Los cambios en los niveles de calcio intracelular en los podocitos son uno de los medios más importantes para controlar la función de filtración de los glomérulos. Aquí explicamos un enfoque de alto rendimiento que permite la detección del manejo de calcio en tiempo real y la actividad de canales iónicos individuales en los podocitos de los glomérulos recién aislados.
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Artículo de método
Análisis y calcio monocanal Imaging en los podocitos de los glomérulos recién aisladas
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Resumen
Resumen
Se sabe que los podocitos (células epiteliales glomerulares renales) regulan la permeabilidad glomerular y mantienen la estructura glomerular; se ha establecido un papel clave para estas células en la patogénesis de diversas enfermedades renales, ya que la lesión de los podocitos conduce a la proteinuria y al borrado del proceso del pie. Anteriormente se informó que varios agentes endógenos pueden causar una sobrecarga dramática en la concentración intracelular de Ca2+ en los podocitos, lo que presumiblemente conduce a la albuminuria, y esto probablemente ocurre a través de los canales iónicos conductores de calcio. Por lo tanto, parecía importante estudiar el manejo del calcio en los podocitos tanto en condiciones normales como en diversos estados patológicos. Sin embargo, los enfoques experimentales disponibles se han limitado en cierta medida a las células cultivadas y transfectadas. Aunque representan un buen modelo básico para este tipo de estudios, se extraen esencialmente del entorno nativo del glomérulo. En este trabajo describimos la metodología de estudio de los podocitos como parte del glomérulo entero recién aislado. Esta preparación conserva el potencial funcional de los podocitos, que aún están unidos a los capilares; Por lo tanto, los podocitos permanecen en el ambiente que conserva las partes principales del aparato de filtración de los glomérulos. El presente manuscrito desarrolla dos enfoques experimentales que permiten 1) la detección en tiempo real de cambios en la concentración de calcio con la ayuda de microscopía de fluorescencia confocal ratiométrica, y 2) el registro de la actividad de los canales iónicos individuales en los podocitos de los glomérulos recién aislados. Estas metodologías utilizan las ventajas del entorno nativo del glomérulo que permite a los investigadores resolver cambios agudos en el manejo del calcio intracelular en respuesta a aplicaciones de diversos agentes, medir la concentración basal de calcio dentro de las células (por ejemplo, para evaluar la progresión de la enfermedad) y evaluar y manipular la conductancia del calcio a nivel de canales iónicos individuales.
Introducción
Los riñones mantienen el equilibrio homeostático para diversas sustancias y regulan el volumen de sangre en una forma que determina la presión de la sangre total. Las perturbaciones en la filtración renal, reabsorción o plomo secreción o acompañar a los estados patológicos, que van desde la hiper o hipotensión que terminan enfermedad renal que eventualmente requiere un trasplante de riñón. La unidad de filtración renal (glomérulo) consiste en tres capas - el endotelio capilar, la membrana basal y una capa de una sola célula de las células epiteliales - podocitos, que desempeñan un papel importante en el mantenimiento de la integridad y la función 1-rendija de diafragma. Disfunción en el filtro glomerular de permeabilidad selectiva provoca la pérdida urinaria de macromoléculas, tales como proteinuria. Varios agentes pueden afectar a la estructura de los podocitos y sus procesos de pie, que determinan la integridad de la barrera de filtración glomérulos.
Los podocitos están involucrados en el mantenimiento de la Glomfunción de filtración eruli. Se ha establecido que el manejo inadecuado de calcio por el podocitos conduce a la lesión de las células y juega un papel importante en la progresión de diversas formas de nefropatías 2,3. Por lo tanto, el desarrollo de un modelo que permite la medición directa de los cambios de concentración de calcio intracelular será fundamental para el estudio de la función de podocitos. Glomérulos aislados se utilizaron previamente en un numerosos estudios incluyendo la medición del coeficiente de reflexión albúmina cambia 4 y la evaluación de las corrientes celulares integrales en las mediciones electrofisiológicas de patch-clamp de células enteras 5,6. En el presente trabajo se describe el protocolo que permite al investigador para medir cambios en la concentración de calcio intracelular en respuesta a las solicitudes de los agentes farmacológicos, estimar los niveles basales de calcio dentro de las células, y evaluar la actividad de los canales de calcio individual. Mediciones de la concentración de calcio y Ratometric electrop patch-clamphysiology se utilizaron para determinar los cambios en la concentración de calcio intracelular dentro de la actividad de podocitos y el canal, respectivamente.
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Protocolo
El uso de animales y el bienestar deben adherirse a la Guía del NIH para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio siguiendo los protocolos revisados y aprobados por el Cuidado y Uso de Animales Comité Institucional (IACUC).
Flush 1. Riñón
- Emplear de 8 a 12 semanas de edad rata macho (sugerida es una cepa Sprague Dawley, sin embargo otras cepas de diferente edad y el género se pueden utilizar con los cambios apropiados).
- Anestesiar al animal de acuerdo con el procedimiento permitido por protocolo de IACUC; controlar la profundidad de la anestesia e inspeccionar el animal. La descripción detallada de la cirugía que se realiza en 01.03 a 01.08 se pueden encontrar en Ilatovskaya et al 7.
- Después de la anestesia adecuada, coloque el animal en una mesa quirúrgica con control de temperatura, hacer una incisión en la línea media del abdomen (hasta 3 pulgadas de largo), y descubrir la vena cava y la aorta.
- Inserte ligadura alrededor de los celíacos y mesentéricos superiores arterias y el abdomenaorta por encima de aquellos; no ligar.
- Blunt disección de la aorta abdominal por debajo de las arterias renales, y coloque dos ligaduras alrededor de ella, pero no ligar, a continuación, sujetar la aorta por encima de las ligaduras y atar el hilo inferior.
- Cateterizar la aorta con un tubo de PE50 de polietileno (que se adjunta a una bomba de jeringa llena con PBS) por debajo de la abrazadera y fijar el catéter con la segunda ligadura; quitar la pinza, encienda la bomba, y ligar la aorta y arterias mesentérica con celíacos. Hacer rápidamente incisión en la vena renal para aliviar la presión.
- Infundir la aorta con el PBS pre-enfriado para 2 o 3 min a una velocidad de 6 ml / min.
- Deje de perfusión, los impuestos especiales y decapsulate 7 los riñones, y los puso en el hielo en la solución de PBS. La eutanasia del animal según el protocolo aprobado por el IACUC.
2. Aislamiento de la rata Los glomérulos
- Preparar 30 ml de solución fresca de 5% de BSA en medio RPMI 1640.
- Utilizando una hoja de afeitar y tijeras,aislar la corteza de ambos riñones, y luego picar hasta homogeneidad. Este procedimiento ha sido descrito anteriormente 7.
- Empujar el tejido picada durante el paso anterior a través de un tamiz de acero inoxidable de malla 100 (pre-empapado en 5% de solución de BSA / RPMI) usando una espátula. Recoger el flujo a través y por la fuerza de gravedad permiten que el flujo a través pase a través de un tamiz de 140 mesh.
- Filtrar el flujo a través recogido de la malla 140 usando un tamiz de 200 tamiz de malla pre-empapado, desechar el filtrado, y lavar la parte superior del tamiz con 10 - 15 ml de la solución de BSA / RPMI preparado para recoger los glomérulos que el sedimento en el tamiz.
- Ponga la solución de BSA / RPMI que contiene glomérulos en el hielo en un tubo de 15 ml y dejar que el sedimento glomérulos en la parte inferior del tubo para un máximo de 20 min. El concentrado glomérulos en la parte inferior del tubo se puede ver claramente. Eliminar el exceso de solución, dejando aproximadamente 2 ml en el tubo.
3. monocanal Patch-clamp Electrophysiology
- Preparar 5 x 5 mm chips de vidrio cubierta por revestimiento con 70.000 MW - 150000 poli-ʟ-lisina, y dejar secar. Utilice aproximadamente 30 l de solución filtrada estéril 0,01% en agua por cubierta de vidrio.
- Calentar las soluciones experimentales a temperatura ambiente y llenar la cámara de patch-clamp y la pipeta. Para el monitoreo canales TRPC, utilice una solución de baño, en mM: 126 NaCl, CaCl2 1, 10 HEPES, 2 MgCl2, 10 glucosa, pH 7,4; pipeta: 126 NaCl, 1,5 CaCl 2, 10 HEPES, 10 glucosa; pH 7,4.
- Añadir inhibidores a la solución de la pipeta para bloquear la actividad de los canales endógenos, que no son relevantes para los estudios (recomendados son: 100 mM de ácido niflúmico, o DIDS (para bloquear Ca 2 + activados por Cl - canales), TEA 10 mM (para inhibir la de gran conductancia Ca 2 + - K + dependientes de canal), 10 nM iberiotoxina (para bloquear los Ca2 + activados por canales de K +), 10 mM nicardipina (para bloquear de tipo N Ca2 + canales)) directamente antes del experimento de patch-clamp.
- Mezclar suavemente la solución que contiene los glomérulos, y luego aplicar aproximadamente 50 l de a la cubierta revestida virutas de cristal poli-ʟ-lisina. Deje que los glomérulos conceden durante aproximadamente 5 minutos.
- Mover los chips de vidrio con glomérulos a la cámara de patch-clamp pre-llenado con la solución del baño; perfundir la cámara a una velocidad de 3 ml / min durante 1 min para asegurar la eliminación de los glomérulos no fijadas.
- Llevar a cabo un experimento de patch-clamp convencional en un modo celular conectado a 7. Con una pipeta de vidrio (7 - 10 de mO resistencia pipeta) formar un sello de alta resistencia entre una pipeta y una membrana de podocitos mediante la aplicación de una succión suave (una pipeta unida a una podocitos en la superficie del glomérulo aislado se muestra en la Figura 2, en la izquierda).
- Para las mediciones de células inscritos, de paso bajo las corrientes de 300 Hz por un filtro de ocho polos de Bessel.
- Use aisló glomérulos en experimentos de patch-clamp para un máximo de 4-6 horas. Mantenga la fracción de stock glomérulos en hielo.
4. Ratiometric confocal de fluorescencia mediciones de la concentración de calcio intracelular en los podocitos
- Coloque 500 l de la fracción de glomérulos (descrito en 2.5) en 0,5 ml tubo cónico y añadir colorantes calcio Fura Red, AM y Fluo-4, de AM. Utilice 2 mM y 1 mM concentraciones stock de Fura Red, AM y Fluo-4 AM, respectivamente (almacenar a -20 ° C, se disolvió en DMSO) y el uso de 2,5 l de cada colorante por unos 500 l de fracción glomérulos. Inmediatamente después de la adición de los colorantes cubrir el tubo con papel de aluminio.
- Colocar los tubos en un agitador giratorio durante al menos 20 min hasta 1 h a RT.
Nota: Los agentes farmacológicos pueden ser añadidos durante este paso. - Preparar cubreobjetos de vidrio, cubrirlos con poli-ʟ-lisina y permitir el secado utilizando conjunto placa calentada a 70 ° C.
- Una vez que la carga de colorantes de calcio es complete, aplicar 100 l de los glomérulos que contienen solución a los cubreobjetos recubiertos de poli-ʟ-lisina y dejar que ellos se adhieren a la superficie durante aproximadamente 5 min. Montar los cubreobjetos glomérulos conectado a una cámara de formación de imágenes, y perfundir con la solución del baño (que contiene (en mM): 145 NaCl, 4,5 KCl, 2 MgCl 2, 10 HEPES, pH 7,35) a una velocidad de 3 ml / min para eliminar los glomérulos no unidas y los tintes restantes.
- Ajuste el microscopio de barrido confocal láser a una longitud de onda de excitación de 488 nm y filtros de emisión (525/25 y 650/25 nm para Fluo-4 y Fura Red, respectivamente). Ajuste el software de imágenes a una frecuencia y resolución deseada.
- Encuentra los glomérulos en campo claro y luego girar en la detección de la señal de fluorescencia. Ajuste de la intensidad del láser para cada tinte para evitar la saturación de la señal. Elija el plano focal con los podocitos que están directamente conectados a la copa. Esto minimiza el efecto causado por la contracción de un glomérulo en respuesta a drogassolicitud. Haga doble verificación que el glomérulo de elección es bien unido al cristal;
- Comience imágenes del plano focal de elección (tomar 512 x 512 imágenes con la frecuencia establecida en 4 segundos para visualizar Ca 2+ rápida cambios transitorios. Use un NA 1.4 o / lente de objetivo similar 60X imagen de alta resolución para), aplicar fármacos de interés, y registrar la respuesta.
- Seleccionar un plano focal deseada (tan cerca de la superficie del vidrio como sea posible, para asegurar la obtención de imágenes de los podocitos en la superficie del glomérulo). Compruebe la intensidad de la fluorescencia en el Fluo4 y canales FuraRed, y asegúrese de que el glomérulo se ve claramente en campo claro.
- Iniciar la formación de imágenes. Antes de la aplicación de cualquier droga, ficha al menos 1 min de la fluorescencia de referencia para asegurarse de que la señal es estable (no hay picos repentinos o desvanecimiento de la señal).
- Aplicar medicamentos deseados con la ayuda de una micropipeta; tener cuidado y asegurarse de la droga era capaz de difundir bien y llegar a la glomerulus. Mezcle la solución del baño suavemente, si es necesario, controlar el plano focal seleccionada y comprobar que no se movió fuera de foco debido a la aplicación del fármaco.
- Registre los cambios en la intensidad de fluorescencia de las señales Fluo4 y FuraRed. Asegúrese de que la grabación es lo suficientemente largo, por la espera hasta que la señal alcanza el nivel de meseta o alcanza un pico y luego vuelve a la línea de base. Realizar el cambio o adición de solución de otros medicamentos si es necesario.
- Detener la grabación y guardar el archivo en el formato nativo del software.
5. Análisis de imagen para las mediciones de calcio
- Realizar análisis de imágenes con el software ImageJ abierta equipada con el plugin Utilidad ND que permite la importación de imágenes en el formato nativo ND2.
- Importe la secuencia de imágenes; asegúrese de dividir los canales y utilizar un modo de escala de grises HyperStack.
- Siga el camino → Herramientas → Analizar gerente ROI en el software ImageJ para opluma una ventana del gestor ROI. Seleccione varias regiones de interés (podocitos) utilizando una herramienta de selección ovalada y el "Añadir (t)" función en el Administrador de retorno de la inversión. Como el último ROI, seleccione el área en el fondo; guardar la ROI seleccionados (Más → Guardar).
- Resalte la ventana que contiene el canal seleccionado para los análisis. Utilice la función de Más → Medida múltiples en el Administrador de retorno de la inversión, marque la casilla de "una fila por rebanada" en el diálogo que aparece, y luego haga clic en Aceptar. Los resultados se muestran en el formato que se puede configurar en la ventana de resultados: entrar en la opción de menú Resultados → Set mediciones, seleccione "valor de gris medio" y calcular los valores de intensidad de píxel para cada ROI, que se muestra en el ventana Resultados en columnas separadas para cada ROI.
- Copiar los valores de intensidad medidos de ROI para cada canal (Fluo-4 y Fura Red) en el software de análisis de datos preferido; valores de intensidad fondo restar de cada datun punto.
- Para cada punto de tiempo de calcular la relación de intensidades de la Fluo-4 a los canales de Fura rojas. Gráfico de dispersión / línea cambios en tiempo punto de Ca 2+ transitorio para cada ROI. Calcular los valores medios / SE para glomérulos seleccionados.
Nota: la columna Tiempo debe ajustarse de acuerdo a la frecuencia de imagen seleccionado en el 4,5.
6. intracelulares cálculos de concentración de calcio Fluo-4 Uso de la señal de fluorescencia
- Tomar una muestra de los glomérulos y realizar el protocolo experimental hasta el paso 4.7. Después de la grabación de la fluorescencia de fondo añadir ionomicina (concentración final en la cámara de baño debe ser de 10 M) a la solución del baño, y el aumento de la intensidad de fluorescencia registro. Una vez que la intensidad alcanza su máximo y la decadencia se inicia, agregue MnCl2 (concentración final debe ser de 5 mM) para apagar la fluorescencia 8.
- Analizar los datos obtenidos en 6.1. Copie los Fluo-4 valores de intensidad de señal de retorno de la inversión obtenidos de acuerdocon el protocolo descrito en 5.1 a 5.5 por software de análisis preferido.
- Calcular la concentración de calcio intracelular (en nM) en el podocito correspondiente a la ROI mediante una fórmula:
donde K d es una disociación predeterminado constante de Fluo-4 (345 nm), F es la intensidad en el punto de tiempo que se está calculando la concentración de calcio para la (línea de base), y F min y F max son los valores de intensidad de la punto de carga máxima de calcio (después de la aplicación ionomicina) y después de la extinción de la fluorescencia (con MnCl 2), respectivamente (véase la Figura 3).
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Resultados
Aquí abordamos el problema de la medición de los cambios agudos en los niveles de calcio en los podocitos. La figura 1 muestra una representación esquemática del protocolo experimental diseñado para realizar alta resolución de imagen confocal de fluorescencia en vivo y grabaciones de actividades individuales de los canales iónicos en los podocitos del recién glomérulos roedores aislados. En pocas palabras, después de que se anestesió la rata, los riñones deben lavarse con PBS para borrarlos de la sangre...
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Discusión
El enfoque descrito aquí permite el análisis de manejo del calcio por los podocitos de los glomérulos de roedores. Esta técnica permite la aplicación de patch-clamp electrofisiología solo canal y de fluorescencia de imagen confocal radiométrica. Sin embargo, ambos enfoques pueden ser utilizados por separado, por su propia cuenta. El protocolo propuesto tiene varios pasos relativamente simples, incluyendo ras 1) del riñón; 2) el aislamiento de los glomérulos por tamizado diferencial; 3) la realización de patch-clamp expe...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer a Glen Slocum (Colegio Médico de Wisconsin) y Colleen A. Lavin (Nikon Instruments, Inc.) para una excelente asistencia técnica con los experimentos de microscopía. Gregory Blass es reconocido por corrección crítica del manuscrito. Esta investigación fue financiada por los Institutos Nacionales de Salud de subvención HL108880 y la Asociación Americana de Diabetes conceder 1-15-BS-172 (AS), y el Ben J. Lipps de Becas de Investigación de la Sociedad Americana de Nefrología (DVI).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Fluo4 AM | Life Technologies | F14217 | 500 µl en DMSO |
| FuraRed AM | Life Technologies | F-3020 | |
| Polímero-ʟ- lisina | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| Ácido plurónico | Sigma-Aldrich | F-68 | solución |
| Ionomicina | Sigma-Aldrich | I3909-1ML | |
| Rotador de tubos | Miltenyi Biotec GmbH | 130-090-753 | Alemania |
| Microscopio confocal Nikon (invertido) | Nikon | Nikon A1R | Láser de excitación 488 nm. Filtros de emisión 500-550 nm y 570-620 nm |
| Objetivo | Nikon | Plan Apo 60x/NA 1.4 Aceite | |
| Cubrebarras | Thermo Scientific | 6661B52 | |
| Grasa para alto vacío | Dow Corning | Compuesto de silicona | |
| Software | Nikon | Nikon NIS-Elements | |
| Cámara de grabación/perfusión | Warner Instruments | RC-26 | |
| Amplificador de registro por parche | Molecular Devices | MultiClamp 700B | |
| Sistema de adquisición de datos | Molecular Devices | Digidata 1440A | Axon Digidata® Sistema |
| Filtro de paso bajo | Warner Instruments | LPF-8 | Bessel de 8 polos |
| Capilares de vidrio borosilicato | World Precision Instruments | 1B150F-4 | |
| Tirador de micropipetas | Sutter Instrument Co | P-97 | Micropipeteador del tipo Flaming/Brown |
| Microfórceps | Narishige | MF-830 | Japón |
| Micromanipulador motorizado | Sutter Instrument Co | MP-225 | |
| Microscopio invertido | Nikon | Eclipse Ti | |
| Mesa de aislamiento de microvibraciones | TMC | equipado con jaula de Faraday | |
| Sistema de perfusión con válvula multicanal | AutoMake Scientific | Banco de Válvulas II | |
| Cámara de grabación/perfusión | Warner Instruments | RC-26 | |
| Software | Molecular Devices | pClamp 10.2 | |
| Nicardipina | Sigma-Aldrich | N7510 | |
| Iberiotoxina | Sigma | I5904-5UG | |
| Ácido niflúmico | Sigma-Aldrich | N0630 | |
| DIDS | Sigma-Aldrich | D3514-25MG | |
| cloruro de TEA | Tocris | T2265 | |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 11835030 | sin antibióticos |
| BSA | Sigma-Aldrich | A8327 | solución de albúmina al 30 % |
| Mesa quirúrgica con control de temperatura | núcleo MCW | para roedores | |
| Tamices de acero: | #100 (150 μm), 140 (106 μm) | ||
| Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO200 | Fisher Sci | 50-871-316 | |
| Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO270 | Fisher Sci | 50-871-318 | |
| Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO400 | Fisher Sci | 50-871-320 | |
| malla 200 | Sigma-Aldrich | s4145 | pantalla para CD-1 |
| Microscopio binocular | Nikon | Eclipse TS100 | |
| Microscopio binocular | Nikon | SMZ745 | |
| Sistema de perfusión basado en bomba de jeringa | Harvard Apparatus | ||
| Tubo de polietileno | Sigma-Aldrich | PE50 | |
| Anestesia con isoflurano |  VetEquip, Inc. | 911103 | |
| Otros reactivos básicos | Sigma-Aldrich |
Referencias
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