La encapsulación de alginato de células madre pluripotentes utilizando una boquilla-Co axial

Resumen

Establecimos un método para encapsular células madre pluripotentes (células PS) en cápsulas de hidrogel de alginato utilizando una boquilla coaxial. Esto evita que las células se agreguen excesivamente y limita el esfuerzo cortante experimentado por las células en cultivo en suspensión. La técnica es aplicable a la producción masiva de células PS, así como a la investigación sobre el nicho de células madre.

Resumen

Las células madre pluripotentes (células PS) son objeto de una intensa investigación debido a su papel en la medicina regenerativa y el cribado de fármacos. Sin embargo, sería necesario el desarrollo de un sistema de cultivo masivo para el uso de células PS en estas aplicaciones. El cultivo en suspensión es un método de cultivo prometedor para la producción masiva de células PS, aunque algunos problemas, como el control de la agregación y la limitación del esfuerzo cortante del medio de cultivo, aún no se han resuelto. Con el fin de resolver estos problemas, desarrollamos un método de encapsulación de alginato de calcio (Alg-Ca) utilizando una boquilla coaxial. Este método puede controlar el tamaño de las cápsulas fácilmente mediante el coflujo de gas N₂. El diámetro controlable de la cápsula debe ser superior a 500 μm, ya que un caudal demasiado alto de gas N₂ provoca la descomposición de las gotas y, por lo tanto, de cápsulas de tamaño heterogéneo. Además, una baja concentración de Alg-Na y CaCl₂ provoca cápsulas no esféricas. Aunque una cápsula de Alg-Ca sin un recubrimiento de Alg-PLL se disuelve fácilmente, lo que permite la recolección de células, también pueden filtrarse potencialmente de las cápsulas que carecen de un recubrimiento de Alg-PLL. De hecho, un recubrimiento de alginato-PLL puede evitar la fuga celular, pero también es difícil de romper. Esta tecnología se puede utilizar para investigar el nicho de las células madre, así como la producción masiva de células PS, ya que la encapsulación puede modificar el microambiente que rodea a las células, incluida la matriz extracelular y la concentración de factores secretados.

Introducción

Las células madre pluripotentes inducidas (células iPS) son actualmente la fuente de una intensa investigación debido a su papel en la medicina regenerativa. Sin embargo, se requieren grandes cantidades de células para la regeneración de tejidos. Por ejemplo, se requieren aproximadamente mil millones de células pancreáticas para^{un paciente} diabético tipo 1. Sin embargo, el cultivo en placa convencional solo es capaz de obtener 1 × 10⁵ células/^cm2, por lo que se requiere 1^m2 de área de cultivo para obtener suficientes células pancreáticas derivadas de células madre para tratar a un paciente diabético tipo 1. Por lo tanto,....

Protocolo

1. Materiales Preparación

1. Preparar 10 mM de tampón HEPES. Ajustar el pH a 7,0 a temperatura ambiente y añadir NaCl al 0,9%.
2. Preparar la solución de alginato de 5% y solución de EDTA 10 mM mediante la mezcla de solución salina tamponada con HEPES preparado en 1.1. Ajustar el pH a 7,0 a temperatura ambiente.
3. Autoclave los reactivos (1.1, 1.2) durante 20 min a 121 ° C.
4. Preparar platos 60 mm recubiertos de gelatina en capas con 1,2 a 2,0 × 10 ⁶ de fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) las células, que se tratan como células alimentadoras por incubación en DMEM que contiene 10% de SFB ES-calificados y 10 g / ml de mit....

Resultados

En protocolo 2.5, la solución de alginato expulsado forma una forma esférica inmediatamente después de la expulsión (Figura 2A - H). Si la suspensión se expulsa con una velocidad de flujo de N ₂ inferior a 1L / min, el tamaño de las gotas es uniforme (Figura 2I). Sin embargo, si el flujo de N ₂ es superior a 1L / min, la gotita se rompe (Figura 2G, de flecha blanca) y el tamaño de las gotitas se vuelve heterogénea (Figura 2J). Teni.......

Discusión

Cultura encapsulación puede ser comparado con cultivos en suspensión directos. Cultivo en suspensión es un método más simple para obtener grandes cantidades de células madre pluripotentes que los métodos de encapsulación. Sin embargo, el control de la agregación de células en cultivo en suspensión es todavía difícil. En el método de encapsulación, la agregación celular está limitado en cápsulas y puede por lo tanto ser bien controlada. Una publicación anterior mostró que las células encapsuladas forman agregados d.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Embrión de ratón fibroblasto	Cell Biolabs	SNL 76/7
Célula madre pluripotente inducida	por ratón RIKEN Bio centro de resorce	iPS-MEF-Ng-20D-17
DMEM alta glucosa	GIBCO	11995
ES calificado  FBS	GIBCO	16141079
Antibióticos antibacterianos	GIBCO	15240
Aminoácido no esencial	GIBCO	11140
2-mercaptoetanol	GIBCO	21985-023
ESGRO Factor inhibidor de la leucemia	Merck Millipore ESG1107
tripsina/EDTA	GIBCO	25300
26 G/16 G aguja	Hoshiseido
10 ml Jeringa	TERUMO	SS-10ESZ
Sodio  Cloruro	Wako	191-01665
HEPES	SIGMA	H4034
Alginato de sodio	Wako	194-09955
Cloruro de calcio	Wako	039-00475
Poli-L-lisina (MW = 15.000 - 30.000)	SIGMA	P7890
EDTA	DOJINDO	345-01865
Bomba Sylinge	AS ONE
Microscopio	Olympus	IX71
Microscopio	Leica	DM IRB
Cámara de alta velocidad	tecnología de imagen NAC	Memrecam HX-3