La transfección en la línea celular de macrófagos, RAW264.7, es difícil debido a la respuesta natural de la célula contra materiales extraños. Describimos aquí un procedimiento suave pero robusto para transfectar genes reporteros de luciferasa en células RAW264.7.
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Artículo de método
Transfectar células RAW264.7 con un gen informador de luciferasa
En este artículo
Resumen
Resumen
La transfección de los materiales genéticos deseados en las células es un procedimiento inevitable en los estudios de investigación biomédica. Si bien se han descrito numerosos métodos, ciertos tipos de células son resistentes a muchos de estos métodos y producen unabaja eficiencia de transfección, lo que podría dificultar la investigación en esos tipos de células. En este protocolo, presentamos un procedimiento de transfección optimizado para introducir genes reporteros de luciferasa como ADN plasmídico en la línea celular de macrófagos RAW264.7. Se describen dos tipos diferentes de reactivos de transfección (basados en lípidos y basados en poliaminas), y se dan notas importantes a lo largo del protocolo para garantizar que las células RAW264.7 se alteren mínimamente por el procedimiento de transfección y que los datos experimentales obtenidos sean los resultados directos del tratamiento experimental. Si bien la eficiencia de la transfección puede no ser mayor en comparación con otros métodos de transfección, el procedimiento descrito es lo suficientemente robusto como para detectar la señal de luciferasa en RAW264.7 sin cambiar la respuesta fisiológica de las células a los estímulos.
Introducción
La transfección de ácidos nucleicos en las células tiene una aplicación diversa en la investigación científica. Los ejemplos incluyen (1) genes indicadores para estudiar el papel de los diferentes elementos de genes en la expresión génica, (2) los plásmidos de expresión de proteínas que sobreexpresan la proteína de interés, y (3) pequeños ARN de interferencia para downregulate la expresión génica. Mediante la manipulación del nivel de expresión de genes particulares y midiendo el efecto diferencial de tales manipulaciones, los investigadores pueden deducir las funciones de los genes en los sistemas biológicos seleccionados. No todos los métodos de transfección propor....
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Protocolo
1. El plásmido DNA Purification
- Extraer el ADN plásmido usando un kit de maxiprep de acuerdo con el protocolo del fabricante. ADN plásmido Resuspender en 500 l de tampón TE.
- Realizar un fenol: cloroformo: alcohol isoamílico extracción y precipitación con isopropanol para eliminar contaminantes bacterianos residuales. La presencia de LPS interfiere con la transfección 9.
- Añadir 500 l de fenol: cloroformo: alcohol isoamílico (25: 24: 1, pH 8) con el ADN plásmido y agitar enérgicamente durante 15 seg. El fenol provoca quemaduras graves en la piel y es un anestésico para quemaduras no siempre se hacen sentir hasta que no haya daño....
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Resultados
La Figura 1 compara la eficiencia de transfección de los dos reactivos de transfección en RAW264.7. El reactivo basado en lípidos típicamente dio aproximadamente 25% de tasa de transfección, mientras que la transfección basado poliamina-proteína / resultó en aproximadamente 5% de eficiencia (Figura 1A). La diferencia en la eficiencia de transfección se observó también en señales de luciferasa en las células RAW264.7 transfectadas con el promotor reportero pGL3-IκBζ (Figura 1B).<.......
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Discusión
El protocolo descrito aquí no sólo se centran en la eficiencia de la transfección, sino que pretende lograr un equilibrio entre la eficiencia y la conservación de los estados fisiológicos de las células. Específicamente, nuestro procedimiento tiene éxito en la reducción de la toxicidad del reactivo de transfección y la maximización de la señal de luciferasa.
Un paso crítico en el protocolo es la salud de las células. Culturas Cubierto de vegetación no son adecuados para la transfección como .......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este estudio fue financiado por una subvención de los Institutos Canadienses para la Investigación en Salud (CIHR). El STC cuenta con una beca de investigación doctoral del CIHR y la Fundación Michael Smith. EYS tiene una beca del CIHR. El Programa de Capacitación en Trasplantes del CIHR también proporcionó becas de posgrado para STC, EYS y SS.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Kit de Maxiprep de plásmido HiPure HiPure | Life Technologies | K210007 | Cualquier kit de maxiprep funcionará |
| fenol:cloroformo:alcohol isoamílico | Life Technologies | 15593-049 Grado de | Biología Molecular. El fenol es tóxico, así que trabaje en la campana extractora, si es posible. Use la capa orgánica transparente inferior si se forman dos capas de líquido en el recipiente. |
| DMEM | Thermo Scientific | SH30243.01 | Cálido en 37 &° C Baño de agua antes de usar. |
| Suero fetal bovino | Thermo Scientific | SH30396.03 | Inactivado a 56 ° C Baño de agua durante 45 min antes de usar. |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985-070 | Calentar al menos a temperatura ambiente antes de usar. |
| Reactivo de transfección XtremeGene HP DBA | Roche 6366236001 | Calentar a temperatura ambiente antes de su uso. | |
| GeneJuice | EMD Millipore | 70967 | Calentar a temperatura ambiente antes de usar. |
| 5x Tampón de lisis pasiva | Promega | E1941 | 30 ml está incluido en el sistema de ensayo Dual Luciferasa Reporter |
| ensayo Dual Luciferasa Reporter | Promega | E1910 |
Referencias
- Maurisse, R., et al. Comparative transfection of DNA into primary and transformed mammalian cells from different lineages. BMC Biotechnol. 10 (1), 9-18 (2010).
- Thompson, C. D., Frazier-Jessen, M. R., Rawat, R., Nordan, R. P., Brown, R. T.
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Reimpresiones y permisos
