underlying dura matter and brain at a minimum. Surgical preparation is initially performed under a dissecting microscope with a custom-made surgical/imaging platform, which is then transferred to a confocal microscope equipped with an inverted objective adaptor. Representative images acquired utilizing this protocol are presented as well as time-lapse sequences of stroke induction. This technique is powerful in that the same area can be imaged repeatedly on subsequent days facilitating longitudinal in vivo studies of pathological processes following stroke.

Introduction

La técnica descrita permite visualizar in vivo respuestas celulares inmediatamente después de la inducción de la Rosa de Bengala photothrombosis en un ratón intacto. Rosa de Bengala (4,5,6,7-tetracloro-2 ', 4', 5 ', 7'-tetrayodofluoresceína) es un colorante fotosensible utilizado para inducir el accidente cerebrovascular isquémico en modelos animales (ratón y rata). Después de una inyección en bolo de RB a través de la vena de la cola y la iluminación posterior a través de un cráneo adelgazado con una luz láser de 564 nm, un trombo se induce causando un derrame cerebral fisiológica ^1. El método fue descrito originalmente por Rosenblum y El-Sabban en 1977, y más tarde fue adaptada por Watson a mediados de 1980 ^1,2. En breve, Rosa de Bengala se irradia con luz verde de excitación (láser de 561 nm en nuestro caso), que genera la producción de especies reactivas de oxígeno, que activa posteriormente factor tisular, un iniciador de la cascada de coagulación. La inducción de la cascada de coagulación produce un isquémico lesion que es patológicamente relevantes para accidente cerebrovascular clínico ^3.

Stroke tiene una fisiopatología compleja debido a la interacción de muchos tipos diferentes de células, incluyendo neuronas, glia, endotelio y el sistema inmunológico. La elección de la mejor técnica para el estudio de un proceso celular particular requiere múltiples consideraciones. Las técnicas experimentales caer en términos generales en una de tres categorías: in vitro, in vivo e in silico con cada uno con ventajas y desventajas Estudios in vitro tienen la desventaja principal de la eliminación de células de su entorno natural y por lo tanto no pueden reproducir los efectos observados en un intacta,. animal vivo. Las técnicas in vivo para la replicación proporcionar experimental mejorada de estados de enfermedad con una mayor importancia de la traducción. En silico generalmente se refiere a modelado por ordenador de una enfermedad o proceso celular, y mientras que cada vez más utilizado para estudiar las posibles interacciones farmacológicas para el examenPLE, cualquier información obtenida todavía debe ser probado en células o tejidos vivos.

El modelo ideal de accidente cerebrovascular en el laboratorio debe demostrar características patológicas similares a los observados en la población humana. Si bien hay características fisiológicas comunes de accidente cerebrovascular en la población humana, también hay muchas diferencias dependiendo del tipo de lesión experimentada. Carrera en la población humana se produce como pequeñas o grandes oclusiones de los vasos, lesiones hemorrágicas, y la arteria a arteria o cardio-embolias que dan lugar a los volúmenes de infarto variadas, así como las diferencias en los mecanismos relacionados con cada patología. La ventaja de la utilización de modelos de accidente cerebrovascular animal es la generación de infartos reproducibles que imitan las características de ictus humano. Los modelos más comunes de accidente cerebrovascular animales incluyen oclusión de la arteria usando: oclusión de la arteria cerebral media (métodos de incandescencia o embólicos endovasculares) que modelos MCAO distal y el modelo photothrombosis. Las ventajas de unad desventajas de cada modelo se han revisado en otro lugar (ver ⁴ y ^5). Los modelos globales isquémicos (MCAO), si bien es relativamente fácil de realizar son menos relevantes para acariciar humano que son modelos de accidente cerebrovascular focales. Además, estos métodos son muy variables en la inducción de lesiones infarto cerebral reproducibles. El modelo photothrombosis es altamente reproducible siempre que el experimentador controla sus experimentos bien, proporcionando una clara ventaja sobre los modelos de MCAO. Sin embargo, debido a insulto microvasculatura el modelo ha sido descrito para mostrar una penumbra isquémica mínimo, el área donde las células se cree que son rescatable ^6,7. Además, edema vasogénico y la formación de edema citotóxico también pueden ser inducidas después de la irradiación de la superficie de imágenes. A pesar de estas limitaciones de la técnica ha proporcionado una nueva visión de muchos procesos fisiológicos después del accidente cerebrovascular ^{8, 9, 10, 11.}

Protocol

Nota: Todos los animales procedimientos fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Texas Health Science Center en San Antonio y fueron consistentes con los lineamientos llegar. 1. La anestesia para la Preparación cortical Coloca el ratón en una cámara de inducción con 3.2% isofluorano mezclado con oxígeno para inducir anestesia. Observe la disminución de la tasa de respiración como el ratón se induce. Apriete la pata del ratón para determinar si el ratón está listo para pasar al cono de la nariz. Nota: El nivel de anestesia es un paso crítico en cualquier preparación in vivo y se debe tener cuidado de no inducir a un nivel que hará que la isquemia global. Una vez que el ratón se anestesia suficiente, traslado del animal a la plataforma de la cirugía / imagen y colocar la nariz del ratón en el cono de la nariz y aplicar 1-1,2% isofluorano para mantener un estado anestesiado. Asegúrese de que el ratón está mintiendo en una co temperaturaalmohadilla térmica ntrolled para mantener la temperatura corporal (37 ° C +/- 0,5 ° C) a través de los procedimientos restantes. Coloca un ungüento veterinario sobre los ojos para evitar la sequedad mientras que bajo anestesia. Monitorear la fisiología del ratón utilizando un sistema de oximetría de pulso usando la cola o el pie de clip proporcionado con el sistema. Comprobar que se mantiene la frecuencia respiratoria entre 50 a 65 respiraciones / min. Compruebe que el ritmo cardíaco se mantiene entre 300 a 450 latidos por minuto y la saturación de oxígeno se mantiene entre los 97 a 98% para asegurar la supervivencia a largo plazo del animal. Cuando el ratón se anestesia adecuada, afeitar el pelo sobre el cráneo usando una maquinilla eléctrica, eliminar el vello residual y limpio con betadine, seguido de un hisopo de etanol. Repita este procedimiento hasta tres veces para asegurar un ambiente quirúrgico estéril. 2. Procedimiento Quirúrgico Con el cuero cabelludo totalmente limpia y afeitada, hacer una incisión de 5 mm en el cuero cabelludo del ratón para revelar la fissu cranealres y para localizar bregma. Use un aplicador de algodón estéril para eliminar cualquier resto de fascia recubre el cráneo. Pegar un anillo hecho de encargo de acero inoxidable (Figura 1) con adhesivo de tejido al hueso que recubre la corteza parietal utilizando las coordenadas estereotáxicas de Bregma: -1 a -3 mm y lateral: 2-4 mm. Nota: El pegamento normalmente establece dentro de 2 min después de la colocación del anillo sobre el hueso. Coloque el anillo a un titular estereotáxica (Figura 2) para estabilizar el ratón y para evitar el movimiento durante la exploración. Bajo un microscopio de disección de grado quirúrgico, perforar lentamente una sección de 1-2 mm en el cráneo usando una herramienta dremel como la velocidad controlada (Meisinger 3.9 mm broca) asegurándose de mantener el nivel de zona, ya que se perfora. Lograr esto usando un patrón de zig-zag. Para evitar la acumulación de calor, ajuste la velocidad de perforación a la baja y tomar descansos frecuentes. Cuando el cráneo craneal convierte shinny en apariencia, continuará el adelgazamientodel cráneo utilizando una hoja de bisturí utilizando el mismo patrón de zig-zag para mantener el nivel de la superficie adelgazada lisa para facilitar la eliminación de capas delgadas de cráneo craneal. Con la punta de la hoja de bisturí hacer pequeños trazos lineales con una ligera presión para eliminar las capas delgadas de hueso a la vez. Continúe hasta la vasculatura es claramente visible a través del microscopio de disección. Si el experimentador perfora a través o romper el cráneo durante el proceso de adelgazamiento, la eutanasia del animal debido al daño probable que la corteza subyacente. Nota: El cráneo del ratón es de aproximadamente 300 micras de espesor y está compuesto de dos capas delgadas de hueso compacto (uno externo y uno interno de la capa) y una capa de hueso esponjoso intercalada entre las dos capas de hueso compacto. La capa externa del hueso compacto y la mayoría del hueso esponjoso se retiran dentro de la zona de perforación de 5 mm resulta en una capa de 50 micras aproximada de hueso compacto restante (ver Figura 2B). Visualización de la vasculatura se asegurará de que el cráneo final de adelgazado intacta es de aproximadamente 50 micras de espesor. Por consiguiente, el cráneo todavía está presente cuando adelgazado a este espesor. 3. Microscopio Set-up Utilice un sistema de microscopio invertido (sistemas de dos fotones convencional, confocal o) que tiene un inversor objetivo. Nota: También es posible utilizar un microscopio vertical estándar. El factor limitante será el espacio entre el escenario y los objetivos. Las modificaciones de la etapa puede ser necesario llevar a cabo esta configuración. Asegure la plataforma quirúrgica / formación de imágenes a una etapa por encargo que se encuentra a un lado de la base del microscopio. Nota: La plataforma se realiza mediante un conector de laboratorio para permitir el movimiento vertical de la plataforma quirúrgica / imagen bajo el objetivo. El jack de laboratorio está montado en una placa fijada a cuatro polos cilíndricos. (Ver Figura 2). Coloque el inversor objetivo contiene un 20Xobjetiva sobre la ventana craneal. Utilice una fuente de luz externa para encontrar la ventana craneal mirando a través de los oculares del microscopio y coloque el objetivo en el área de imagen. Nota: El área de formación de imágenes se denota por la presencia de la vasculatura. Para objetivos a base de agua, usar fluido cerebral espinal artificial (LCRa) (NaCl 130 mM; KCl 30 mM; 12 mM KH 2 PO 4; 200 mM NaHCO 3; 30 mM HEPES; y glucosa 100 mM) como el medio debido a la potencial fugas en la cavidad craneal durante la exploración (Figura 3). 4. Rosa de Bengala Tinte Preparación, Administración y de inducción de Stroke Preparar una solución / ml 20 mg fresca de Rosa de Bengala en el líquido cefalorraquídeo artificial (LCRa); filtrar y esterilizar antes de la administración. No vuelva a utilizar o almacenar la Rosa de Bengala, una vez que se ha mezclado. Prepare una solución fresca para cada experimento. Dar una inyección en la vena de la cola 0,1 ml de Rosa de Bengala, mientras que senlatado de la ventana craneal con un láser de 561 nm para asegurar la inyección adecuada de la solución. Nota: Rosa de Bengala se visualizará dentro de 5 segundos después de la inyección en la vasculatura del cerebro. Todo el recipiente debe estar lleno de Rosa de Bengala. Después de la inyección adecuada de tinte Rosa de Bengala elegir un recipiente apropiado para la trombosis basado en el diámetro del vaso (40-80 micras) para asegurar la reproducibilidad de un volumen de la lesión en particular. Diferenciar entre las arterias y las venas mirando a la dirección del flujo sanguíneo: arterias se moverán de diámetro más grande para los vasos de menor diámetro, las venas se mueven de menor a vasos de mayor diámetro. Esto se logra fácilmente mediante la visualización una vez que se inyecta Rosa de Bengala. Cambie el ajuste del microscopio de la siguiente manera: Aumentar el tiempo de permanencia. Nota: Esto variará dependiendo del sistema de microscopio que se utilizan. Aumentar la potencia del láser a 100%. Recoge imágenes de la secuencia de tiempo en 1 cuadro / s utilizando lavelocidad de exploración máxima. Analiza el ratón hasta que se forme un coágulo estable dentro de la embarcación. Nota: Normalmente, esto se logra a 5 minutos de la exploración continua (Ver Figura 4). Después de la inducción de la formación de coágulos usando Rosa de Bengala, quite el ratón de la zona de formación de imágenes de nuevo a la microscopio de disección. Retire con cuidado el anillo de acero inoxidable del cráneo craneal. Examine la ventana craneal para cualquier sangrado. Si se produce sangrado, dar por terminado el experimento. Utilice 6,0 monofilamento de sutura para cerrar la incisión sobre el cráneo. Coloca un ungüento antibiótico lo largo de la línea de sutura para prevenir la infección. Inyectar Buprenex (0,05 mg / kg) por vía subcutánea cada 12 horas durante tres días para el manejo del dolor. Devuelva el ratón a una cámara de recuperación después de la retirada de la anestesia hasta que esté completamente despierto y se mueve libremente. Devuelva el ratón a una jaula limpia para una mayor investigación en un momento posterior. 5. Imaging longitudinal en los días siguientes Emplear los siguientes métodos para realizar las imágenes longitudinal en los días posteriores post-photothrombosis. Anestesiar el ratón como se describe en la Sección 1 de los métodos. Tras la anestesia adecuada re-abrir el cuero cabelludo, eliminando las suturas residuales para reabrir la piel que cubre el campo de la imagen previamente perforado. Use un aplicador de algodón estéril para eliminar cualquier resto de fascia recubre el cráneo. Pegue un anillo hecho a medida de acero inoxidable (Figura 1) con adhesivo tisular en el hueso que cubre el campo de la imagen anterior. Coloque el anillo a un titular estereotáxica (Figura 2) para estabilizar el ratón y para evitar el movimiento durante la exploración. Busque la vasculatura que subyace el cráneo previamente adelgazada. Utilice inyección en la vena de la cola de FITC-dextrano para verificar la presencia del coágulo previamente inducido. Utilice 6,0 monofilamento de sutura para cerrar la encisión sobre el cráneo. Coloca un ungüento antibiótico lo largo de la línea de sutura para prevenir la infección. Inyectar Buprenex (0,05 mg / kg) por vía subcutánea cada 12 horas durante tres días para el manejo del dolor. Devuelva el ratón a una cámara de recuperación después de la retirada de la anestesia hasta que esté completamente despierto y se mueve libremente. 6. Verificación de Inducción Stroke (post mortem) A la conclusión de un estudio, verificar el volumen sistólico utilizando cloruro (TTC) tinción 2,3,5-trifeniltetrazolio como se muestra en la Figura 5. El método completo se puede encontrar en 12.

Representative Results

El objetivo de este método era para inducir un accidente cerebrovascular isquémico en modelos animales (ratón y rata) después de una inyección en bolo de RB a través de la vena de la cola y la iluminación posterior de un cráneo adelgazado con una luz láser de 561 nm. Las imágenes en la Figura 4 demuestran la progresión de la formación de coágulos dentro de un solo recipiente después de la irradiación de la zona en 0, 1, 1,5 y 2 min. Antes de la formación de coágulos de todo el recipient…

Discussion

La capacidad de traducir experimental ictus fisiopatología de animal a la aplicación humana ha estado plagado de fracaso. Sin embargo, el uso de modelos animales, tales como el modelo photothrombosis, permite una mejor comprensión de la fisiopatología de carrera y la exploración de nuevos enfoques terapéuticos para proporcionar neuroprotección después de un accidente cerebrovascular. Accidentes cerebrovasculares y microinfartos producidos por el modelo photothrombotic corticales pequeños son clínicamente relev…

Materials

			Reagents
Rose Bengal	Sigma	330000
Isoflurane Anesthetic	MWI Veterinary Supply	088-076
Vetbond	1469SB	1469SB
aCSF	126 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 10 mM glucose and 26 mM NaHCO3 (pH 7.4).
			[header]
			Equipment
Dissecting Scissors	Bioindustrial Products	500-410
Operating scissors 14 cm	Bioindustrial Products	12-055
Forceps Dumont High Tech #5 style, straight	Bioindustrial Products	TWZ-301.22
LabJack 132X80	Optosigma Co	123-6670
Platform for Labjack 8X 8	Optosigma Co	145-1110
Ear bar holder from stereotaxic setup	Stoelting/Cyborg	51654
Dispomed Labvent Rodent anesthesia machine	DRE, Inc.	15001
Tech IV Isoflurane vaporizer	DRE, Inc.	34001
F Air Canister	DRE, Inc	80120
Bain circuit breathing tube	DRE, Inc	86111B
Rodent adapter for bain tube	DRE, Inc	891000
O2 regulator for oxygen tanks	DRE, Inc	CE001E
Rodent induction chamber	DRE, Inc	15004C
Ethicon Silk 6-0; 18 in with P-3 needle	Suture Express	1639G
Objective inverter Optical Adapter	LSM technologies
Foredom drill Dual voltage 110/120	Foredom	134.53