Co-inmunoprecipitación de la proteína de ratón Mx1 con la Influenza A nucleoproteína del virus

Judith Verhelst; Dorien De Vlieger; Xavier Saelens

doi:10.3791/52871

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Artículo de método

Co-inmunoprecipitación de la proteína de ratón Mx1 con la Influenza A nucleoproteína del virus

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DOI:

10.3791/52871

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21 de abril de 2015

Judith Verhelst¹^,² , Dorien De Vlieger¹^,² , Xavier Saelens¹^,²

¹Inflammation Research Center, VIB, ²Department of Biomedical Molecular Biology, Ghent University

En este artículo

Resumen

Este protocolo de co-inmunoprecipitación permite estudiar la interacción entre la nucleoproteína del virus de la gripe A y la proteína antiviral Mx1 en células humanas. El protocolo enfatiza la importancia de la N-etilmaleimida para la coinmunoprecipitación exitosa de Mx1 y la nucleoproteína del virus de la influenza A.

Resumen

Estudiar la interacción entre proteínas es clave para entender su(s) función(es). Un método muy potente que se utiliza con frecuencia para estudiar las interacciones de las proteínas con otras macromoléculas en una muestra compleja se llama coinmunoprecipitación. El protocolo de co-inmunoprecipitación descrito permite demostrar e investigar más a fondo la interacción entre la proteína 1 (Mx1) de resistencia al mixovirus antiviral y una de sus dianas virales, la nucleoproteína (NP) del virus de la gripe A. El protocolo comienza con células de mamíferos transfectadas, pero también es posible utilizar células infectadas por el virus de la gripe A como material de partida. Después de la lisis celular, la proteína NP viral se reduce con un anticuerpo específico y los inmunocomplejos resultantes se precipitan con perlas de proteína G. El éxito de la reducción de la NP y la coinmunoprecipitación de la proteína antiviral Mx1 se revelan posteriormente mediante Western blot. Un requisito previo para el éxito de la coinmunoprecipitación de Mx1 con NP es la presencia de N-etilmaleimida (NEM) en el tampón de lisis celular. NEM alquila grupos tiol libres. Presumiblemente, esta reacción estabiliza la interacción NP-Mx1 débil y/o transitoria al preservar una conformación específica de Mx1, su objetivo viral o un tercer componente desconocido. Una limitación importante de los experimentos de co-inmunoprecipitación es la extracción inadvertida de proteínas contaminantes, causada por la unión inespecífica de las proteínas a las perlas de proteína G o a los anticuerpos. Por lo tanto, es muy importante incluir la configuración de control para excluir los resultados falsos positivos. El protocolo de co-inmunoprecipitación descrito se puede utilizar para estudiar la interacción de proteínas Mx de diferentes especies de vertebrados con proteínas virales, cualquier par de proteínas, o de una proteína con otras macromoléculas. El papel beneficioso de NEM para estabilizar las interacciones débiles y/o transitorias debe probarse para cada par de interacción individualmente.

Introducción

Resistencia Myxovirus (Mx) las proteínas son una parte importante de la defensa inmune innata contra los patógenos virales. Estas proteínas son grandes GTPasas-dynamin como que son inducidos por el tipo I y tipo III interferones. Los genes MX correspondientes están presentes en casi todos los vertebrados en una o varias copias y sus productos génicos inhiben una amplia gama de virus, incluyendo Orthomyxoviridae (por ejemplo., Virus de la gripe), Rhabdoviridae (por ejemplo., Virus de la estomatitis vesicular), Bunyaviridae (por ejemplo. , el virus de la crosse) y Retroviridae (por ejemplo, virus de inmunodeficiencia humana-1) ^1....