La encapsulación de alginato de células madre pluripotentes utilizando una boquilla-Co axial

Resumen

Establecimos un método para encapsular células madre pluripotentes (células PS) en cápsulas de hidrogel de alginato utilizando una boquilla coaxial. Esto evita que las células se agreguen excesivamente y limita el esfuerzo cortante experimentado por las células en cultivo en suspensión. La técnica es aplicable a la producción masiva de células PS, así como a la investigación sobre el nicho de células madre.

Resumen

Las células madre pluripotentes (células PS) son objeto de una intensa investigación debido a su papel en la medicina regenerativa y el cribado de fármacos. Sin embargo, sería necesario el desarrollo de un sistema de cultivo masivo para el uso de células PS en estas aplicaciones. El cultivo en suspensión es un método de cultivo prometedor para la producción masiva de células PS, aunque algunos problemas, como el control de la agregación y la limitación del esfuerzo cortante del medio de cultivo, aún no se han resuelto. Con el fin de resolver estos problemas, desarrollamos un método de encapsulación de alginato de calcio (Alg-Ca) utilizando una boquilla coaxial. Este método puede controlar el tamaño de las cápsulas fácilmente mediante el coflujo de gas N₂. El diámetro controlable de la cápsula debe ser superior a 500 μm, ya que un caudal demasiado alto de gas N₂ provoca la descomposición de las gotas y, por lo tanto, de cápsulas de tamaño heterogéneo. Además, una baja concentración de Alg-Na y CaCl₂ provoca cápsulas no esféricas. Aunque una cápsula de Alg-Ca sin un recubrimiento de Alg-PLL se disuelve fácilmente, lo que permite la recolección de células, también pueden filtrarse potencialmente de las cápsulas que carecen de un recubrimiento de Alg-PLL. De hecho, un recubrimiento de alginato-PLL puede evitar la fuga celular, pero también es difícil de romper. Esta tecnología se puede utilizar para investigar el nicho de las células madre, así como la producción masiva de células PS, ya que la encapsulación puede modificar el microambiente que rodea a las células, incluida la matriz extracelular y la concentración de factores secretados.

Introducción

Las células madre pluripotentes inducidas (células iPS) son actualmente la fuente de una intensa investigación debido a su papel en la medicina regenerativa. Sin embargo, se requieren grandes cantidades de células para la regeneración de tejidos. Por ejemplo, se requieren aproximadamente mil millones de células pancreáticas para^{un paciente} diabético tipo 1. Sin embargo, el cultivo en placa convencional solo es capaz de obtener 1 × 10⁵ células/^cm2, por lo que se requiere 1^m2 de área de cultivo para obtener suficientes células pancreáticas derivadas de células madre para tratar a un paciente diabético tipo 1. Por lo tanto, el desarrollo de un sistema para el cultivo masivo de células madre pluripotentes, como el microportador² y el cultivo en suspensión, es necesario para la medicina regenerativa. El cultivo en suspensión representa un método prometedor de cultivo masivo, pero el control de la agregación de células es un desafío en los cultivos de suspensión directa de células iPS humanas³. De hecho, las células suspendidas están expuestas a un esfuerzo de cizallamiento, lo que provoca daño celular³ o diferenciación⁴.

Se han llevado a cabo investigaciones sobre la encapsulación basada en hidrogel para resolver problemas asociados con el cultivo en suspensión. En las cápsulas de hidrogel, las células están protegidas del flujo del medio. Informes anteriores han documentado el uso de varios tipos de hidrogel, incluidos la agarosa⁵, el PEG⁶ y el alginato (Alg), para la encapsulación celular. El hidrogel de Alg-Ca es uno de los hidrogeles más útiles para la encapsulación celular porque el hidrogel de Alg-Ca se forma inmediatamente después de dejar caer la solución de alginato en una solución de CaCl₂ y también es fácilmente digerido por enzimas o reactivos quelantes.

Aquí, hemos establecido un proceso de encapsulación de alginato estable para células iPS utilizando una boquilla coaxial. Mediante el uso del flujo de gas N₂ para formar gotas, es posible encapsular las células en cápsulas uniformes sin necesidad de otros reactivos como el aceite. En este método, el caudal de N₂ y la concentración de CaCl₂ y alginato son las principales condiciones de funcionamiento que afectan el tamaño, la forma y la uniformidad de las cápsulas. Este informe demuestra la optimización de estas condiciones de funcionamiento mediante el uso de una cámara de alta velocidad y un microscopio.

Protocolo

1. Materiales Preparación

1. Preparar 10 mM de tampón HEPES. Ajustar el pH a 7,0 a temperatura ambiente y añadir NaCl al 0,9%.
2. Preparar la solución de alginato de 5% y solución de EDTA 10 mM mediante la mezcla de solución salina tamponada con HEPES preparado en 1.1. Ajustar el pH a 7,0 a temperatura ambiente.
3. Autoclave los reactivos (1.1, 1.2) durante 20 min a 121 ° C.
4. Preparar platos 60 mm recubiertos de gelatina en capas con 1,2 a 2,0 × 10 ⁶ de fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) las células, que se tratan como células alimentadoras por incubación en DMEM que contiene 10% de SFB ES-calificados y 10 g / ml de mitomicina C para 90 - 120 min.
5. Mantener inducida ratón madre pluripotentes (iPS) células en el plato con las células alimentadoras en presencia de 5 ml de DMEM de alta glucosa que contiene 20% de ES-calificado FBS, 50 mM de 2-mercaptoetanol, aminoácido no esencial, y antibióticos ( 100 unidades / ml de penicilina G sódica, 100 g / ml de sulfato de estreptomicina y 250 ng / ml de amphotericin B).
6. Semilla de 4 × 10 ⁵ células iPS en un 60 mm plato de gelatina recubiertos y incubarlos a 37 ° C y 5% de CO _2. Cambie el medio de cultivo cada día durante la incubación. Después de 3 - 4 días de cultivo, trypsinize células durante 1 min con 500 l de tripsina al 0,05% que contenía 0,02% de EDTA a 37 ° C y 5% de CO _2. Después de eso, separar las células tocando la placa de cultivo diez veces.
7. Añadir 2,5 ml de DMEM con 10% de (tres veces siguientes iPS disociación de ratón células en células individuales por pipeteo con 1000 l micropipeta) FBS y antibióticos ES-calificado suspensión de células se centrifuga a 160 × g durante 3 min y retirar el sobrenadante y contar las células . Tras el recuento de células, resembrar las células recogidas en un plato de gelatina con recubrimiento y se incuba durante 30 min para aislar las células iPS a partir de células MEF. Después de contar de las células (generalmente 1-3 × 10 ⁶ células / placa puede ser recogida), reseed 4 × 10 ⁵ células iPS enel plato.

2. encapsulación de células en alginato de hidrogel Cápsulas

1. Recoger las células por el mismo procedimiento descrito en 1.5 y 1.6. Después de centrifugación a 160 xg durante 3 min, lavar el sedimento de células iPS con solución salina tamponada con HEPES tres veces. Después de volver a suspender las células en solución salina tamponada con HEPES, filtrar la suspensión celular a través de un filtro de 40 micras de células con el fin de eliminar grandes agregados, que de otro modo podrían obstruir la boquilla.
2. Mezclar 2 ml de suspensión de células dentro de solución salina tamponada con HEPES y 3 ml de solución de Na Alg-5%. Finalmente se obtuvieron 5 ml de suspensión de células dentro de solución Alg-Na 3%. La densidad celular es deseablemente más de 10 ⁶ células / ml.
3. Después de recoger la suspensión de células en una jeringuilla de 5 ml, instalar una boquilla co-axial (Figura 1A, B) en la jeringa y los puso en la bomba de jeringa. Emit N ₂ de flujo de gas (inferior a 1 litro / min) a través de la aguja exterior de la boquilla co-axial yexpulsar la suspensión celular a través de la boquilla interior.
4. Recoger gotitas en 250 ml de solución de 0,5% CaCl ₂ y esperar 10-20 min para la gelificación mientras se agita a 60-90 rpm.

3. Tratamiento de alginato Cápsulas (opcional)

1. Incubar cápsulas Alg-Ca en 0,05% (w / v) de poli-L-lisina (PLL) solución durante 5 min a 37 ° C y 5% de CO _2.
2. Después de lavar las cápsulas con solución salina tamponada con HEPES, incubar en DMEM que contenía FBS al 10% para neutralizar la carga eléctrica en su superficie. Utilizarlos como cápsulas recubiertas (Figura 1C).
3. Incubar las cápsulas en solución salina tamponada con HEPES que contiene EDTA 10 mM durante 5 min. Las cápsulas tratados con EDTA se utilizan como cápsulas huecas (Figura 1C).

4. Cultura y recoger las células en cápsulas de alginato

1. Se incuban las células encapsuladas en 75 rpm con agitación a 37 ° C y 5% de CO ₂durante 10 días.
2. Recoger e incubar las cápsulas en EDTA 10 mM a 37 ° C y CO ₂ al 5% durante 10 min. Recoger las células de las cápsulas de alginato sin tratamiento PLL por centrifugación a 1000 × g durante 3 min.
3. Si cápsulas de alginato son tratados con PLL, romper la membrana Alg-PLL pipeteando arriba y hacia abajo alrededor de diez veces con una aguja unida a una jeringa y se centrífuga a 1.000 - 5.000 × g durante 5 min. Diámetro de la aguja debe ser menor que el tamaño de cápsula y 25 G (260 m) se utilizan agujas en este experimento (600 micras)
4. Después de la centrifugación, recoger sedimento celular estrictamente de membranas Alg-PLL rotos si quieres recoger muestras de ARNm a partir de células. El resto de las membranas Alg-PLL posiblemente prevenir purificación de ARNm.

Resultados

En protocolo 2.5, la solución de alginato expulsado forma una forma esférica inmediatamente después de la expulsión (Figura 2A - H). Si la suspensión se expulsa con una velocidad de flujo de N ₂ inferior a 1L / min, el tamaño de las gotas es uniforme (Figura 2I). Sin embargo, si el flujo de N ₂ es superior a 1L / min, la gotita se rompe (Figura 2G, de flecha blanca) y el tamaño de las gotitas se vuelve heterogénea (Figura 2J). Teni...

Discusión

Cultura encapsulación puede ser comparado con cultivos en suspensión directos. Cultivo en suspensión es un método más simple para obtener grandes cantidades de células madre pluripotentes que los métodos de encapsulación. Sin embargo, el control de la agregación de células en cultivo en suspensión es todavía difícil. En el método de encapsulación, la agregación celular está limitado en cápsulas y puede por lo tanto ser bien controlada. Una publicación anterior mostró que las células encapsuladas forman agregados d...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Embrión de ratón fibroblasto	Cell Biolabs	SNL 76/7
Célula madre pluripotente inducida	por ratón RIKEN Bio centro de resorce	iPS-MEF-Ng-20D-17
DMEM alta glucosa	GIBCO	11995
ES calificado  FBS	GIBCO	16141079
Antibióticos antibacterianos	GIBCO	15240
Aminoácido no esencial	GIBCO	11140
2-mercaptoetanol	GIBCO	21985-023
ESGRO Factor inhibidor de la leucemia	Merck Millipore ESG1107
tripsina/EDTA	GIBCO	25300
26 G/16 G aguja	Hoshiseido
10 ml Jeringa	TERUMO	SS-10ESZ
Sodio  Cloruro	Wako	191-01665
HEPES	SIGMA	H4034
Alginato de sodio	Wako	194-09955
Cloruro de calcio	Wako	039-00475
Poli-L-lisina (MW = 15.000 - 30.000)	SIGMA	P7890
EDTA	DOJINDO	345-01865
Bomba Sylinge	AS ONE
Microscopio	Olympus	IX71
Microscopio	Leica	DM IRB
Cámara de alta velocidad	tecnología de imagen NAC	Memrecam HX-3