Abstract
الأديم المتوسط البلعوم الأجنة النامية يساهم في مناطق واسعة من الرأس وعضلات القلب. قمنا بتطوير طريقة جديدة لدراسة الرأس والسلف القلب تنمية الخلايا مع الأقواس البلعومية (المعروف أيضا باسم الأقواس خيشومي) خارج الحي. باستخدام هذه الطريقة، التي وصفناها في الآونة الأخيرة أن القوس البلعومية الثاني يحتوي الأسلاف القلب تجديد الذات وبمثابة المكروية لتوسيع الأسلاف خلال تطوير الماوس القلب. تبقى الخلايا الاصلية غير متمايزة واسعة داخل القوس، ولكن سرعان ما تصبح العضلية وظيفية تهاجر خارج القوس. ذكرنا أيضا أن أول القوس البلعومية يحتوي الأسلاف العضلات مما أدى إلى myotubes بعد خروجه من القوس. هنا، علينا أن نظهر إجراء تشريح الجسم الحي وخارج ثقافة الأولى والثانية الأقواس البلعومية من تطوير أجنة الفئران. طريقة تمكن واحد لدراسة الرأس والقلب السلف / ديف العضلاتelopment، بما في ذلك cardiomyocyte وتشكيل myotube مركزيا في التفاصيل خارج الحي.
Introduction
خلايا الأديم المتوسط البلعوم تؤدي إلى أجزاء من القلب وعضلات البلعوم. أثناء التطور الجنيني، الخلايا الاصلية القلب متعددة القدرات من الميدان قلبية ثانية تهاجر من الأديم المتوسط البلعوم وتعبئة المسالك تدفق القلب والبطين الأيمن، ويرتبط ارتباطا وثيقا تنميتها غير طبيعية مع مرض القلب الخلقي السبب الرئيسي للالعيوب الخلقية وdefect- الولادة الوفيات المرتبطة في البشر 1-3. وقد أثبتت الدراسات الحديثة أن البلعوم الأديم المتوسط يساهم في رأس العضلات، بالإضافة إلى القلب، مما يجعل من الأديم المتوسط جزء هام من التنمية القلب القحفي 4. وبالتالي، فإن العمليات التنموية بما في ذلك الاستقراء، والانتشار، والتفريق بين الرأس والقلب الأسلاف في الأديم المتوسط البلعوم هي قيد التحقيق النشط 5-7.
حتى وقت قريب، فإنه لا يزال غير معروف ما إذا كانت الخلايا الاصلية القلب تخضع witho التوسعالتحرير التمايز، ويرجع ذلك جزئيا إلى عدم توافر معلومات عن بيئتهم الخلوية. تشير دراستنا الأخيرة أن الأقواس البلعومية بمثابة المكروية لتجديد الأسلاف القلب والعضلات ويمكن تربيتها خارج الجسم الحي على مدى عدة أسابيع 8. يوفر هذا الأسلوب يزدرع فرصة جديدة وفريدة من نوعها لدراسة تطوير الأسلاف القلب والقحفي خارج الحي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
واستمرت كل الفئران في والجمعية الأمريكية لاعتماد المختبرات رعاية الحيوان (AAALAC) -accredited منشأة الحيوان في جامعة جونز هوبكنز ويضم وفقا للإجراءات المنصوص عليها في دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية. وافقت لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي (IACUC) جميع البروتوكولات التجريبية.
1. إعداد التجريبية
- معطف لوحة 12-جيدا مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) في الفوسفات مخزنة الحل (PBS) لمدة 60 دقيقة.
- إزالة حل طلاء وإضافة 200 ميكرولتر من وسائل الإعلام الحرة المصل (SFM). برم لوحة للتأكد من أن الفيلم من وسائل الاعلام يغطي مساحة بأكملها.
2. العمليات الجراحية
- الموت ببطء الفئران الحوامل باستخدام بروتوكول رعاية الحيوان وافقت عليها لجنة المؤسسة تليها خلع عنق الرحم للتأكد من القتل الرحيم كاملة.
- رش وتنظيف المنطقة بطن الفأر مع 70٪الإيثانول. الحفاظ على تقنيات معقمة صارمة لتجنب التلوث.
- استخدام ملقط ومقص لتقديم 0.5 سم 2 شق في منطقة السرة.
- استخدام الأصابع لقرصة / انتزاع الجلد فوق وتحت شق وسحب بلطف الجلد في اتجاهين متعاكسين (الرأس والذيل).
- استخدام ملقط ومقص لإجراء شق الأولي في الغشاء في منطقة السرة. خفض بلطف الغشاء في V-شكل من السرة إلى المبيضين على كل جانب (2 × 1.5 سم 2)، وبالتالي الكشف عن الرحم.
- استخدام ملقط لقرصة قناة البيض ربط الرحم إلى المبيض ومقص لقرصة قناة البيض على الجانب المبيض، وبالتالي تحرير الرحم من المبيض.
- سحب بلطف صعودا الرحم بواسطة قناة البيض مع ملقط وقطع الرحم خال من منطقة المثانة مع مقص.
- سحب الرحم زيادة بنسبة قناة البيض مع ملقط، وقطع قناة البيض مع مقص على الجانب الآخر، وبالتالي الإفراج عن الرحم من م[أوس].
- نقل الرحم إلى أنبوب 50 مل وإضافة 20 مل من برنامج تلفزيوني الباردة عقيمة مع الكالسيوم والمغنيسيوم 2+ 2+. PBS يجب أن يحتوي على الكالسيوم والمغنيسيوم 2+ 2+ خلال تشريح الجنين.
- يهز بلطف الأنبوب لمدة 10 ثانية لغسل الرحم للدم.
- نقل الرحم من الأنبوب مع ملقط ووضعه في طبق 10 مل وإضافة 5 مل من برنامج تلفزيوني الباردة على الجزء العلوي من الرحم.
- وضع الطبق مع الرحم تحت stereomicroscope.
ملاحظة: الخطوات 2،13-2،19 يتطلب stereomicroscope. - استخدام اثنين من أزواج من ملقط لفتح بلطف الرحم وتشريح خارج الحويصلات السلوي مع الأجنة من الرحم واحدا تلو الآخر.
- استخدام اثنين من أزواج من ملقط لفتح بعناية الكيس الأمنيوسي الذي يحيط الجنين، قرصة الكيس مع واحد ملقط وبلطف إزالته من الجنين، استخدام الملقط أخرى لخفض والافراج عن الكيس الذي يحيط بالجنين من الجنين. إذا كان النمط الجيني المحددة اللازمة، والحفاظ على الكيس السلوي لالتنميط الجيني.
- وضع الجنين على الجانب واستخدام ملقط لقطع شارع 1 و 2 الثانية قوس خلفي للقلب بين القوس والحقيبة البلعوم (الشكل 1A '').
- الوجه بلطف الجنين إلى الجانب الآخر واستخدام ملقط لقطع 1 و 2 قوس خلفي للقلب بين القوس والحقيبة البلعوم.
- استخدام ملقط لقطع المسالك تدفق القلب الذي لا يزال يربط بين شارع 1 و 2 الثانية البلعوم الأقواس إلى الجنين. إزالة الأقواس، والتي لا تزال تعلق معا في شكل فراشة (الشكل 1B)، من الجنين.
- استخدام ملقط لقرصة والافراج عن 1 أقواس الحادي والبلعوم مما تبقى من القلب المسالك تدفق والمعى الأمامي الأديم الباطن (الشكل 1B '' وأشار مع خط متقطع و*).
- استخدام ملقط لقرصة والافراج عن الأقواس 2 الثانية البلعوم مما تبقى من القلب تدفق المجاريوالمعى الأمامي الأديم الباطن (الشكل 1B '' وأشار مع خط متقطع و**).
- نقل كل زوج من الأقواس بشكل منفصل باستخدام ملقط ووضع حد سواء الأقواس في منتصف المعين جيدا. لوحة 1 و 2 ش الثانية البلعوم الأقواس في آبار منفصلة. تأكد من أن الأقواس على اتصال مع الفيلم وسائل الإعلام المضافة في الخطوة 1.2. ومن الأهمية بمكان أن الأقواس غير مشمولة المتوسطة، لأنها تحتاج إلى إجراء اتصالات مع سطح البئر لمرفق خلال هذه الفترة.
3. الحضانة والتصوير
- احتضان الأقواس مطلي في 12 لوحة جيدا في 37 ° C / 5 CO 2٪ لمدة 2 ساعة لالأقواس لنعلق على منطقة السطح جيدا.
- بلطف إضافة 200 ميكرولتر من 37 درجة مئوية SFM أسفل الجانب من البئر. تأكد من أن الأقواس لا تزال تعلق واحتضان O / N.
- اليوم التالي، والتحقق بصريا أن الأقواس البلعومية وترد وتضيف بلطف 200 ميكرولتر من 37 درجة مئوية SFM أسفل الجانب منحسنا. إذا ظلت الأقواس غير مرتبط والعائمة، وإزالة بلطف وسائل الاعلام مع ماصة دون إزالة الأقواس حتى يتم ترك الفيلم من وسائل الإعلام فقط. استخدام ماصة لوضع الأقواس في منتصف البئر وكرر الخطوة 3.1.
- مراقبة يوميا؛ إضافة ~ 100-200 ميكرولتر من وسائل الإعلام كل يوم 2 لاستبدال أي وسائط تبخرت.
ملاحظة: 24-48 ساعة بعد الخلايا المهاجرة تظهر حول قوس وسوف تتكاثر وتهاجر من قوس خلال الأيام المقبلة 5-8. بعد 36-72 ساعة من تشكيل العضلية الضرب ويمكن ملاحظة من 2 الثانية البلعوم القوس (الشكل 2B). ويمكن ملاحظة تكوين myotube مركزيا من 1 الحادي والبلعوم اللدود 3-7 أيام بعد التعلق (الشكل 2A).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
خلال التنمية، الوجه العضلات والقلب الأسلاف يمكن أن تعزى لأنها تتكاثر وتهاجر من شارع 1 و 2 الثانية البلعوم القوس، ليصبح الرأس وعضلات القلب، على التوالي (الشكل 1A، A 'و' '). زراعة الأقواس البلعومية يوفر وسيلة فريدة لدراسة القلب والعضلات التنمية في التفاصيل خارج الحي. بعد تشريح والتعلق من الأقواس البلعومية، ويمكن ملاحظة الخلايا المهاجرة من الأقواس المرافق خلال 24-48 ساعة من الثقافة. في غضون 3 أيام من تشكيل myotube مركزيا الثقافة يمكن ملاحظتها من 1 شارع الأقواس البلعومية وتشكيل cardiomyocyte من الأقواس البلعومية 2 الثانية (الشكل 2A و 2B). تشكيل Cardiomyocyte يمكن التأكد بصريا عن طريق التعاقد من تلقاء أنفسهم مجموعات من الخلايا و / أو تحليل علامات cardiomyocyte محددة المهاجرة (على سبيل المثال، القلب تروبونين T). Myotuيتم تشكيل العضلات / الوجه يمكن ملاحظتها بصريا ممدود طويلة (تصل إلى 500 ميكرومتر في الطول) خلايا و / أو تحليل علامات محددة من العضلات (على سبيل المثال، Myogenin) الوخز من تلقاء أنفسهم. باستخدام نظام لجنة المساواة العرقية، السلمون المدخن في الفئران، الأديم المتوسط ذرية يمكن أن تعزى للصحفيين الفلورسنت على لجنة المساواة العرقية في التعبير خلال فيفو السابقين الثقافة (الشكل 2A "و 2B). وبالمثل، مع هذا الأسلوب فمن الممكن لدراسة مصير ذرية حيث يتم طرقت جين معين من الاهتمام بشروط الخروج أو overexpressed، التي على خلاف ذلك من شأنه أن يؤدي في وقت مبكر الفتك الجنينية ونحن سبق وصفها 8.
الشكل 1: الفأر الجنين (Mesp1 لجنة المساواة العرقية، Ai9) 9.5 أيام الإخصاب آخر (E.9.5 >). (A) الجانب الأيسر من الجنين. (PA: بلعومي القوس، OT: التدفق المسالك، LV:. البطين الأيسر (A ') Mesp1 عدد الأسطر التتبع؛ RFP يصادف Mesp1 + الخلايا وذريتها السهم يشير RFP + Mesp1-ذرية في PA2 هذا هو مستمر مع OT. (A '') خط متقطع يشير فيها إلى قطع PA1 وPA2 الخلفي للقلب (B) الفراشة مثل اليمين واليسار PA1 وPA2 بعد تشريح من الجنين FE:. الأديم المعى الأمامي (B ') علامات RFP Mesp1 ذرية . في PA1 وPA2 (B '') * و ** جنبا إلى جنب مع الخطوط المتقطعة يشير فيها إلى قطع والافراج عن PA1 وPA2 من OT وFE شريط مقياس: 500 ميكرون الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الشكل.
تحميل / 52876 / 52876fig2.jpg "/>
الشكل 2: الأقواس البلعومية مثقف (A) PA1 مثقف (3 أيام للثقافة). (A ') يمثل RFP Mesp1 ذرية في PA1. السهام و* تشير تشكيل myotube مركزيا في وقت مبكر. (A '') تراكب التعبير RFP في PA1. (B) PA2 مثقف (8 أيام للثقافة). (B ') علامات RFP Mesp1 ذرية في PA2. السهام و** تشير الضرب مجال العضلية (معدلة من Shenje وآخرون. 8). (B '') تراكب التعبير RFP في PA2. شريط مقياس: 250 ميكرون الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذا الفيديو، ونحن لشرح كيفية عزل والثقافة أولا والبلعوم الثاني أقواس 9.5 أيام أجنة الفئران القديمة. وعابرة، مجزأة الأقواس البلعومية الانتفاخات التي تظهر على الجانب craniolateral الأجنة النامية 9، والتي تحتوي على كتل بناء الخلايا الاصلية قلبية متعددة فعالة لجعل القلب أثناء التطور الجنيني 10،11 -في الأقواس الثانية والأسلاف العضلات الرئيسي في الأقواس الأولى 8 .
تشريح الأقواس البلعومية يتطلب المتقدمة جنين فأر المهارات تشريح. مرة واحدة وقد تم تشريح الأقواس بنجاح باستخدام هذا البروتوكول خطوة بخطوة ونقل الآبار المغلفة مسبقا ل، فمن الأهمية بمكان أن الأقواس نعلق على منطقة القاع. في هذا البروتوكول، ونحن الآبار معطف مع 10٪ FBS تليها الثقافة في الإدارة المستدامة للغابات مما أدى إلى المرفق ونمو> 75٪ من الأقواس، ومواد الطلاء ولكن أخرى يمكن استخدام (matrigel، والجيلاتين، فبرونيكتين الخ) وكذلك حساب المشترك المصلوسائل الإعلام ining.
الأقواس البلعومية بمثابة براعم للعديد من الهياكل خلال التنمية. بعد التشكيل الأولي من الأقواس البلعومية (8 أيام بعد الإخصاب في الفئران)، لتكلفة النقرة تتوسع في PA2 وتهاجر إلى تدفق الجهاز القلبي حيث تتمايز إلى خلايا القلب، وبالتالي بمثابة مصدر متجدد للكلفة النقرات التي تزود الخلايا اللازمة للحفاظ على القلب النمو. كما الأقواس البلعومية هي هياكل الزمنية التنموية (E8-11.5) وهجرة لتكلفة النقرة في المسالك تدفق يحدث من حوالي E8-E10) هذا يجلب بعض القيود على هذه التقنية. للدراسات للحزب الشيوعى الصينى، ونحن نوصي باستخدام الأقواس البلعومية تشريح بين E9-10، في هذه المرحلة كل PA2 تحتوي على ما يقرب من 5-800 RFP + الخلايا (Mesp1 عدد الأسطر التتبع).
مع وضع العلامات الفلورية، هذه الثقافة فيفو السابقين تسمح لنا بمراقبة الأسلاف تطوير والتمايز بهم إلى الضرب العضلية أو myotubes طن في الوقت الحقيقي. وبالإضافة إلى ذلك، فإن هذا النظام الثقافة فيفو السابقين يمكن استخدامها لدراسة دور العوامل خلية مستقلة وmicroenvironmental تؤثر على القلب انتشار السلف / الخلية العضلية، والهجرة، وتمايز باستخدام خطوط جنة المساواة العرقية / loxP القائمة. على هذا النحو، ومن المتوقع أن يسهل / العضلات الدراسات سلف-مكانة القلب، مما قد يؤدي إلى فهم أفضل لتشكيل القلب / العضلات ومرض هذا النظام.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | |
| PBS + Ca2 + Mg2 | Corning | 21-030-CV | |
| 10 cm Petri plates | Fishersci | FB0875712 | |
| Scissor | |||
| Dissection forceps | |||
| Serum Free Media: | |||
| IMDM | Cellgro | 15-016-CV | |
| Ham’s F12 | Cellgro | 10-080-CV | |
| N2-SUPPLEMENT | Gibco | 17502-048 | |
| B27-retinoic acid | Gibco | 12587-010 | |
| 10% BSA (in PBS) (Invitrogen Cat#. P2489) | Life Sciences | P2489 | |
| 100x Glutamine (Gibco Cat.# 25030-081) | Gibco | 35050-61 | |
| 100x Pen/Strep (Gibco Cat#. 15070-063) | Gibco | 15140-122 |
References
- Kelly, R. G.
- Congenital Heart Defects. , CDC. Available from: http://www.cdc.gov/ncbddd/heartdefects/index.html (2013).
- Bruneau, B. G. The developmental genetics of congenital heart disease. Nature. 451, 943-948 (2008).
- Tzahor, E., Evans, S. M. Pharyngeal mesoderm development during embryogenesis: implications for both heart and head myogenesis. Cardiovasc Res. 91, 196-202 (2011).
- Uosaki, H., et al. Direct Contact with Endoderm-like Cells Efficiently Induces Cardiac Progenitors from Mouse and Human Pluripotent Stem Cells. PLoS One. 7 (10), e46413 (2012).
- Cheng, P., et al. Fibronectin mediates mesendodermal cell fate decisions. Development. 140, 2587-2596 (2013).
- Kwon, C., et al. A regulatory pathway involving Notch1/beta-catenin/Isl1 determines cardiac progenitor cell fate. Nature cell biology. 11, 951-957 (2009).
- Shenje, L. T., et al. Precardiac deletion of Numb and Numblike reveals renewal of cardiac progenitors. Elife. 3, e02164 (2014).
- Grevellec, A., Tucker, A. S. The pharyngeal pouches and clefts: Development, evolution, structure and derivatives. Semin Cell Dev Biol. 21, 325-332 (2010).
- Kwon, C., Cordes, K. R., Srivastava, D. Wnt/beta-catenin signaling acts at multiple developmental stages to promote mammalian cardiogenesis. Cell Cycle. 7, 3815-3818 (2008).
- Cho, G. S., Fernandez, L., Kwon, C. Regenerative medicine for the heart: perspectives on stem-cell therapy. Antioxid Redox Signal. 21, 2018-2031 (2014).
