Abstract
Il mesoderma faringeo di embrioni in via di sviluppo contribuisce ad ampie regioni della testa e la muscolatura cardiaca. Abbiamo sviluppato un nuovo metodo per studiare la testa e il cuore lo sviluppo delle cellule progenitrici con archi faringei (noto anche come archi branchiali) ex vivo. Utilizzando questo metodo, abbiamo recentemente descritto che il secondo arco faringeo contiene progenitori cardiaci auto-rinnovamento e serve come un microambiente per l'espansione dei progenitori durante lo sviluppo del cuore del mouse. Le cellule progenitrici rimangono indifferenziate ed espansivo dentro l'arco, ma rapidamente diventano cardiomiociti funzionali mentre migrano fuori dell'arco. Abbiamo anche segnalato che il primo arco faringeo contiene progenitori muscolari che danno luogo a miotubi dopo aver lasciato l'arco. Qui, dimostriamo la procedura per la dissezione e ex vivo cultura del primo e del secondo archi faringei da embrioni di topo in via di sviluppo. Il metodo permette di studiare la testa e il cuore progenitore / dev muscolareelopment, compresi cardiomiociti e myotube formazione in dettaglio ex vivo.
Introduction
Cellule mesoderma faringei danno origine a parti del cuore e dei muscoli faringei. Durante lo sviluppo embrionale, le cellule progenitrici multipotenti cardiache dal secondo campo cuore migrano dal mesoderma faringeo e popolano il tratto di efflusso cardiaco e ventricolo destro, e il loro sviluppo anormale è strettamente associata con la malattia-cuore congenita principale causa di difetti alla nascita e nascita-difetto decessi correlati nell'uomo 1-3. Recenti studi hanno dimostrato che faringea mesoderma contribuisce a testa muscoli, oltre al cuore, rendendo il mesoderma una parte critica della cardio-craniofacciale sviluppo 4. Così, i processi di sviluppo, tra cui l'induzione, la proliferazione e la differenziazione di testa e del cuore progenitori del mesoderma faringea sono sotto inchiesta attivi 5-7.
Fino a poco tempo fa, è rimasto sconosciuto se le cellule progenitrici cardiache subiscono espansione without differenziazione, in parte a causa della mancanza di informazioni sul loro ambiente cellulare. Il nostro recente studio suggerisce che archi branchiali fungono da microambiente per il rinnovo dei progenitori cardiaci e muscolari e possono essere coltivate ex vivo per diverse settimane 8. Questo metodo espianto offre un'opportunità nuova e unica per studiare lo sviluppo dei progenitori cardio-cranio-facciale ex vivo.
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Protocol
Tutti i topi sono stati mantenuti a una Associazione americana per l'accreditamento di laboratorio Animal Care (AAALAC) -accredited stabulario dell'Università Johns Hopkins e alloggiati in conformità con le procedure descritte nella Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio. La cura e l'uso degli animali Comitato Istituzionale (IACUC) ha approvato tutti i protocolli sperimentali.
Preparazione 1. sperimentale
- Coat 12-pozzetti con 10% siero fetale bovino (FBS) in tampone fosfato Solution (PBS) per 60 min.
- Rimuovere la soluzione di rivestimento e aggiungere 200 ml di media siero-free (SFM). Twirl piastra per assicurarsi che un film di supporto copre l'intera superficie.
2. Procedure chirurgiche
- Euthanize topi in gravidanza che utilizzano il protocollo comitato approvato la cura degli animali dell'istituzione seguita da dislocazione cervicale per garantire la completa eutanasia.
- Spray e pulire la regione pancia del mouse con il 70%etanolo. Mantenere rigorose tecniche sterili per evitare la contaminazione.
- Utilizzare pinze e forbici per rendere l'0,5 cm 2 incisione alla regione ombelicale.
- Usare le dita per pizzicare / afferrare la pelle sopra e sotto l'incisione e tirare delicatamente la pelle in direzioni opposte (testa e coda).
- Utilizzare pinze e forbici per fare un'incisione iniziale nella membrana in corrispondenza della zona dell'ombelico. Tagliare delicatamente la membrana a forma di v dall'ombelico alle ovaie su ciascun lato (2 x 1,5 cm 2), rivelando così l'utero.
- Utilizzare pinze per pizzicare la ovidotto che collega l'utero per l'ovaio e forbici per pizzicare il ovidotto sul lato ovaio, liberando così l'utero dall'ovaio.
- Tirare delicatamente l'utero dal ovidotto con le pinze e tagliare l'utero libera dalla regione della vescica con le forbici.
- Estrarre l'utero ulteriormente dalla oviduct con la pinza, e tagliare il oviduct con le forbici sull'altro lato, liberando così l'utero dal mouse.
- Trasferire l'utero di un tubo da 50 ml e aggiungere 20 ml di freddo PBS sterile con Ca 2 + e Mg 2+. PBS deve contenere Ca 2+ e Mg 2+ durante embrione dissezione.
- Agitare delicatamente il tubo per 10 secondi per lavare l'utero di sangue.
- Trasferire l'utero dal tubo con una pinza e posizionarlo in un piatto da 10 ml e aggiungere 5 ml di PBS freddo sulla parte superiore dell'utero.
- Porre la capsula con l'utero allo stereomicroscopio.
Nota: I passaggi 2,13-2,19 richiede uno stereomicroscopio. - Utilizzare due coppie di pinze per aprire delicatamente l'utero e sezionare fuori cavità amniotiche con embrioni dall'utero uno per uno.
- Utilizzare due coppie di pinze per aprire con attenzione il sacco amniotico che circonda l'embrione, pizzicare la sacca con una pinza e delicatamente rimuoverlo dal embrione, utilizzare le altre pinze per tagliare e rilasciare il sacco amniotico dall'embrione. Se un genotipo specifico necessario, tenere sacco amniotico per la genotipizzazione.
- Posizionare l'embrione sul lato e utilizzare pinze per tagliare il 1 ° e 2 ° arco posteriormente al cuore tra l'arco e la sacca faringea (Figura 1A '').
- Capovolgere delicatamente l'embrione verso l'altro lato e utilizzare pinze per tagliare il 1 ° e 2 ° arco posteriormente al cuore tra l'arco e la sacca faringea.
- Utilizzare pinze per tagliare il tratto di efflusso cardiaco che ancora collega il 1 ° e 2 ° faringei archi per l'embrione. Rimuovere gli archi che sono ancora attaccati insieme nella forma di una farfalla (Figura 1B), dall'embrione.
- Utilizzare pinze per stringere e rilasciare il 1 ° archi faringei dal rimanente tratto di efflusso cardiaco e foregut endoderma (Figura 1B '' indicata con la linea tratteggiata e *).
- Utilizzare pinze per pizzicare e rilasciare gli archi 2 ° faringei dal rimanente tratto di efflusso cardiacoe foregut endoderma (Figura 1B '' indicata con la linea tratteggiata e **).
- Trasferire ogni coppia di archi separatamente utilizzando una pinza e inserire entrambe le arcate nel bel mezzo di un designato bene. Piastra 1 ° e 2 ° faringei archi in pozzetti separati. Assicurarsi che gli archi sono in contatto con la pellicola di supporto aggiunti nel passaggio 1.2. È fondamentale che gli archi non sono coperti da medium, in quanto hanno bisogno di entrare in contatto con la superficie del pozzetto per attacco durante questo periodo.
3. Incubazione e Imaging
- Incubare archi placcati in 12-pozzetti in 37 ° C / 5% di CO 2 per 2 ore per archi di allegare alla superficie bene.
- Aggiungere delicatamente 200 ml di 37 ° C SFM lungo il lato del pozzo. Assicurarsi che gli archi rimangono attaccati e incubare O / N.
- Il giorno dopo, controllare visivamente che archi faringei sono attaccati e aggiungere delicatamente 200 ml di 37 ° C SFM lungo il lato dellabene. Se archi restano distaccato e variabile, rimuovere delicatamente i media con una pipetta senza rimuovere archi fino a che solo un film di supporto è a sinistra. Utilizzare puntale per posizionare archi al centro del pozzo e ripetere il punto 3.1.
- Monitorare quotidianamente; aggiungere ~ 100-200 ml di mezzi ogni 2 giorni per sostituire qualsiasi supporto evaporato.
Nota: 24-48 ore dopo la migrazione delle cellule appaiono intorno l'arco e si proliferare e migrare da arco per i prossimi 5-8 giorni. Dopo 36-72 ore la formazione di cardiomiociti battendo può essere osservato dal 2 faringeo arco (Figura 2B). Formazione myotube può osservare dal 1 ° arco faringeo 3-7 giorni dopo il collegamento (Figura 2A).
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Representative Results
Durante lo sviluppo, muscolo e cuore progenitori facciali possono essere rintracciati in quanto proliferano e migrano dal 1 ° e 2 ° arco faringeo, per diventare capo e la muscolatura del cuore, rispettivamente (Figura 1A, A 'e A' '). Coltura archi faringei offre un modo unico per lo studio del cuore e sviluppo muscolare in dettaglio ex vivo. Dopo la dissezione e l'attaccamento di archi faringei, cellule che migrano da archi collegati possono essere osservati entro 24-48 ore della cultura. Entro 3 giorni di formazione della cultura myotube si può osservare dal 1 ° archi faringei e formazione cardiomiociti dagli archi faringei 2 nd (Figura 2a e 2b). Formazione Cardiomyocyte può essere confermata visivamente dalle amministrazioni spontaneamente gruppi di cellule e / o analisi di marcatori specifici cardiomiociti migrazione (ad esempio, cardiaca Troponina T). Myotuessere formazione / facciale muscolare può essere osservato visivamente lungo allungato (fino a 500 micron di lunghezza) cellule e / o analisi di marcatori muscolari specifici (ad esempio, miogenina) spontaneamente contrazioni. Usando il sistema di cre-lox nei topi, mesoderma progenie può essere fatta dai giornalisti fluorescenti su cre-espressione durante ex vivo cultura (Figura 2A 'e 2B'). Allo stesso modo, con questo metodo è possibile studiare il destino della progenie in cui uno specifico gene di interesse viene condizionatamente eliminato o overexpressed, che altrimenti provocherebbe letalità embrionale precoce come precedentemente descritto 8.
Figura 1: embrione Mouse (Mesp1 cre, AI9) 9,5 giorni dopo la fecondazione (E.9.5 >). (A) Lato sinistro di embrione. (PA: faringeo Arco, OT: tratto di efflusso, LV:.. Ventricolo sinistro (A ') Mesp1 linage-traccia; RFP segna + cellule Mesp1 e la loro progenie freccia indica RFP + Mesp1-progenie in PA2 che è in continuità con la OT. (A '') La linea tratteggiata indica dove tagliare PA1 e PA2 posteriormente al cuore (B) Butterfly-come destra e sinistra PA1 e PA2 dopo dissezione dall'embrione FE:.. endoderma Foregut (B. ') segna RFP Mesp1 progenie . in PA1 e PA2 (B '') * e ** insieme con le linee tratteggiate indica dove tagliare e rilasciare PA1 e PA2 dal OT e FE bar Scala:.. 500 micron Cliccate qui per visualizzare una versione più grande di questo figura.
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Figura 2:. Archi faringei coltivate (A) PA1 coltivate (3 giorni di cultura). (A ') RFP segna Mesp1 progenie in PA1. Frecce e * indicano formazione myotube presto. (A '') Sovrapposizione di espressione RFP in PA1. (B) PA2 coltivata (8 giorni di cultura). (B ') segna RFP Mesp1 progenie in PA2. Frecce e ** indicano un'area di cardiomiociti (modificato da Shenje et al. 8) di battere. (B '') Sovrapposizione di espressione RFP in PA2. Scala bar:. 250 micron Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
In questo video, dimostriamo come isolare e cultura prima e seconda faringei archi di 9,5 giorni antichi embrioni di topo. Archi branchiali sono transitori, rigonfiamenti che appaiono sul lato craniolateral di embrioni in via di sviluppo 9, che contengono blocchi cardiaco progenitrici delle cellule di costruzione multi-potenti per rendere il cuore durante l'embriogenesi 10,11 -in secondo arco e progenitori testa muscolari prime arcate 8 segmentati .
La dissezione di archi faringei richiede competenze avanzate di dissezione del mouse embrione. Una volta che gli archi sono stati sezionati con successo utilizzando questo protocollo graduale e trasferito pozzi di pre-rivestite, è fondamentale che si inarca attribuiscono alla zona inferiore. In questo protocollo, abbiamo pozzi cappotto con il 10% FBS seguiti da cultura in SFM con conseguente attaccamento e la crescita del> 75% di archi, ma altri materiali di rivestimento possono essere utilizzati (matrigel, gelatina, fibronectina ecc) così come conta sierosupporti ining.
Gli archi faringei serve come primordi per una moltitudine di strutture durante lo sviluppo. Dopo la formazione iniziale degli archi faringei (8 giorni dopo la fecondazione nei topi), CPC espandono nella PA2 e migrano nel tratto di efflusso cardiaco dove si differenziano in cellule cardiache, e rappresenta pertanto una fonte rinnovabile di CPC che fornisce cellule necessarie per sostenere il cuore la crescita. Come gli archi faringei sono strutture temporali dello sviluppo (E8-11.5) e la migrazione del CPC nel tratto di efflusso avviene da circa E8-E10) questo comporta alcune limitazioni alla tecnica. Per gli studi di CPC, si consiglia di utilizzare archi faringei sezionati tra E9-10, in questa fase ogni PA2 contenere circa 5-800 RFP + cellule (Mesp1 traccia linage).
Con marcatura fluorescente, questa cultura ex vivo ci permette di monitorare progenitori in via di sviluppo e la loro differenziazione in cardiomiociti battendo o miotubi in tempo reale. Inoltre, questo sistema di coltura ex vivo può essere usato per studiare i ruoli di fattori cellula-autonomi e microambientali influenzano la proliferazione cardiaca / progenitore muscolo cellulare, la migrazione e la differenziazione utilizzando linee Cre / loxP esistenti. Come tale, questo sistema dovrebbe facilitare gli studi progenitore-nicchia cardiaci / muscolari, che possono condurre ad una migliore comprensione del cuore formazione / muscolare e malattie.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | |
| PBS + Ca2 + Mg2 | Corning | 21-030-CV | |
| 10 cm Petri plates | Fishersci | FB0875712 | |
| Scissor | |||
| Dissection forceps | |||
| Serum Free Media: | |||
| IMDM | Cellgro | 15-016-CV | |
| Ham’s F12 | Cellgro | 10-080-CV | |
| N2-SUPPLEMENT | Gibco | 17502-048 | |
| B27-retinoic acid | Gibco | 12587-010 | |
| 10% BSA (in PBS) (Invitrogen Cat#. P2489) | Life Sciences | P2489 | |
| 100x Glutamine (Gibco Cat.# 25030-081) | Gibco | 35050-61 | |
| 100x Pen/Strep (Gibco Cat#. 15070-063) | Gibco | 15140-122 |
References
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