Análisis y calcio monocanal Imaging en los podocitos de los glomérulos recién aisladas

Daria V. Ilatovskaya; Oleg Palygin; Vladislav Levchenko; Alexander Staruschenko

doi:10.3791/52850

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Análisis y calcio monocanal Imaging en los podocitos de los glomérulos recién aisladas

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DOI:

10.3791/52850

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27 de junio de 2015

Daria V. Ilatovskaya¹ , Oleg Palygin¹ , Vladislav Levchenko¹ , Alexander Staruschenko¹

¹Department of Physiology, Medical College of Wisconsin

En este artículo

Resumen

Los cambios en los niveles de calcio intracelular en los podocitos son uno de los medios más importantes para controlar la función de filtración de los glomérulos. Aquí explicamos un enfoque de alto rendimiento que permite la detección del manejo de calcio en tiempo real y la actividad de canales iónicos individuales en los podocitos de los glomérulos recién aislados.

Resumen

Se sabe que los podocitos (células epiteliales glomerulares renales) regulan la permeabilidad glomerular y mantienen la estructura glomerular; se ha establecido un papel clave para estas células en la patogénesis de diversas enfermedades renales, ya que la lesión de los podocitos conduce a la proteinuria y al borrado del proceso del pie. Anteriormente se informó que varios agentes endógenos pueden causar una sobrecarga dramática en la concentración intracelular de Ca²⁺en los podocitos, lo que presumiblemente conduce a la albuminuria, y esto probablemente ocurre a través de los canales iónicos conductores de calcio. Por lo tanto, parecía importante estudiar el manejo del calcio en los podocitos tanto en condiciones normales como en diversos estados patológicos. Sin embargo, los enfoques experimentales disponibles se han limitado en cierta medida a las células cultivadas y transfectadas. Aunque representan un buen modelo básico para este tipo de estudios, se extraen esencialmente del entorno nativo del glomérulo. En este trabajo describimos la metodología de estudio de los podocitos como parte del glomérulo entero recién aislado. Esta preparación conserva el potencial funcional de los podocitos, que aún están unidos a los capilares; Por lo tanto, los podocitos permanecen en el ambiente que conserva las partes principales del aparato de filtración de los glomérulos. El presente manuscrito desarrolla dos enfoques experimentales que permiten 1) la detección en tiempo real de cambios en la concentración de calcio con la ayuda de microscopía de fluorescencia confocal ratiométrica, y 2) el registro de la actividad de los canales iónicos individuales en los podocitos de los glomérulos recién aislados. Estas metodologías utilizan las ventajas del entorno nativo del glomérulo que permite a los investigadores resolver cambios agudos en el manejo del calcio intracelular en respuesta a aplicaciones de diversos agentes, medir la concentración basal de calcio dentro de las células (por ejemplo, para evaluar la progresión de la enfermedad) y evaluar y manipular la conductancia del calcio a nivel de canales iónicos individuales.

Introducción

Los riñones mantienen el equilibrio homeostático para diversas sustancias y regulan el volumen de sangre en una forma que determina la presión de la sangre total. Las perturbaciones en la filtración renal, reabsorción o plomo secreción o acompañar a los estados patológicos, que van desde la hiper o hipotensión que terminan enfermedad renal que eventualmente requiere un trasplante de riñón. La unidad de filtración renal (glomérulo) consiste en tres capas - el endotelio capilar, la membrana basal y una capa de una sola célula de las células epiteliales - podocitos, que desempeñan un papel importante en el mantenimiento de la integridad y la función ^1-rendija....