Abstract
Синтетические материалы, как известно, чтобы инициировать клинических осложнений, таких как воспаление, стеноза, и инфекций при имплантации в сосудистых заменителей. Коллаген широко используется для широкого круга биомедицинских применений и считается реальной альтернативой синтетических материалов из-за присущей ей биосовместимость (т.е. низкой антигенности, воспаление и цитотоксические реакции). Тем не менее, ограниченные механические свойства и связанные с низким ручной способность коллагеновых гелей препятствовали их использование в качестве каркасных материалов для тканевой инженерии сосудов. Таким образом, обоснование этой работы был первым инженером cellularized гели коллагена в трубчатой формы геометрии и секунды, чтобы повысить гладкомышечных клеток приводом реорганизации коллагеновой матрицы для получения тканей достаточно жесткие, чтобы быть обработаны.
Стратегия, описанная здесь, основаны на непосредственном сборки коллагена и гладкомышечных клеток (построить) в 3D cylindrical геометрии с использованием технологии формования. Этот процесс требует определенного периода созревания, в течение которого конструкции культивировали в биореакторе в статических условиях (без приложенного внешнего динамических механических ограничений) в течение 1 или 2 недели. "Статический биореактор" обеспечивает управляемый и контролируемый стерильную среду (рН, температуры, газообмена, питательных веществ и удаления отходов) для конструкций. Во периода культивирования, толщина Измерения проводились для оценки клеток-приводом ремоделирование коллагеновой матрицы, и потребление глюкозы и лактата дебиты были измерены для контроля клеткам метаболической активности. Наконец, механические и вязкоупругих свойств были оценены в результате трубчатых конструкций. Для этого, конкретных протоколов и целенаправленной ноу-хау (манипуляции, захвата, работающих в среде гидратной и т.д.) были разработаны, чтобы охарактеризовать инженерных тканей.
Introduction
Сосудистая тканевой инженерии предусматривает различные стратегии, направленные на изготовление инженерных судов, в том числе трансплантатов на основе синтетических лесов, тканевой инженерии клеток кровеносных сосудов листовой основе (TEBVs), и внеклеточного матрикса (ЕСМ) компоненты основе TEBVs. Среди этих подходов, синтетические полимеры обладают хорошими механическими свойствами, но имеют общую недостаток, поскольку они лишены биологической активности 1. Метод клеточной лист на основе позволяет получать инженерных сосудистых заменителей с высокими механическими свойствами, но время, необходимое для создания таких трансплантатов примерно 28 недель 2. Природные биополимеры ЕСМ, такие как коллаген, эластин, фибрин 3 или их сочетание, остается золотым стандартом материалы для тканевой инженерии каркасов. Это, прежде всего, по той причине, что эти материалы обладают в целом хорошую биосовместимость, находясь в состоянии вызвать функциональные клеточные ответы 4-5. Среди этих биополимерас, тип коллагена является одним из наиболее распространенных и преобладающей белка несущей ЕСМ во многих тканях, таких как кожа, кровеносные сосуды и сухожилия. Обширная работа была проведена на механические свойства коллагена 6 - 8, но там были только несколько исследований на клеточном ремоделирования коллагена гелей во время статического созревания. Сотовый ремоделирование относится к структурных модификаций коллагенового матрикса, индуцированного клеток, которые могут повлиять на стабильность коллагеновых фибрилл сети 9. В качестве естественного помост, относительно большое количество коллагена типа I могут быть выделены, стерилизуют и хранят из различных источников, таких как крысы хвост сухожилий 10. Понимание клеточных взаимодействий с коллагеном и связанные с ними общие механические поведения в cellularized коллагеновых каркасов (конструкции) является важным шагом для построения тканей. На основе коллагена TEBVs могут быть обработаны путем непосредственного смешивания клеток с коллагеномпри подготовке гель и далее формуют в конкретных формах, таких как трубчатых и плоских 11. Сосудистые клетки внутри гелей размножаться и тип реконструируют коллагена 12. Таким образом, этот метод обходит необходимость конкретной макропористости, что представляет собой один из важных вопросов в развитии лесов для тканевой инженерии. Тем не менее, основными недостатками коллагеновых гелей их низкие механические свойства по сравнению с синтетическими материалами 13.
В этом исследовании, жизнеспособной ткани с равномерным распределением клеток был разработан путем непосредственного смешивания коллагена с клетками в одностадийном процессе. "Статические биореакторы" были использованы для 1 или 2 недели статического созревания cellularized гелей коллагена (без приложенного внешнего динамических механических ограничений). В культуре, ремоделирование коллагеновой матрицы произошло, тем самым обеспечивая структурную подкрепление конструкций. Кроме того, эти конструкции были гEady должны быть переданы к вращающейся стенки биореактора и однородным эндотелия была достигнута. Кроме того, в этой работе специальный протокол механических испытаний Предлагается также обеспечить соответствующий новый подход в определении механических свойств трубчатых мягких тканей.
В целом, эта работа представляет собой метод для быстрого изготовления в пробирке и созревания сосудистых тканей, которые достаточно сильны, чтобы быть обработаны не только для биологических и механических характеристик, но и для дальнейшей механической кондиционирования в динамическом биореактор, который считается важным шаг в регенерации тканей.
Protocol
1. Изготовление и монтаж статического биореактора
- Изготовление водохранилище
- Подготовка 50 мл центрифужные пробирки в культуральной среде резервуара для биореактора.
- Сделайте два порта путем бурения два 5 мм диаметры отверстий в 20 мм от нижней и верхней части резервуара, соответственно. Затем вставьте два Lüer фитинги в 5 мм Длина силиконовых трубок. Запрессуйте эти Lüer фитинги через отверстия, и печать всех соединений с медицинского силикона клея.
- Вставьте фильтр в верхней порту резервуара (фиг.1А) 0,22 мкм.
- Вставьте Люэра перегородку в нижней порту резервуара (рис 1А).
- Оправка-крышка Ассамблея
- Дрель 4,5 мм отверстие диаметром в центре вентилируемой крышкой трубки коллектора, не повреждая мембрану фильтра, которая охватывает аэрации отверстия.
- Подготовка мешалкой (диаметр = 4,5 мм, длина = 100 мм) В качестве оправки для конструкции.
- Приготовьте два силикона конические пробки (длина = 10 мм, диаметр отверстия среднего = 4,5 мм).
- Соберите оправки и колпачок (оправки капитализацией комплекс), как показано на рисунке 1b.
- Запрессуйте оправкой в отверстие. Вставьте 2 пробки по оправке таким образом, что колпачок установлен между ними. Отрегулировать положение оправки так, чтобы его полезной длиной 78 мм.
- Нанесите грунтовку, а затем медицинского силикона клей на поверхности, которые будут находиться в контакте до вступления в крышку и силиконовые пробки конические вместе. Удалить излишки клея на крышке.
- Дайте высохнуть при комнатной температуре в течение 1-3 дней.
- Изготовление марлю схватку
- Подготовьте 3 силиконовых трубок (трубок 1: Внутренний диаметр = 6,4 мм, длина = 5 мм; труба 2: диаметр = 6,4 мм, длина = 10 мм, а трубка 3: диаметр = 3,1 мм, длина = 12 мм).
- Соберите марлевые-ручки, как описаноd на рис 1С.
- Вырезать труба 1 в продольном направлении, и открыть его на трубе 2. Придерживайтесь их вместе с силиконовым клеем.
- Вырезать стерильной хирургической марли до 5 см х 7 см листа, а затем свернуть плотно в марлю над трубкой 3 вдоль длинной стороны марли. Вставьте трубку 1-труба 2 комплекса по марлю.
- Добавить силиконовый клей держаться вместе марлю, комплекс труба 1-труба 2 и 3. Вырезать трубки марлевый при длине 8 мм.
- Ассамблея и стерилизация
- Соберите оправки капитализацией комплекс и марлевые-ручки, как описано на рисунке 2.
- Пальто оправки смазкой медицинского назначения (рис 2А). Поместите сетчатого ручки по оправке (фиг.2В). Расстояние захватов на фиксированном значении 35 мм друг от друга.
- Подготовьте трубчатую форму, сняв нижнюю часть 10 мл шприца с помощью таблицы пила (конечная длина = 8 мм) (
- Вставьте форму над марлевые ручки оборудованной оправки крышкой в сборе (корпус-форму сложного), оснастку установке формы на силиконовой пробкой (рис 2С).
- Автоклав резервуар и жилищно-формы комплекса.
Примечание: Будьте осторожны, чтобы держать на силиконовой пробкой плотно при вставке формы, чтобы избежать его отряд.
- Соберите оправки капитализацией комплекс и марлевые-ручки, как описано на рисунке 2.
Конструкции Коллаген гель на основе 2. Инженерно гладкомышечных клеток и статических Созревание
- Инженерные Конструкции
- Увеличить аорты свиньи гладкие мышечные клетки (pSMCs) в 175 см 2 культуральных колбах, наполненные 20 мл полной культуральной среде, состоящей из среды Игла в модификации Дульбекко с добавлением 10% (об / об) свиной сыворотки (PS), 10% (об / об ) эмбриональной телячьей сыворотки (FBS), 1% (об / об) пенициллин-стрептомицина (ручка-стрептококк).
- В ≈90% слияния, отделить pSMCs (проход 2-4) путем удаления культуральной среды изколба pSMCs, добавляя по 5 мл раствора трипсина (1x в фосфатно-солевом буферном растворе PBS), и инкубировали в течение 10 мин (Т = 37 ° С, 5% СО 2, 100% влажности).
- Ресуспендируют pSMCs при концентрации 4 × 10 6 клеток / мл в полной культуральной среде.
- Подготовка раствора коллагена, как описано выше 10.
- Извлечение и собирать коллагеновые пучки из крыс-хвост сухожилий в растворе PBS.
- Передача коллагеновые волокна затем в ацетоне (5 мин), изопропанол 70% (объем / объем) (5 мин) и уксусной кислоты (0,02 н, 48 ч, 4 ° С) растворы.
- Смешайте вязкий раствор и заморозить при -20 ° С в течение 3 дней.
- Лиофилизации замороженного раствора, чтобы получить коллагеновые губки.
- Солюбилизации коллагеновые губки в растворе уксусной кислоты (0,02 N) в концентрации 4 г / л и центрифуге при 29581 г силу в течение 45 мин.
- Стерилизовать раствора коллагена путем диализа против процесса последующих годовolutions уксусной кислоты (0,02 н, 1 час), хлороформ 1% (об / об, 1 час) и уксусной кислоты (0,02 н, стерильный раствор меняли каждые 2 дня в течение 1 недели).
- Сбор стерильную раствора коллагена (4 г / л) в стерильном капот культуре клеток.
- Подготовка cellularized гели коллагена, как показано на рисунке 3.
- Подготовка 50 мл стерильного раствора буфера путем смешивания 35 мл DMEM (5x), 4 мл HEPES (N 1), 3 мл NaOH (1 н) в 8 мл стерильной деионизированной воды.
- Подготовка клеток и гель смесь коллагена в контейнер помещали на лед путем смешивания 50% (об / об) стерильного раствора коллагена (4 г / л уксусной кислоты 0,02 н) с 25% (объем / объем) буферного раствора и 25% (объем / объем) суспензии в pSMCs в полной культуральной среде.
- Измерить рН смеси и гарантировать, что она находится между 7,0 и 7,4.
- Налейте мягко 9 мл клетки-и-коллагена смеси в выше жилья / формы комплекса (шаг 1.4.3, рис 3А-В
- Пусть гель при комнатной температуре в течение 1 часа под капот культуре клеток (фиг.3В).
- Созревание в статическом биореактора
- Удалить форму (фиг.3С) и передать тщательно конструкцию в резервуар, содержащий 35 мл культуральной среды (фиг 3D).
- Выдержите конструкцию (Т = 37 ° C, 5% CO 2, 100% влажности) в вертикальном положении в течение 1 или 2 недель статического созревания.
- Установка веб-камера (герметичный с тем чтобы обеспечить изоляцию) внутри инкубатора в передней части конструкции.
- Изменение культуральную среду каждые 2 дня путем аспирации старую среду из порта Luer перегородки и повторно заполнения резервуара с эквивалентным количеством свежей культуральной средой.
- Измерение толщины и метаболической активности ГМК-коллагеновый гель на основе Конструкции Во Static культуры
- Поместите сканирующего лазерного интерферометра в клеточной cultuповторно капот и перевернуть его с вертикального на горизонтальное положение с помощью уровня.
- Перевести биореактор в капот культуре клеток и снять конструкцию из резервуара.
- Передача конструкцию (еще смонтированный на оправке) в пути лазерного луча, и поместить его строго ортогонально по отношению к оси пучка (как показано на рисунке 4).
- Считать значение, отображаемое на экране сканирующего лазерного интерферометра, соответствующий внешнему диаметру конструкции.
- Рассчитать толщину стенки конструкции, основанной на его внешней и внутренней диаметром (т.е. диаметр оправки).
Примечание: Повторите шаги 2.3.1 2.3.5 каждый час в течение первых 12 часов и затем через каждые 24 часов. - Использование 1 мл старой культуральной среды (пробы при изменении культуральную среду, шаг 2.2.4) для измерения лактата и глюкозы концентрации с газоанализатора крови.
- Используйте 1 млсвежей культуральной средой в качестве базового уровня для глюкозы и лактата концентрации измерений 14.
Примечание: Повторите шаги 2.3.6 и 2.3.7 каждые 2 дня после изменения культуральной среды.
- Построить Заготовка для последующей механической и биологической Ccharacterizations
- После 1 или 2 недели статического периода созревания, передать статический биореактор в капот культуре клеток.
- Передача аккуратно зрелую конструкцию от ее оправки (Справочная видео 1) до диаметра 100 мм чашку Петри, содержащую 40 мл свежей культуральной средой (фиг.5 и 7, а).
3. Механическая характеристика конструкций в продольном и окружном направлениях
- Установите экспериментальной установки, состоящей из микромеханического тестера, снабженный датчиком нагрузки 5 или 10 Н и ванну, содержащую PBS при 37 ° С, чтобы сохранить образцыт псевдо-физиологические условия (Рисунок 6).
- Баланс ячейку нагрузки и экстензометра.
Примечание: Балансировка функция интегрирована в микромеханического тестера, состоящей в сбросе отображаемое значение расширения и отображаемое значение нагрузки, а не образец не установлен на компьютере. Эта функция позволяет определить ссылку на обоих измерений. - Монтаж трубчатых конструкций на механических аппаратов: продольное направление.
Примечание: Выполнение продольных усталостные испытания непосредственно на целых трубчатых конструкций. Внутреннего использования встроенной захватывающих приспособлений для подключения марлевые ручки из конструкций с датчиком нагрузки, и к основанию ванны PBS.- Установите трубчатый построить на захватных устройств (рис 7В), после процедуры уборки (раздел 2.4).
- Оберните захватывающих устройств и марлевые ручки вместе с тефлоновой ленты, чтобы предотвратить скольжение из марлевых захватов во время теста.Установите образец на микромеханического тестера (Рисунок 7C).
- Монтаж кольцеобразной конструкции на механическом аппарате: окружном направлении.
Примечание: Выполните круговые усталостных испытаний на кольцевых образцах секционного от трубчатых конструкций. Используйте два бара нержавеющей стали, как ручки, чтобы держать образцы.- Установите трубчатый построить на пластиковую трубу, как поддержка отмечены 5 пробелов мм (рис 7В), после сбора урожая (раздел 2.4).
- Вырезать 10 мм кольца из трубчатой конструкции.
- Измерьте длину образца с использованием штангенциркуль для дальнейших анализов.
- Установите кольцеобразного образца на решетку из нержавеющей стали микромеханического тестера (7С). Убедитесь, что место образец в центре баров.
Примечание: пластиковые трубы на этапе 3.4.1 и системы резки, как показано на рисунке 7B
- При испытаниях на усталость от конструкций в продольном или периферическом направлении.
- Стретч конструкцию к ее первоначальной длины калибра.
- Поддерживать построить в этом положении на 10 мин в псевдо-физиологические среды.
- Применение 10% циклическую деформацию исходной длины датчика (30 циклов) в конструкции с 5% скорости деформации / сек.
- Повторите шаг 3.5.3 на дополнительных этапов 10% циклического деформации до разрушения образца.
Примечание: использование псевдо-физиологические среды требует принятия во внимание плавучесть и инерцию захвата системы, которые влияют на измерения приложенной нагрузки. - Запись фон следующим образом:
- Перемещение нагрузки кадра к исходной длины датчика.
- Повторите шаги 3.5.3 и 3.5.4 без каких-либо образец установлен, и сохраняя захватывающие устройства, подключенные к нагрузке ячейки (только 1 цикл requiкрасный).
4. Luminal эндотелиализацию конструктов
Примечание: После выполнения протокола уборки (раздел 2.4), конструкции выдерживать обработку для установки в вращающейся стенки биореактора для дальнейшего эндотелизации.
- Поворот стенки биореактора дизайн
- Дрель 4,5 мм отверстие диаметром в центре вентилируемой крышкой трубки коллектора, не повреждая мембрану фильтра, которая охватывает аэрации отверстия.
- Пресс-подходят оправку (диаметром = 4,5 мм, длина = 40 мм) в отверстие и закрепить оправку, как описано в шаге 1.1.2.
- Приготовьте два С-образную поддержку силиконовый для построения внешних диаметра = 14 мм; внутренний диаметр = 8 мм).
- Поместите вращающегося двигателя в одном конце вращающейся стенки биореактора и подшипник на другом конце (8В).
- Люмен эндотелизации
- Развернуть человека пуповиналь вен эндотелиальные клетки (HUVECs) в 25 см 2 культуральных колбах с 5 мл культуральной среды M199 с добавкой 10% (об / об) PS, 10% (об / об) ФБС, 1% (об / об) ручка-стрептококк в чашке Петри внутри инкубатора (Т = 37 ° C, 5% CO 2, 100% влажность) до 90% слияния.
- Приготовьте 1,5 мл раствора белка покрытия на конструкции, необходимой для оптимального клеточной адгезии путем разбавления концентрата протеиновой смеси 10,5 нг / мл в бессывороточной эндотелиальной клеточной культуральной среды.
- Измерение длины конструкции с использованием штангенциркуль.
- Рассчитать объем просвета V и просвета зона А конструкции как: V = D в 2 л / 4 и A = D в L соответственно (где D в это внутренний диаметр, соответствующий диаметру оправки, а L представляет собой длину конструкции).
- Расположите конструкцию в центре водоема, следуя процедуре сбора (раздел 2.4).Используйте С-образное поддержку силикона исправить конструкцию с обоих концов пласта (рис 8а).
- Заполните резервуар с 35 мл культуральной среды.
- Заполните 75% расчетной просвета объема конструкции (V) с раствором белка покрытия, полученного на стадии 4.2.2. Закройте оба крайних точках конструкции, чтобы избежать любой утечки раствора белка покрытия (фиг.8А).
- Соберите систему биореактора вращающейся стенки внутри капот культуре клеток.
- Поместите в биореактор 37 ° С инкубатор и начать вращение в биореакторе 4.02 х 10 -5 г силу в течение 1 часа, чтобы позволить просвета покрытие, как показано на фиг.8В.
- Открытие верхней конечности конструкта и аспирации белковый раствор для нанесения покрытия из просвета.
- Отделить HUVECs (проход 2-3) путем удаления культуральной среды из колбы в HUVECs и добавление 3 мл раствора трипсина (1x в PBS). Яncubate в течение 5 мин (Т = 37 ° С, 5% СО 2, 100% влажности).
- Ресуспендируют HUVECs при концентрации 4 × 10 6 клеток / мл в дополненной M199 культуральной среде.
- Внутри капотом клеточной культуре, семена HUVECs в просвет конструкции с плотностью 1000 клеток / см 2 15. Закройте верхние конечности конструкции, чтобы избежать любой утечки раствора HUVECs.
- Инкубируйте конструкции (Т = 37 ° С, 5% СО 2, 100% влажности) размещается во вращающийся стенки биореактора (8В) и культуры в течение 2 дней при постоянном вращении 4,02 х 10 -5 г силу.
- Урожай конструкцию после 2 дней культуры в стерильных условиях и подготовить его к дальнейшей биологической характеристике, как описано в разделе 2.4.
Representative Results
Эта работа описывает изготовление инженерных трубчатых коллагеновых основе конструкций, содержащих сосудистые клетки. Уже после 1 часа от начала желатинизации, клетки-и-коллагена смесь непосредственно собраны в 3D геометрии трубчатого, с внешним диаметром, равным диаметру соответствующей формы (около 14 мм). Все вместе статического созревания, измерения показали быстрое уменьшение наружного диаметра трубчатых структур cellularized, как показано в таблице 1. Диаметр cellularized гелей коллагена сократилась примерно на 60% от своего первоначального значения после 1 дня статической культуры, и почти 85% в течение 7 дней (Справочная видео 2). ГМК внутри конструкций несут ответственность за наблюдается сокращение и соответствующей механической арматуры, как это явление не происходит в не-cellularized коллагеновых каркасов. Следует отметить, что не градиент любого типа (тепловой, биохимических, механических или других) не применяется. Клетки-дискп прессование в результате материала с большей плотностью коллагена, которые могут быть обработаны и подавленного к механическим ходатайства (дополнительный видео 3 и 4).
Чтобы связать клетки-приводом ремоделирования в общем механических и вязкоупругих свойств, усталостные испытания проводились на конструкциях (Дополнительные Видео 5 и 6). Эти испытания состояла в велосипеде конструкты (в 30 раз) при различных постоянных деформаций (10%, 20% и 30% от исходной длины датчика) и записать напряжение как отклик конструкций к механическим ходатайства в течение долгого времени. Представительные результаты одной конструкции показаны на рисунке 9. Конструкция выдержали высокие напряжения в продольном направлении (75 кПа), чем в окружном направлении (16 кПа) при воздействии на том же диапазоне деформаций (30% деформации). Между тем, в каждом цикле, пиковое напряжение достигло значения для ТАrgeted максимальное напряжение со временем уменьшается. Такое поведение характерно для высоких вязкоупругих свойств, проявляемых этими основе коллагена конструкций.
Биологическая активность cellularized конструкций оценивалась в ходе статического созревания. Следовательно, метаболическая активность ГМК оценивали путем измерения потребления глюкозы и лактата при статическом культуры. Культуральную среду отбирали каждые 2 дня и глюкозы и лактата концентрации были измерены с использованием газоанализатора крови. Постоянное увеличение потребления глюкозы и лактата в сочетании с важной сокращением конструкций, свидетельствуют деятельности ГМК все вместе статического культуры (рис 10).
Увеличение механической прочности из-за клеток приводом ремоделирования разрешено манипулирование конструкций и последующий процесс эндотелизации. Окрашивание трихромом Массона выполнены на endothelialized конструкцийпоказали весьма однородную эндотелий. ГМК выставлены шпинделя-образный, как морфология и появились равномерно рассеяны по стене, в то время как HUVECs появились также распространяться в просвете стороны (рисунок 11).
Рисунок 1:. Компоненты статического биореакторе статического биореактор состоит из модифицированного 50 мл центрифужную пробирку (А) и оправки, оборудован крышкой (B). Трубка служил среднего резервуара, и был оборудован портом для 0,22 мкм фильтр, для газообмена, и перегородку, для среднего выборки и изменения. Оправки присутствует в проветриваемом крышкой разрешается изготовление конструкций в трубчатой формы. Марлю-захваты (C) были разработаны и изготовлены, чтобы поддержать гелеобразование конструкций по оправке. Кроме того, этизахваты позволили конструкции должны быть обработаны после статического созревания и быть прикреплены к механическим устройством. Наружный диаметр оправки 4,7 мм.
Рисунок 2: Сборка статической биореакторе Сборка фазы биореактора до стерилизации.. Марлю-захваты смонтированы на оправке (A) на фиксированном расстоянии. Форму вставить (В) и плотно прикреплена к силиконовой пробкой (C). Наружный диаметр оправки 4,7 мм.
Рисунок 3:. Изготовление конструкций в стерильных условиях клетки и коллаген смесь выливают в корпус-формы комплекса (А), и пусть гель в течение 1 часа при комнатной температуре (B). После этого пресс-форму удал ют (С), статическое биореактор был собран (D) и переносили в резервуар для созревания статического конструкта в инкубаторе (Т = 37 ° С, 5% СО 2, 100% влажности). Наружный диаметр оправки 4,7 мм.
Рисунок 4:. Измерения толщины / внешний диаметр конструкций лазерного сканирования интерферометра для выполнения измерения наружных диаметров конструкций. Конструкция была помещена в пути лазерного луча и генерируется тень. Ширина тени, соответствующий внешнему диаметру конструкции, затем измеряется и отображается на экране.
Рисунок 5:. Морфологические внешний вид собранного конструкции (А) Сразу после гелеобразования и (б) после клетки ориентированного на ремоделирование при статическом созревания в течение 2 недель.
Рисунок 6: Экспериментальная установка для механических характеристик Он состоит из микромеханического тестера, снабженный датчиком нагрузки 5 или 10 Н и ванну, содержащую PBS при 37 ° С, чтобы сохранить образцы в псевдо-физиологических условиях..
Рисунок 7: Подготовка образцов F или механические характеризации. Образец уборки () и подготовка (B) для усталостных испытаний, проведенных в продольном и окружном направлениях (С). Наружный диаметр оправки 4,7 мм.
Рисунок 8: Поворот стенки биореактор (А) Трубчатые конструкции были собраны в центре резервуара с помощью С-образного силиконового поддержки.. Оба конечностей конструкции были закрыты, чтобы избежать любой утечки раствора HUVECs. (Б) Конструкции культивировали в инкубаторе (Т = 37 ° С, 5% СО 2, 100% влажности) во вращение при 4,02 х 10 -5 г силу в течение 2 дней.
2 / 52812fig9highres.jpg "ширина =" 700 "/>
Рисунок 9:.. Механические характеризации Результаты усталостных испытаний, выполненных на конструктов в продольном (A) и окружных (B) направлениях после клеточной приводом ремоделирования Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 10:. Метаболическая активность ГМК в рамках гелей коллагена Измерения глюкозы скорости потребления и лактата дебита были выполнены с анализатором газов крови каждые 2 дня, после смены питательной среды. Свежей культуральной средой был использован в качестве исходного уровня для измерения глюкозы и лактата концентрациях.
Рисунок 11: Люмен эндотелизации гистологические изображения радиальных сечений трубчатых конструкций.. Массона трихома окрашивание трубчатых конструкций культивировали статически в течение 1 недели (а) и 2 недели (B). Н & Е окрашивание трубчатой конструкции (С).
| Время | Толщина (мм) | Уплотнение (%) |
| 0 ч | 4.83 ± 0.02 | 0 ± 0 |
| 2 ч | 4.26 ± 0.02 | 12 ± 0 |
| 4 ч | 4.21 ± 0.03 | 13 ± 1 |
| 6 ч | 4.06 ± 0.10 | 16 ± 2 |
| 12 чR | 3.16 ± 0.07 | 35 ± 1 |
| 1 день | 2.08 ± 0.11 | 57 ± 2 |
| 1 неделя | 0.68 ± 0.07 | 86 ± 1 |
| 2 недели | 0.36 ± 0.00 | 93 ± 0 |
Таблица 1: Быстрое уплотнение диаметром конструкта в течение статического созревания толщина стенки конструкций и скорость уплотнения как функцию времени статической культуры.. Уплотнение измеряли путем определения внешнего диаметра трубчатых конструкций с помощью сканирующего лазерного интерферометра (серии 183b, LaserMike 136). Через 24 часа, конструкции уплотнен до 57% ± 2% от их размеров формованных. Которые Данные выражали в виде среднее ± стандартное отклонение (n = 3). Наличие и активность живых клеток гладких мышц было только за такими крупными изменениями.
Суpplemental Видео 1:. Заготовка, не являющихся-отремонтирован гелей трубчатая коллагеновых Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео.
Справочная Видео 2:. Клетки-приводом для уплотнения трубных гелей коллагена Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео.
Справочная Видео 3:. Манипуляции с не-отремонтирован гелей трубчатая коллагеновых Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео.
Справочная Видео 4:. Манипуляция клеток-отремонтирован трубчатая коллагеновых гелей Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть тысэто видео.
Справочная Видео 5:. Продольная усталость тест (на 30%) на клетки-отремонтирован трубчатая коллагеновых гелей Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео.
Справочная Видео 6:. Окружная усталость тест (на 30%) на клетки-отремонтирован трубчатая коллагеновых гелей Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео.
Discussion
Среди сообщества инженеров сосудистых тканей, огромные усилия были сделаны, чтобы воспроизвести Туника СМИ слой, отвечающий за механической стабильности кровеносных сосудов 16. Так пионерской работе Weinberg и Bell 17, коллаген широко используется в качестве каркаса для тканевой инженерии, потому что его биосовместимости, не иммуногенных свойств и доступности сосудов. Тем не менее, применение коллагена представляет собой большую проблему для исследователей, так как этот материал не прост в обращении, из-за отсутствия внутренней механической жесткости. Манипуляции при подготовке лесов может привести к повреждению лесов, ставя под угрозу их для дальнейшего использования.
Техника, описанная в этой работе позволяет: я), чтобы инженер cellularized гели коллагена в трубчатой формы геометрии; II) для проектирования биологических тканей достаточно сильны, чтобы быть обработаны после короткого периода созревания статического (1 или 2 недели); III) какСЭС механические и вязкоупругих свойств таких трубчатых-образные биологических тканей в 2-х направлениях. Клетки в геле играют ключевую роль в ремоделировании коллагенового матрикса. В течение периода созревания, сократительные ГМК привело к уплотнению гелей, дающих конструкцию с более высокой механической стабильностью, которые могут быть оценены в продольном и окружном направлениях. Впоследствии, HUVECs высевают в просвете стороне конструкции генерируется однородную и жизнеспособного эндотелий, демонстрируя тем самым пригодность коллагеновых гелей для тканевой инженерии сосудов.
Биореактор представлен в данной работе была специально разработана, чтобы обеспечить оптимальную среду для роста клеток при статическом созревания. Кроме того, устройства, разработанные для определения характеристик механических и вязкоупругих свойств конструкций были разработаны с целью уменьшить любое возможное повреждение, присущую манипуляциитакие нежные материалы. Следовательно, статические биореактор был оборудован по 0,22 мкм фильтр и мембранный фильтр на крышке (шаг 1.1.2, фиг.1А и В), что позволило газообмен между культуральной среды внутри резервуара и инкубатора, сохраняя стерильной среде культуры. Luer перегородки в нижней был использован в качестве порта для отбора проб питательной среды и изменения при статическом культуры. Некоторые важные шаги должны быть рассмотрены в ходе изготовления построить и характеристик. Все манипуляции, выполняемые (на этапе 2.1.1 и на последующих стадиях), что может изменить стерильность системы проводились в стерильных биологической капотом. Клетки и коллагеновый гель подготовка смесь обрабатывается на льду для того, чтобы задержать процесс желатинизации (шаги 2.1.4 до 2.1.7). На этапе 2.1.7, любые воздушные пузыри, захваченные в смеси до желатинизации являются потенциальными области концентрации напряжений, которые могут поставить под угрозу Sбильность конструктов. Таким образом, удаление таких воздушных пузырьков требует слегка встряхивая сборки или с помощью медицинской вакууме в течение 3 мин для дегазации в стерильных условиях. Наконец, захваты были специально разработаны для поддержания ось оправки центральной в трубчатой формы во время гелеобразования и позволяет тонкий манипуляции конструкций во время уборки (удаление оправки, раздел 2.4), для эндотелизации, и для облегчения монтажа на механическая система (продольные тесты).
Настоящий Протокол предлагает оригинальный альтернативный подход простой в процессе укрепления коллагеновых гелей конструкций на основе природного присущей сократительной потенциала ГМК. Общие методы коллагеновые матрицы усиления включать использование физических и химических сшивающих агентов, которые могут иметь вредные эффекты на клетки-матричных взаимодействий 18 - 20. Технология изготовления представлены вэта работа позволяет направлять эту клеток-приводом процесс ремоделирования с получением тканевой инженерии конструкцию с заданные механические свойства без физического или химической обработки.
Характеристика механических и вязкоупругих свойств гидратированных гелей коллагена является большой проблемой. С этой точки зрения, присутствует протокол описывает оригинальный простой и эффективный способ для оценки механических свойств трубчатых мягких тканей. Эта характеристика может быть выполнена не только в направлении по окружности, но также и в продольном направлении, непосредственно на всей трубчатой структуры. Во механических характеристик, температуры, водной среде, рН и ионной силы некоторые из экологических факторов, которые, как известно, существенно влияет на механические свойства биологических тканей 21. Следовательно, данная работа предполагает первоначальную настройку и протокол для механических характеристик биологических тканей в высоковоспроизводимым псевдо-физиологическом окружении (солевой раствор при 37 ° С и рН 7,4). Для нашим сведениям, этот вид характеристики никогда не были зарегистрированы в других местах.
В заключение, способ, предложенный в этой работе демонстрирует высокий потенциал прямого смешения клеток с коллагеном для тканевой инженерии сосудов. Этот метод вместе с механических характеристик и эндотелизации процесса составляют высокие поливалентные протоколы. Следовательно, через небольшие модификации наборов параметров и протоколов, сохраняя тот же обоснование, основные требования к ткани эквивалентов инженерно сосудистых могут быть решены, например, быстрого и несложного обработки, в том числе эндотелизации, и возможность быть перенесены на широкий спектр мягкой тканей с различной длины и диаметра. Кроме того, различные типы клеток адгезивные, белков ЕСМ и формованные геометрии могут быть исследованы для ряда целевых аппликациямидополнения, такие как инженерных сухожилий, кожных трансплантатов, сердечных патчи, нервов, среди других. Несмотря на то, что механические свойства конструкций обнадеживают, они все еще ниже, чем у нативных тканей. В этом контексте, мы уверены, что очень короткий период созревания статическое является решающим шагом на пути к динамической стимуляции в биореакторе, что приводит к более высокой структурной целостности и механической стабильности. Тем не менее, возможность быстро произвести тканевой инженерии cellularized на основе коллагена конструкции пригодны для механической и гистологический анализ делает статический биореактор, описанный здесь полезным и перспективным инструментом для обеспечения понимание взаимодействия между клетками и ECM во время роста и модернизации, или даже к быть использованы в качестве модели для лечения и системы доставки лекарственных средств.
Disclosures
Нет финансирование не было получено от организаций или учреждений с потенциальным конфликтом интересов.
Acknowledgments
Это исследование было профинансировано естествознания и техники Научно-исследовательского совета Канады, Канадский институт исследований в области здравоохранения и научно-исследовательский центр Квебек ЧУ-де.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CellTreat 50 ml Bio-Reaction tubes | CELLTREAT Scientific Products | 229-475 | Centrifuge tube |
| Male luer with lock ring x 1/8" hose barb. PP. 25/pk | Cole Parmer | RK-45503-04 | Luer fittings for "gas-exchange port" |
| Female luer x 1/8" hose barb adapter. PP. 25/pk | Cole Parmer | RK-45500-04 | Luer fittings for the "medium sampling port" |
| Masterflex platinum-cured silicone tubing L/S 17. 25 ft. | Cole Parmer | RK-96410-17 | Tube 1 and 2 for the gauze grippers |
| Masterflex platinum-cured silicone tubing L/S 16. 25 ft. | Cole Parmer | RK-96410-16 | Tube 3 for the gauze grippers |
| Silastic Medical adhesive silicone, type A | Dow Corning | - | Silicon glue for the fabrication of the static bioreactor |
| Polyvent 4 Vessel venting filters | Whatman | 6713-0425 | Filter for "gas exchange port" |
| Rod. PP. stirring. 8’’ | Scienceware | 377660008 | Mandrel |
| Stopper silicone rubber 00 PK12 | VWR | 59590-084 | Stopper for the insertion of the mandrel to the vented cap of the centrifuge tube |
| Krytox PFPE/PTFE Greases | Dupont | GPL 202 | Medical grade grease for covering the mandrel |
| Trypsin-EDTA (0.5%) | Gibco | 15400-054 | Cell culture |
| Xiameter RTV-4130-J base and curing agent | Dow Corning | - | C-shaped silicone support for endothelialization |
| Dulbecco’s modified Eagle medium, DMEM, high glucose, pyruvate | Gibco (Life Technology) | 11995-065 | Cell culture |
| Pure acetone (99%) | Laboratoire Mat Inc. | AP0102 | Chemical for collagen extraction |
| Isopropyl alcohol (HPLC grade, 99.9%) | Fisher Scientific | AC610080040 | Chemical for collagen extraction |
| 0.02 N acetic acid (glacial acetic acid, HPLC grade, 99%) | Fisher Scientific | FL070494 | Chemical for collagen extraction |
| Chloroform solution (99%) | Laboratoire Mat Inc. | CR 0179 | Chemical for collagen extraction |
| Hepes | Sigma-Aldrich | 163716 | Chemical for construct preparation |
| NaOH | Laboratoire Mat Inc. | SR-0169 | Chemical for construct preparation |
| LaserMike 136 | LaserMike | Series 183B | Scanning laser interferometer |
| ElectroPulse MicroTester | Instron Corporation | - | Micromechanical Tester |
| HyClone Media M199/EBSS, 500 ml | GE Healthcare Life Sciences | SH30253.01 | Component of cell culture medium |
| Fetal bovine serum HI - 500 ml | Gibco | SH 30396.03 | Component of cell culture medium |
| Porcine serum (PS) | Sigma-Aldrich | P9783 | Component of cell culture medium |
| Penicillin-Streptomicin | Gibco | 15140-122 | Component of cell culture medium |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | BP661-50 | Saline solution |
| Tissue culture flask T17CN Vent Cap Red | Sarstedt Inc. | 83.1812.002 | Cell culture |
| ColorpHast- pH-indicator strips (pH = 6.5-10.0) | EMD | 9583 | pH measurements |
| Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced, 5 ml vial | BD Biosciences - Discovery Labware | 356230 | Concentrate protein mixture for endothelialization process |
| LifeCam VX-3000 | Microsoft | - | Thickness measurement |
| Biochemical analyzer, DxC600 | Beckman Coulter Unicell Synchron | - | Glucose and lactate concentrations measurements |
| Collagen fibers | Rat tails | - | Collagen was extracted in the laboratory |
| Porcine smooth muscle cells (pSMCs) | Porcine aortas | - | pSMCs were isolated in the laboratory |
| Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) | Human umbilical veins | - | HUVECs were isolated in the laboratory |
References
- Kim, B. S., Nikolovski, J., Bonadio, J., Smiley, E., Mooney, D. J. Engineered smooth muscle tissues: regulating cell phenotype with the scaffold. Experimental cell research. 251, 318-328 (1999).
- Heureux, N., McAllister, T. N., de la Fuente, H. L. Tissue-engineered blood vessel for adult arterial revascularization. The New England journal of medicine. 357 (14), 1451-1453 (2007).
- Syedain, Z. H., Meier, L. A., Bjork, J. W., Lee, A., Tranquillo, R. T. Implantable arterial grafts from human fibroblasts and fibrin using a multi-graft pulsed flow-stretch bioreactor with noninvasive strength monitoring. Biomaterials. 32 (3), 714-722 (2011).
- Lee, C., Singla, A., Lee, Y.
- Couet, F., Rajan, N., Mantovani, D. Macromolecular biomaterials for scaffold-based vascular tissue engineering. Macromolecular bioscience. 7 (5), 701-718 (2007).
- Christiansen, D. L., Huang, E. K., Silver, F. H. Assembly of type I collagen: fusion of fibril subunits and the influence of fibril diameter on mechanical properties. Matrix Biology. 19 (5), 409-420 (2000).
- Eppell, S. J., Smith, B. N., Kahn, H., Ballarini, R. Nano measurements with micro-devices: mechanical properties of hydrated collagen fibrils. Journal of the Royal Society, Interface / the Royal Society. 3 (6), 117-121 (2006).
- Lai, V. K., Lake, S. P., Frey, C. R., Tranquillo, R. T., Barocas, V. H. Mechanical behavior of collagen-fibrin co-gels reflects transition from series to parallel interactions with increasing collagen content. Journal of biomechanical engineering. 134 (1), 011004 (2012).
- Seliktar, D., Nerem, R. M., Galis, Z. S. The Role of Matrix Metalloproteinase-2 in the Remodeling of Cell-Seeded Vascular Constructs Subjected to Cyclic Strain. Annals of Biomedical Engineering. 29 (11), 923-934 (2001).
- Rajan, N., Habermehl, J., Coté, M. -F., Doillon, C. J., Mantovani, D. Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications. Nature protocols. 1 (6), 2753-2758 (2006).
- Kumar, V. A., Caves, J. M., et al. Collagen-Based Substrates with Tunable Strength for Soft Tissue Engineering. Biomaterials science. 1 (11), 1193-1202 (2013).
- Li, S., Van Den Diepstraten, C., D’Souza, S. J., Chan, B. M. C., Pickering, J. G. Vascular smooth muscle cells orchestrate the assembly of type I collagen via alpha2beta1 integrin, RhoA, and fibronectin polymerization. The American journal of pathology. 163 (3), 1045-1056 (2003).
- Badylak, S. F., Freytes, D. O., Gilbert, T. W. Extracellular matrix as a biological scaffold material: Structure and function. Acta biomaterialia. 5 (1), 1-13 (2009).
- Engbers-Buijtenhuijs, P., Buttafoco, L., et al. Biological characterisation of vascular grafts cultured in a bioreactor. Biomaterials. 27 (11), 2390-2397 (2006).
- Cheung, A. L. Isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC). Current protocols in microbiology. 4, 4B (2007).
- Seifu, D. G., Purnama, A., Mequanint, K., Mantovani, D.
- Weinberg, C., Bell, E. A blood vessel model constructed from collagen and cultured vascular cells. Science. 231 (4736), 397-400 (1986).
- Meghezi, S., Chevallier, P., Mantovani, D. Why Mechanical Properties of Collagen Scaffolds Should Be Tested in a Pseudo-Physiological Environment. Advanced Materials Research. 409, 158-163 (2011).
- Tirella, A., Liberto, T., Ahluwalia, A. Riboflavin and collagen: New crosslinking methods to tailor the stiffness of hydrogels. Materials Letters. 74, 58-61 (2012).
- Madhavan, K., Belchenko, D., Tan, W. Roles of genipin crosslinking and biomolecule conditioning in collagen-based biopolymer: Potential for vascular media regeneration. Journal of biomedical materials research. Part A. , 16-26 (2011).
- Meghezi, S., Couet, F., Chevallier, P., Mantovani, D. Effects of a pseudophysiological environment on the elastic and viscoelastic properties of collagen gels. International journal of biomaterials. 2012, 319290 (2012).
