Abstract
A doença de Alzheimer é uma doença neurodegenerativa que afecta o envelhecimento da população. Uma característica neuropatológica chave da doença é a sobre-produção de beta-amilóide e a deposição de placas de amilóide-beta em regiões do cérebro dos indivíduos afectados. Ao longo dos anos, os cientistas têm gerado numerosos modelos de rato da doença de Alzheimer que tentam reproduzir a patologia beta-amilóide. Infelizmente, os modelos de ratinho única imitar selectivamente as características da doença. A morte neuronal, um efeito proeminente nos cérebros de pacientes com doença de Alzheimer, é notoriamente ausente nestes ratinhos. Por isso, nós e outros têm utilizado um método de infundir diretamente espécies oligoméricas solúveis de beta-amilóide - Formas de amilóide-beta que têm sido provada a ser mais tóxico para os neurônios - stereotaxically no cérebro. Neste relatório nós utilizamos camundongos C57BL / 6J para documentar esta técnica cirúrgica de aumentar os níveis de beta-amilóide em uma região do cérebro select. Oinfusão alvo é o giro dentado do hipocampo, porque esta estrutura do cérebro, juntamente com o cérebro anterior basal, que é ligado pelo circuito colinérgico, representa uma das áreas de degeneração na doença. Os resultados de elevação beta-amilóide no giro denteado através de infusão estereotáxico revelam aumentos na perda de neurónios no giro dentado no prazo de 1 semana, enquanto existe um aumento concomitante na morte de células e perda de neurónios colinérgicos no membro vertical da banda diagonal de Broca do prosencéfalo basal. Estes efeitos são observados até 2 semanas. Nossos dados sugerem que o atual modelo de infusão de beta-amilóide fornece um modelo alternativo do mouse para abordar a morte dos neurônios específicos região em uma base de curto prazo. A vantagem deste modelo é que a beta-amilóide pode ser elevada de um modo espacial e temporal.
Introduction
Depósitos de placas amilóides, que são compostos de beta-amilóide (Ap 1-42), são um elemento-chave da patologia da doença de Alzheimer (DA). Numerosos estudos têm demonstrado que níveis elevados ou tóxicos de recombinante oligomeric Ap 1-42 provocar a morte neuronal, sináptica distrofia, perda e disfunção; bem como de aprendizagem e memória défices 1-4. Regiões do cérebro afetadas incluem o hipocampo, no córtex e estruturas subcorticais tais como o cérebro anterior basal ea 5,6 amígdala. Até à data, existem vários modelos de camundongos transgênicos que tentam simular o Aâ 1-42 patologia da AD. Dependendo da estirpe estes animais revelar-se útil para examinar seleccione características patológicas da DA. Infelizmente, com a excepção de duas linhas transgénicas, APP23 e 5XFAD, estes ratinhos não replicar completamente a perda neuronal, um aspecto chave da AD. Mesmo com a perda neuronal observada em APP23 e 5XFAD, a obser morte neuronalved foi sutil, dependente da idade, e isolado para algumas regiões selecione 7,8.
A infusão direta de oligomeric Ap 1-42 no cérebro do rato do tipo selvagem é um excelente modelo in vivo que replica o aspecto morte neuronal de amyloidopathy 1,9,10. Ao contrário dos modelos de ratinho transgénicos vulgarmente utilizados o modelo de infusão oligomérico Ap 1-42 é ideal para elevar de forma aguda Ap 1-42 níveis de um modo espacial e temporal. A vantagem da utilização de ratinhos de tipo selvagem para este modelo de compensação ou elimina efeitos colaterais potenciais de mutações introduzidas em linhas de ratos transgénicos. Estudos anteriores têm demonstrado que a infusão de níveis tóxicos de Ap 1-42 no hipocampo provoca a morte neuronal na proximidade do local de injecção dentro de 1 semana 1. Além disso, consistente com a observação de que Ap 1-42 é tóxico para os neurónios colinérgicos do prosencéfalo basal 11população colinérgicos neurônio (BFCN) que se projecta para o hipocampo diminui 20-50% no prazo de 7-14 dias após a beta-amilóide infusão 1,10 em camundongos, de forma eficaz permitindo que para os exames de circuitos neuronais isolado no cérebro. Desde projecto BFCN ipsilateralmente ao giro dentado do hipocampo 12, para a maior parte de controlo / veículo e oligoméricos Ap 1-42 soluções podem ser injectados em ambos os lados do cérebro, permitindo que sejam feitas comparações entre os hemisférios direito e esquerdo 1.
Neste relatório, iremos fornecer uma metodologia cirúrgica ea injeção detalhado para adultos de tipo selvagem camundongos C57BL / 6J. Esta estirpe do mouse é escolhido por causa de sua ampla utilização na pesquisa. Tecnicamente, qualquer região do cérebro podem ser direcionados para perfusão, no entanto aqui, vamos utilizar o giro denteado do hipocampo como o alvo para ilustrar a técnica.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Nota: Para toda a experimentação animal, Institucional e diretrizes nacionais para o cuidado e uso de animais de laboratório foram seguidas.
1. Prepare Instrumentos Cirúrgicos e Soluções para Cirurgia
- Autoclave todos os instrumentos cirúrgicos de aço inoxidável.
- Preparar etanol a 70% por diluição de 200 proof de etanol absoluto com grau molecular de água desionizada destilada estéril.
- Fixe a agulha G 29 para a seringa Hamilton. Limpe o interior do Hamilton seringa e agulha através da elaboração e da água de ejecção nanopura repetidamente durante 1 min. Repita este procedimento com etanol 70%.
- Retirar o êmbolo e a agulha da seringa de Hamilton. Ar secar as peças em um fluxo laminar vertical S / N.
- Irradiar a agulha e seringa com luz ultravioleta durante 30 minutos antes da utilização.
- Preparar a solução salina através da dissolução de NaCl em água de grau molecular para um peso final a concentração em volume de 0,9%. Esterilização emze a solução filtrando-a através dos poros do filtro 0,2 m.
2. Prepare oligomica Ap 1-42
- Monomerize e ressuspender recombinante humana Ap 1-42 em DMSO a 5 mM exactamente como descrito na publicação da Fa "e outros 13.
- Diluir 5 mM Ap 1-42 com estéril (1x) PBS 100 mM na véspera da cirurgia.
- Misture bem a solução por trituração.
- Incubar Ap 1-42 solução durante 12 horas a 4 ° C.
Nota: As soluções de controle, tais como a diluição de DMSO em PBS ou mexidos / retrocesso Ap 1-42 deve ser preparado da mesma forma que Ap 1-42.
3. determinar as coordenadas de injeção
- Use os adultos atlas do cérebro do rato para determinar a exacta ântero-posterior (AP), medial-lateral (ML), e dorso-ventral (DV) coordenadas para a região do cérebro de 14 interesse.
Nãote: Para ilustrar a técnica, escolhemos o giro denteado do hipocampo como o alvo com as seguintes coordenadas a partir do bregma: AP, -2,00 mm; ML, ± 1,3 mm; DV, -2,2 mm. O sinal negativo que precede o valor AP indica que ele é de 2,00 mm posterior do bregma. O sinal ± precedendo o valor ML indica a direção esquerda e direita do centro. Por fim, o sinal negativo que precede o DV indica que está em movimento ventral a partir da superfície do cérebro.
4. estereotáxica Setup Moldura
- Usar uma máscara cirúrgica rosto, jaleco limpo, e luvas cirúrgicas estéreis.
- Limpe instrumento estereotáxico e adaptador de mouse com etanol 70%.
- Deite-campo cirúrgico estéril sobre o balcão.
- Colocar o aparelho estereotáxico com um adaptador do rato no topo da cobertura cirúrgica estéril.
- Limpe a almofada de aquecimento do mouse com etanol 70%. Posicione a almofada de aquecimento sobre a cama quadro estereotáxico. Use labora uso geralfita rotulagem tory a fita para baixo a almofada de aquecimento sobre a cama adaptador de mouse.
- Fixe a almofada de aquecimento para a bomba de água morna recirculator acordo com as instruções do fabricante.
- Ligue a bomba recirculator água morna e definir a temperatura a 37 ° C, e depois esperar até que ele atinja a temperatura.
- Apor o 50 ul seringa Hamilton com uma agulha G 29 sobre a armação estereotáxica aparafusando-o sobre o eixo vertical, motorizada de injecção de acordo com as instruções do fabricante.
- Ligue o esterilizador talão e esperar até atingir a temperatura programada pelo fabricante.
Nota: Este é usado para esterilizar instrumentos de aço inoxidável entre os animais. Leva instrumentos de 20 segundos de contacto com os grânulos de esterilização. - Ligue placa quente e configurá-lo para 42 ° C e coloque uma gaiola vazia limpo no topo.
- Enquanto a seringa Hamilton está fixada no quadro estereotáxico usar o i motorizado estereotáxiconjector para elaborar o 1-42 solução de Ap.
Nota: Elaborar mais de 4 mL da solução para a seringa e, em seguida, usar o injector estereotáxico para definir o volume de injecção. Operar o injector de acordo com as instruções do fabricante.
5. Preparação de animais
- Determinar o peso do rato utilizando a escala de pesagem.
- Anestesiar rato com cetamina / xilazina coquetel a 100 mg / kg de cetamina e 10 mg / kg de xilazina por injecção intraperitoneal (IP). Monitore a profundidade da anestesia com a perda de toe pitada reflexo.
- Após o mouse está sedado tomar a máquina de cortar cabelo e fazer a barba a cabeça para expor a pele ao longo do crânio.
- Colocar o rato no topo da almofada de aquecimento na parte superior do leito estereotáxico.
- Use a espátula para abrir a boca e colocar os dentes incisivos dentro do guarda-dentes. Prenda o porta-objetivas sobre a face do mouse. Apertá-lo com cuidado e não muito apertado.
- Posição as travessas de ouvido bilaterais em conduto auditivo para proteger a cabeça. Mova cada barra transversal até que ela atinge o crânio, e, em seguida, gire o parafuso para prendê-la.
- Para garantir que a cabeça está garantido usar o dedo indicador para empurrar suavemente para baixo na cabeça. Se a cabeça está devidamente assegurado que não vai dar para fora ou mover quando pressionado.
- Aplique uma gota de creme para os olhos ou colírio para os olhos para mantê-los úmidos. Certifique-se de que os olhos são úmido durante todo o procedimento cirúrgico.
- Para desinfectar o local cirúrgico usar cotonetes estéreis para aplicar a solução de betadine para a pele sobre o crânio, seguido de etanol a 70%. Realize o betadine alternada e 70% de etanol limpeza mais 2 vezes.
6. Cirurgia e Infusão
- Use um bisturi para fazer uma incisão de 2-3 mm na linha média do couro cabeludo, e então usar uma tesoura fina reta para estender a linha de incisão para 1,0-1,5 cm para expor a sutura sagital, bregma e lambda do crânio, marcos as coordenadas estereotáxicas que se baseiam. Use micro grampos para manter a pele separados.
Nota: As posições bregma e lambda são explicados no atlas do cérebro do rato "O cérebro do rato em estereotáxica coordenadas" 14. - Pegue um cotonete, mergulhe-o em solução salina estéril, e usá-lo para limpar o crânio. Em seguida, use um cotonete seco e limpo para secar o crânio.
- Use uma caneta de ponta fina estéril para marcar um ponto no bregma. Utilizar o micromanipulador estereotáxico para posicionar a seringa de Hamilton para que a ponta da agulha apenas toca o ponto no bregma.
- Grave coordenar a DV.
- Para verificar se o eixo PA do nível do crânio é mover a seringa Hamilton posteriormente de modo a que a ponta da agulha atinge o ponto de lambda.
- Grave a posição DV. Certifique-se coordena o DV para bregma e lambda são de 0,5 mm.
Nota: O objectivo é minimizar a diferença entre DV bregma e lambda.
- Usa-osicromanipulator para retornar a agulha da seringa Hamilton ponta de volta para o ponto bregma.
- Grave a posição inicial AP.
- Calcular a posição final AP subtraindo 2,00 milímetros a partir da AP a partir de coordenadas.
- Use o micromanipulador para reposicionar a agulha de seringa Hamilton com a AP cota final.
- Grave coordenar o atual ML.
- Calcule a esquerda e direita que termina ML coordena adicionando ou subtraindo 1,3 milímetros a partir da partida ML coordenadas.
- Use o micromanipulador para mover a agulha da seringa Hamilton, quer coordenar a ML terminando.
- Toque a ponta da agulha para a superfície do crânio em ambos terminam coordenadas ML e gravar as coordenadas DV e certifique-se os valores estão dentro de 0,5 mm.
Nota: O objectivo é minimizar a diferença entre os dois DV terminando coordenadas ML. - Enquanto em um final de coordenadas puxar a agulha para cima 0,5-1 cm sobre o crânio. Pegue uma caneta de ponta fina estéril para marcar um ponto no the a superfície do crânio. Repita este passo para o lado contralateral do crânio.
- Toque a ponta da agulha para a superfície do crânio em ambos terminam coordenadas ML e gravar as coordenadas DV e certifique-se os valores estão dentro de 0,5 mm.
- Balançar a seringa Hamilton clara para fora do caminho.
- Anexar 0,8 milímetros cabeça de perfuração para a broca. Pegue a furadeira com ambas as mãos, defina os cotovelos sobre a superfície da mesa para a estabilidade, e posicionar a cabeça da broca ligeiramente acima do ponto sharpie sobre a esquerda ou direita ML coordenadas. Activa a broca, diminuir a ponta da broca para a superfície do crânio para introduzir um orifício no crânio. Repita este passo para o lado contralateral.
Nota: Alguns hemorragia pode ocorrer a partir dos furos recentemente introduzidos. Se houver sangramento, em seguida, use um cotonete limpo e seco para enxugar o sangue. - Mova a seringa Hamilton de volta para a posição sobre um dos buracos ML recentemente introduzidas. Abaixe a agulha Hamilton apenas após o crânio. Neste ponto, deve ter cuidado para não perfurar o cérebro. Para certificar-se de que a agulha passou o crânio levar o seu dedo indicador e empurre a agulha contra o crânio para fazer sure a agulha não sair do furo.
- Grave coordenar o DV partida.
- Calcule coordenar o DV terminando subtraindo 2,2 milímetros do DV começando coordenadas.
- Abaixe a agulha até o DV terminando coordenadas.
- Activar a bomba injectora estereotáxico para bombear 4 ul de Ap 1-42 no giro dentado, a uma taxa de 0,5 mL / min.
- Quando a conclusão da perfusão deixar a agulha permanecer no lugar durante um 1 minuto adicional de minimizar o refluxo da solução para fora do local de injecção.
- Mover a agulha para o outro lado do cérebro e repetir as etapas de 6,13-6,18.
7. Remoção Animal e Cuidados Pós-Operatórios
- Soltar os bares de ouvido e proteção para o rosto / nariz. Retirar o mouse do aparelho.
- Use um estudante fórceps padrão normal para puxar fechar o couro cabeludo e, em seguida, selar a ferida com sutura.
- Injectar 1 ml de solução salina estéril para o mouse via IP para a hidratação.
- Emject buprenorfina (0,1 mg / kg) por via subcutânea para aliviar a dor.
- Manter o rato na gaiola vazia limpo situado no topo de 42 ° C chapa quente até que ele acorda, em seguida, devolvê-lo à sua gaiola de habitação com amplo comida e água.
- Administrar buprenorfina, por injecção subcutânea a cada 12 horas durante 3 dias para alívio da dor.
Remoção 8. Sutura
- Anestesiar rato com cetamina / xilazina coquetel a 100 mg / kg de cetamina e 10 mg / kg xlyazine por IP. Nota: Isto é feito 7-10 dias após a cirurgia.
- Use um estudante fórceps padrão standard e uma tesoura fina reta para remover a sutura.
- Injectar 1 ml de solução salina estéril para o mouse via IP para a hidratação.
- Manter o rato em uma gaiola vazia limpo situado no topo de 42 ° C chapa quente até que ele acorda, e, em seguida, devolvê-lo à sua gaiola de habitação com amplo comida e água.
9. sacrifício de animais e processamento de tecidos
- Anestesiar o mouse e perfuse com paraformaldeído a 4% 15, remover o cérebro, e processá-lo para cryosectioning 16.
Nota: O tempo de sacrifício de animais depende do experimentador. No entanto, para os nossos estudos, escolheu 7 e 14 dias após a cirurgia.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
O presente método de preparação de humano recombinante oligomérico Ap 1-42 produz espécies oligoméricas solúveis constituídos por monómeros, dímeros, trímeros e tetrâmeros (Figura 1A). Estes baixo peso molecular de espécies Aâ 1-42, mas não as fibrilas e placas, foram mostrados em várias configurações para ser mais tóxico para os neurônios 1,4,9,17-19. Para determinar se ou não oligomeric Ap 1-42 induz a morte dos neurônios no cérebro do rato Ap 1-42 (4 ul de 100 mM solução estoque) foi infundida na DG do hipocampo em um hemisfério de 9 meses de idade do tipo selvagem C57BL / 6J. O peso de um hipocampo de ratinhos C57BL / 6J é estimado em cerca de 0,018 g e, portanto, a entrega de Ap 1-42 era de aproximadamente 100 ug / g. O DG contralateral do mesmo cérebro de ratinho foi infundido com uma solução de controlo / veículo - que consistia de um volume igual de DMSO utilizado para dissolver 1- Ap42 diluído em (1x) PBS - para comparação. Como mencionado previamente mexidos ou reverter Ap 1-42 podem ser utilizados como controlo para efeitos de comparação, uma vez que previamente encontrado nenhum efeito em neurónios do hipocampo 1. Como a introdução da agulha no cérebro cria dano do tecido local (Figura 1B) e as causas eventual colapso DG optou-se por efectuar análises pós-injecção ao lado do tracto injecção onde o tecido ainda está intacta. Dentro de 1 semana de Ap 1-42 injecção DG exibiram elevados níveis de Ap 1-42 na camada molecular e a camada de células polimórfica na proximidade do local de injecção (Figura 2A). Aos 7 e 14 dias de Ap 1-42 provocou aumentos na coloração TUNEL-positivo e diminuição do DG espessura, confirmando os efeitos neurodegenerativos de Ap 1-42 (Figura 2B).
Porque os neurônios colinérgicos BF projetar para o DGdo hipocampo determinamos próximo se a perda de neurônios na DG desencadeia BF degeneração. Para este estudo, um traçador de Fluorogold retrógrado (2% de suspensão) foi co-injectada juntamente com Ap 1-42 para o DG. 7 dias seguintes Fluorogold injecção foi detectado na BF (Figura 2C), sugerindo transporte retrógrado da etiqueta através de neurónios colinérgicos. Por conseguinte, com a finalidade de quantificação da BF escolhemos neurónios Fluorogold-positivos, porque isso indica que os terminais neuronais foram expostas a Ap 1-42 na DG. Em ambos 1 e 2 semanas após a infusão DG Ap 1-42, o núcleo da banda diagonal - uma sub-região da BF onde os neurónios colinérgicos projectar para o DG - ipsilateral ao local Ap 1-42 -injected aumentos na coloração TUNEL exibiram e diminui em neurónios colinérgicos (Figura 2D). A perda de neurônios observada no BF confirma estudos anteriores que ligam a destrutivaefeitos de Ap 1-42 para a via 1,10 BF-hipocampal. É também importante notar que, a partir da comparação entre o ponto de tempo de 2 semanas a 1 semana ponto de tempo no lado do núcleo da banda diagonal onde a solução de controlo / veículo foi injectado na DG houve aumentos adicionais na coloração TUNEL e diminui em neurónios colinérgicos (Figura 2D, a tabela). Esses resultados refletem reduções significativas na espessura GCL e aumentos de rotulagem TUNEL-positivo (Figura 2B, tabela) na DG do lado do veículo injetado comparação entre os dois momentos pós-injeção, o que implica que o trauma físico causado pela agulha contribui para degeneração ao longo do tempo. Mesmo com este efeito colateral indesejável da agulha, os efeitos neurodegenerativos de Ap 1-42 são ainda significativamente maior do que os da solução de controlo / veículo (Figura 2D). Tomados em conjunto, o actual modelo de infusão effectively reproduz os efeitos tóxicos de Ap 1-42 no cérebro do rato dentro de 7 dias, tornando este um modelo atraente para estudar a curto prazo Ap 1-42 estimulação.
Figura 1. oligomica Ap 1-42 preparação e de cérebro de ratinho tracto injecção visualização. (A) 2? M oligomica Ap 1-42 foi separado em gel de tricina a 10-20% e transferidas para uma membrana de nitrocelulose. A membrana foi colocados a hibridar com anticorpo 6E10 1-42 de Ap (1: 1000). (B) 1-42 de Ap (4 uL de 100 uM de solução) ou controlo / veículo foi infundida na esquerda e DG direito do hipocampo, respectivamente, de 9 meses de idade C57BL / 6J. Os ratinhos foram sobreviveu durante 7 dias. Os cérebros foram seccionados a 20 um por secção. Secções do hipocampo foram coradas para DAPI. Marcas de hash retratamo tracto injecção. As setas mostram desabou DG. A barra de escala representa 200 um. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. oligomica Ap 1-42 induz a morte dos neurônios na DG e da BF. De Controle / veículo ou Ap 1-42 (4 ul de 100 mM solução) foi infundida na esquerda e DG direito do hipocampo, respectivamente, de 9 de meses de idade C57BL / 6J. Os ratinhos foram sobreviveram durante 7 ou 14 dias. Os cérebros foram seccionados a 20 um por secção. (A) 7 dias após a injeção de seções do hipocampo coradas para Aâ 1-42 (anticorpo NU4, 1: 2.000). ML, camada molecular; GCL, camada de células ganglionares; PCL, camada celular polimórfica. A barra de escala representa 50 um. (B (C) ou veículo Ap 1-42 co-injectados com Fluorogold (solução 2%). Rotulagem Fluorogold determinada na BF 7 dias pós-injecção. Slides contendo a BF foram escolhidos aleatoriamente. Rotulagem Fluorogold foi usada para determinar a região de interesse. Uma vez que foi identificada a região de interesse fatias cerebrais adjacentes foram usadas para manchar para marcadores de interesse. As inserções são regiões em que as imagens em (D) são escolhidos. A barra de escala representa 200 m. (D) 7 ou 14 dias após a injeção de seções BF coradas para ChAT (1: 100, policlonal de cabra) ou TUNEL. *** P <0,001 comparado com 1 semana. * P <0,05 em relação ao veículo. A quantificação foi feita em toda a regiãode interesse. O limite entre o septo medial e na faixa diagonal está delineada com base na localização da comissura anterior. A barra de escala representa 100 m. (N = 5 ratinhos). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Para conseguir um sucesso Ap 1-42 injeção do experimentador ou cirurgião deve: 1) utilizar uma técnica asséptica; 2) identificar corretamente a região do cérebro de interesse com coordenadas precisas; 3) ser capaz de garantir adequadamente o mouse no quadro estereotáxico com o cérebro nivelado no eixo AP e ML; 4) tem a capacidade de operar o micromanipulador com precisão; 5) Garantir cuidados pós-operatórios adequada. Se essas etapas principais são seguidos do mouse deve sobreviver à cirurgia sem infecção observável.
De acordo com estudos in vitro, nós e outros têm mostrado que Ap 1-42 diretamente administrados no hipocampo provoca a morte dos neurônios 1,4,9,10, que descreve uma das características-chave do AD. A degeneração é claramente evidente na proximidade do local de injecção, como mostrado por uma diminuição no volume do giro dentado que é complementado por um aumento nos marcadores de degeneração 1. Além disso, tele neurónios colinérgicos que projectam para o hipocampo de morrer de uma forma retrógrada, como mostrado por uma diminuição na rotulagem colinérgica e um aumento da coloração TUNEL positivos na BF 1,10. Assim, este modelo in vivo serve como um excelente modelo para investigar os efeitos semi-agudas de Ap 1-42 localmente. A principal vantagem deste modelo de injeção é sua natureza dinâmica: qualquer região do cérebro podem ser direcionados e diferentes animais idosos podem ser utilizados. 9 meses de idade camundongos machos foram escolhidos em nossos experimentos porque acreditamos aumentando Ap 1-42 níveis em ratos mais velhos melhores simula a doença que ocorre em pessoas mais velhas. Além disso, nosso objetivo é manter os experimentos consistente usando ratos da mesma idade. No entanto, os ratinhos de todas as idades poderiam ser utilizados para a injecção. No passado nós experimentamos em ratos que eram 16 meses de idade e outros usaram ratos que eram 2 meses de idade 9,10. Apenas camundongos machos deve ser utilizado em estudos como camundongos fêmeas exibem estroflutuações do nível gen e estrogênio é conhecido por ter efeitos neuroprotetores 20. Embora muitos interesses de investigação centram-se os efeitos patológicos de Ap 1-42, há também evidências de que baixos ou fisiológicos Ap 1-42 níveis são necessários para as funções normais de aprendizagem e memória 21,22. Nestes estudos, os investigadores reduzido a concentração de Ap 1-42 injectado e infundido no hipocampo 22,23, eficazmente revelando ainda outro exemplo da natureza dinâmica da utilidade deste paradigma. Outros compostos que foram infundidos com sucesso estereotaxicamente incluem drogas, vírus, siRNA, anticorpos, péptidos e 1,22-26 para investigar vários efeitos que vão desde a morte celular / sobrevivência ao comportamento animal. Assim, existem numerosas aplicações para empregando este paradigma de infusão.
A metodologia descrita infusão, enquanto exibem vários potenciais no vivo estudos utilizando esta técnica, também vem com limitações inerentes. Em primeiro lugar, este modelo apenas tentativas para reproduzir os efeitos de Ap 1-42 em uma região do cérebro isolado. Em segundo lugar, o sítio da injecção está danificado da introdução de uma agulha no interior do cérebro. Isso contribui para a morte celular adicional e gliose. Assim, a análise deve ser executada fora do tracto injecção. Com o controle do veículo apropriado no lado contralateral do mesmo cérebro isso não deve ser um problema, pois o veículo injetado e Aâ 1-42 soluções se espalhou para tecidos adjacentes. Em terceiro lugar, porque os neurónios colinérgicos BF projectar para o hipocampo, o dano físico do hipocampo, como é evidente pelo colapso da DG por a agulha (Figura 1B) podem inadvertidamente matar alguns BFCNs. Felizmente, examinando o circuito neuronal no curto prazo - no prazo de 1 semana de uma infusão de um único tiro - não representa um problema, já que nossos dados sugerem que o aumento damorte colinérgicos no prosencéfalo basal é o resultado de Ap 1-42 e não a partir do trauma da agulha; injecções de controle fornecem a análise apropriada. Os dados sugerem que a degeneração do DG também é necessário para a perda de neurónios colinérgicos, como BF estes neurónios perdem os seus alvos sinápticos (Figura 2B). Infelizmente, para os animais sobreviventes até 2 semanas lado injectado o veículo mostra uma elevação significativa da morte BFCN mais de 1 semana de pós-veículo animais injectados que parece ser devido em parte à degeneração e adelgaçamento do giro denteado, resultante do trauma físico do agulha. No entanto, mesmo nesta fase os dados sugerem que é significativamente mais morte na BF ipsilateral ao local -injected Ap 1-42. Em quarto lugar, a identificação de limites anatómicos subtis pode ser difícil de alcançar. Por exemplo, a fronteira entre o septo medial e na faixa diagonal foi determinada com base na localização da anteriorcomissura, uma técnica que foi previamente descrito 27. Além disso, devido à projecção ipsilateral neuronal colinérgica BF - principalmente a partir do septo medial e o membro vertical da banda diagonal (MS / DB) - para o giro denteado do hipocampo 12,28,29 decidimos injectar um hemisfério com Ap 1-42 e usar o hemisfério oposto como controlo para efeitos de comparação. É concebível que uma preocupação para este paradigma seria a correta identificação da fronteira que separa esquerda e direita MS / DB. Enquanto o MS está na região de linha média, os bancos de dados são mais lateral. Para este trabalho atual e nossa mais recente publicação 1 fomos capazes de distinguir confortavelmente DB esquerda e direita. Nossa quantificação revela Bate-Papo (+) neurônios diminuir em cerca de 25% no DB em Ap 1-42 lado do -injected. No entanto, não detectamos quaisquer alterações significativas no chat (+) neurônios no MS 1. Devido à loc lateraisção do DBS e as mudanças observadas, sentimos que eram justificadas para empregar veículo e Aâ 1-42 injeções dentro do mesmo animal. Além disso, o teste duas condições experimentais diferentes dentro do mesmo animal não só maximiza a utilização do animal, mas também reduz o potencial variabilidade de animal para animal. Enquanto nosso projeto experimental nos permite comparar os hemisférios esquerdo e direito é concebível esta técnica de comparação pode não ser viável em estudos futuros, ou seja, se o septo medial é o principal foco do estudo. Em tal caso, cada animal terá que servem como uma condição experimental. Assim, a utilização de animais é à discrição dos experimentadores. Em quinto lugar, pode o modelo de injeção de corrente ser utilizado para outros-outs de leitura, tais como comportamento? Nosso propósito em empregar o modelo atual de injecção Ap 1-42 foi avaliar os efeitos neuropatológicos de Ap 1-42 in vivo e compará-lo com resultados in vitro a 1 (Figura 1B e 2B) quando se atingir a agulha de injecção para dentro ou perto da DG aos 7 dias a destruição do DG pode dar origem a alterações comportamentais não intencionais. Assim, se um estudo requer o exame do efeito de Ap 1-42 sobre o comportamento dependente do hipocampo, em seguida, o alvo de injecção podem ter de ser reposicionado perto do hipocampo, em vez de directamente para isso e permitir Ap 1-42 difundir-se no hipocampo. Dito isto, a utilização do paradigma de injecção de corrente para o teste de comportamento é possível, mas requer mais testesção e caracterização, e a estratégia experimental final será determinado pelo utilizador final. Curiosamente, há estudos de comportamento do roedor anteriores que envolvem a entrega externa de Ap 1-42 diretamente no cérebro. 22,30 Tomadas em conjunto, estas limitações devem ser considerados no projeto em estudos com ratos in vivo empregando este modelo.
Uma vez que nenhum modelo único rato na existência capta os efeitos patológicos completos de AD o estereotáxico Ap 1-42 técnica de infusão fornece experimentadores com uma alternativa in vivo Ap modelo 1-42 mouse. Quando realizada por um indivíduo bem treinado este modelo é mais adequado para estudos de curto prazo com foco sobre os efeitos de Ap 1-42 em uma região específica do cérebro ou circuitos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional de Distúrbios Neurológicos e Derrame conceder NS081333 (a CMT), concessão Associação NIRG-10-171721 de Alzheimer e Instituto Nacional de Saúde Mental de concessão MH096702 (a UH), e do Instituto Nacional sobre Envelhecimento financiado pela pesquisa da doença de Alzheimer Centro da Universidade de Columbia concessão piloto AG008702 (para YYJ e JB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine HCl (100 mg/ml) | Henry Schein Medical | 1049007 | 100 mg ketamine per 1 kg animal |
| Xylazine (20 mg/ml) | Henry Schein Medical | not available | 10 mg xylazine per 1 kg animal |
| Buprenex (0.3 mg/ml) | Henry Schein Medical | 1217793 | 0.1 mg buprenex per 1 kg animal |
| Aβ1-42 | David Teplow/UCLA | not available | 100 μM; This amyloid was used in the paper |
| Aβ1-42 | Bachem | H-1368 | Can be used in place of amyloid from the Teplow lab |
| Aβ1-42 | American Peptide | 62-0-80B | Can be used in place of amyloid from the Teplow lab |
| Scrambled Aβ1-42 | American Peptide | 62-0-46B | Can be used as control peptide for comparing Aβ1-42 |
| NU4 Antibody (Oligomeric Amyloid Antibody) | Gift from William Klein/Northwestern U. | not available | 1:2,000 dilution |
| Anti-Amyloid Oligomeric Antibody (Polyclonal Rabbit) | EMD Millipore | AB9234 | May be used in place of Nu4; needs to be tested by the end user |
| 6E10 Antibody (Monoclonal Mouse) (Amyloid Antibody) | Biolegend | sig-39320 | 1:1,000 dilution |
| ChAT Antibody (Polyclonal Goat) | Millipore | AB144P | 1:100 dilution |
| DeadEnd Fluorometric TUNEL system | Promega | G3250 | Follow manufacturer's directions for use |
| Prolong Gold Antifade Reagent with DAPI | Invitrogen | P36935 | Use when coverslipping slides |
| Fluorogold | Fluorochrome, LLC | not available | 2% solution |
| Absolute Ethanol (200 proof) | Fisher Scientific | BP2818-4 | For making 70% ethanol for sanitizing and disinfecting |
| Novex 10-20% Tricine gel | Life Technologies | EC6625BOX | For separating Aβ1-42 |
| Novex Tricine SDS Running Buffer (10X) | Life Technologies | LC1675 | For running 10-20% Tricine gels |
| Novex Tris-Glycine Transfer Buffer (25X) | Life Technologies | LC3675 | For transferring 10-20% Tricine gels |
| SuperSignal Western Blot Enhancer | Thermo Scientific | 46640 | For enhancing Aβ1-42 signal; follow manufacturer's protocol |
| Protran BA79 Nitrocellulose Blotting Membrane, 0.1 μm | GE Healthcare Life Sciences | 10402088 | For transferring 10-20% Tricine gels |
| Xcell SureLock Mini-Cell | Life Technologies | EI0001 | Electrophoresis aparatus for running 10-20% Tricine gels |
| GenTeal Lubricant Eye Gel | Novartis | not available | For keeping the mouse eyes moist during surgery; can be found in local pharmacy stores |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Refresh Optive Lubricant Eye Drops | Allergan | not available | For keeping the mouse eyes moist during surgery; can be found in local pharmacy stores; Can be used in place of GenTeal |
| Betadine | Stoelting | 50998 | For sanitizing and disinfecting |
| Round/Tapered Spatula | VWR | 82027-490 | For opening animal mouth |
| Bulldog Serrefines Clamps (Jaw Dims. 9X1.6 mm; Length 28 mm) | Fine Science Tools | 18050-28 | Optional; For keeping scalp skin apart during injection |
| Straight Fine Scissors (Cutting edge 25 mm; Length 11.5 cm) | Fine Science Tools | 14060-11 | For cutting scalp |
| #3 Scalpel Handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| #11 Surgical Blade | Fine Science Tools | 10011-00 | For making scalp incision |
| Student Standard Pattern Forcep (Tip Dims. 2.5x1.5 mm; Length 11.5 cm) | Fine Science Tools | 91100-12 | For holding scalp closed during suturing |
| Trimmer Combo Kit | Kent Scientific | CL9990-1201 | For shaving hair |
| T/Pump Warm Water Recirculator | Kent Scientific | TP-700 | For warming animal during surgery |
| Resusable Warmining Pad (5" x 10") | Kent Scientific | TPZ-0510FEA | For attaching it to the T/Pump warm water recirculator to warm the animal during surgery |
| Cordless Micro Drill | Stoelting | 58610 | Use 0.8 mm steel burrs to drill holes in the skull |
| Lab Standard Stereotaxic Instrument with Mouse & Neonatal Rat Adaptor | Stoelting | 51615 | |
| Just for Mouse Stereotaxic Instrument | Stoelting | 51730 | Can use this in place of Stoelting Cat. #51615 |
| Quintessential Stereotaxic Injector | Stoelting | 53311 | |
| Dry Glass Bead Sterilizer | Stoelting | 50287 | For sterilizing stainless steel instruments |
| Sterile Surgical Drape (18" x 26") | Stoelting | 50981 | |
| Hamilton Syringe 50 ml, Model 705 RN SYR, NDL | Hamilton Company | 7637-01 | For brain injection; use different syringes for different solutions |
| 29 G Needle, Small Hub RN NDL | Hamilton Company | 7803-06 | For attaching to the Hamilton syringe for brain injection |
| 1 ml BD Tuberculin Syringes | VWR | BD309659 | For administering anesthesia and saline |
| 30 G Needle (0.5") | VWR | BD305106 | For administering anesthesia and saline |
| Portable Electronic CS Series Scale (Ohaus) | VWR | 65500-202 | For weighing animals to determine anesthesia dose |
| Hot plate (Top Plate Dims. 7.25x7.25 in) | VWR | 47751-148 | For warming animals post-surgery |
| Sofsilk Silk Suture C-1 Cutting 3/8, 12 mm | Covidien | S1173 | For closing wound |
| Vetbond Tissue Adhesive (3M) | Santa Cruz Biotechnology | sc-361931 | Optional: for aiding in wound closure; Use with suture. |
| Cotton-Tipped Wooden-Shaft Sterile Applicators | Fisher scientific | 22-029-488 | For cleaning and drying surgical wound |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | For collecting brain sections |
| VWR Micro Cover Glass 24 X 50 mm | VWR | 48393241 | For mounting microscope slides |
| Thermo Scientific Nalgene Syringe Filter 0.2 μm | Fisher Scientific | 194-2520 | For sterilizing saline solution |
| Sterile dual tip skin markers by Viscot Medical | Medline | VIS1422SRL91 | For marking coordinates on the skull |
References
- Baleriola, J., et al. Axonally Synthesized ATF4 Transmits a Neurodegenerative Signal across Brain Regions. Cell. 158 (5), 1159-1172 (2014).
- Haass, C., Selkoe, D. J. Soluble protein oligomers in neurodegeneration: lessons from the Alzheimer's amyloid beta-peptide. Nature reviews. Molecular cell biology. 8 (2), 101-112 (2007).
- Knowles, J. K., et al. The p75 neurotrophin receptor promotes amyloid-beta(1-42)-induced neuritic dystrophy in vitro and in vivo. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 29 (34), 10627-10637 (2009).
- Troy, C. M., et al. beta-Amyloid-induced neuronal apoptosis requires c-Jun N-terminal kinase activation. Journal of neurochemistry. 77 (1), 157-164 (2001).
- Crews, L., Rockenstein, E., Masliah, E. APP transgenic modeling of Alzheimer's disease: mechanisms of neurodegeneration and aberrant neurogenesis. Brain structure & function. 214 (2-3), 111-126 (2010).
- Gotz, J., Ittner, L. M. Animal models of Alzheimer's disease and frontotemporal dementia. Nature reviews. Neuroscience. 9 (7), 532-544 (2008).
- Calhoun, M. E., et al. Neuron loss in APP transgenic mice. Nature. 395 (6704), 755-756 (1998).
- Oakley, H., et al. Intraneuronal beta-amyloid aggregates, neurodegeneration, and neuron loss in transgenic mice with five familial Alzheimer's disease mutations: potential factors in amyloid plaque formation. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 26 (40), 10129-10140 (2006).
- Jean, Y. Y., et al. Caspase-2 is essential for c-Jun transcriptional activation and Bim induction in neuron death. The Biochemical journal. 455 (1), 15-25 (2013).
- Sotthibundhu, A., et al. Beta-amyloid(1-42) induces neuronal death through the p75 neurotrophin receptor. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 28 (15), 3941-3946 (2008).
- Kar, S., Quirion, R. Amyloid beta peptides and central cholinergic neurons: functional interrelationship and relevance to Alzheimer's disease pathology. Progress in brain research. 145, 261-274 (2004).
- Leranth, C., Frotscher, M. Organization of the septal region in the rat brain: cholinergic-GABAergic interconnections and the termination of hippocampo-septal fibers. The Journal of comparative neurology. 289 (2), 304-314 (1989).
- Fa, M., et al. Preparation of oligomeric beta-amyloid 1-42 and induction of synaptic plasticity impairment on hippocampal slices. Journal of visualized experiments : JoVE. (41), (2010).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Second edn, Academic Press. (2001).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of visualized experiments : JoVE. (65), (2012).
- Currle, D. S., Monuki, E. S. Flash freezing and cryosectioning E12.5 mouse brain. Journal of visualized experiments : JoVE. (4), (2007).
- Jin, M., et al. Soluble amyloid beta-protein dimers isolated from Alzheimer cortex directly induce Tau hyperphosphorylation and neuritic degeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (14), 5819-5824 (2011).
- Lambert, M. P., et al. Diffusible, nonfibrillar ligands derived from Abeta1-42 are potent central nervous system neurotoxins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (11), 6448-6453 (1998).
- Masters, C. L., Selkoe, D. J. Biochemistry of amyloid beta-protein and amyloid deposits in Alzheimer disease. Cold Spring Harbor perspectives in medicine. 2 (6), a006262 (2012).
- Chakrabarti, M., et al. Estrogen receptor agonists for attenuation of neuroinflammation and neurodegeneration. Brain research bulletin. 109C, 22-31 (2014).
- Cirrito, J. R., et al. In vivo assessment of brain interstitial fluid with microdialysis reveals plaque-associated changes in amyloid-beta metabolism and half-life. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23 (26), 8844-8853 (2003).
- Puzzo, D., et al. Picomolar amyloid-beta positively modulates synaptic plasticity and memory in hippocampus. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 28 (53), 14537-14545 (2008).
- Puzzo, D., et al. Endogenous amyloid-beta is necessary for hippocampal synaptic plasticity and memory. Annals of. 69 (5), 819-830 (2011).
- Akpan, N., et al. Intranasal delivery of caspase-9 inhibitor reduces caspase-6-dependent axon/neuron loss and improves neurological function after stroke. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 31 (24), 8894-8904 (2011).
- Fulmer, C. G., et al. Astrocyte-derived BDNF supports myelin protein synthesis after cuprizone-induced demyelination. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 34 (24), 8186-8196 (2014).
- Thakker-Varia, S., et al. The neuropeptide VGF is reduced in human bipolar postmortem brain and contributes to some of the behavioral and molecular effects of lithium. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 30 (28), 9368-9380 (2010).
- Greferath, U., et al. Enlarged cholinergic forebrain neurons and improved spatial learning in p75 knockout mice. The European journal of neuroscience. 12 (3), 885-893 (2000).
- Brashear, H. R., Zaborszky, L., Heimer, L. Distribution of GABAergic and cholinergic neurons in the rat diagonal band. Neuroscience. 17 (2), 439-451 (1986).
- Clarke, D. J. Cholinergic innervation of the rat dentate gyrus: an immunocytochemical and electron microscopical study. Brain research. 360 (1-2), 349-354 (1985).
- Garcia-Osta, A., Alberini, C. M. Amyloid beta mediates memory formation. Learning & memory. 16 (4), 267-272 (2009).
