Heterotópico cervical trasplante cardiaco en ratones

Resumen

La técnica del manguito acorta y facilita el modelo de trasplante de corazón cervical heterotópico en ratones al evitar anastomosis de sutura técnicamente desafiantes de vasos pequeños. Los detalles técnicos mostrados en este video artículo deberían permitir a los investigadores establecer este modelo en sus laboratorios.

Resumen

El trasplante heterotópico de corazón cervical en ratones es una herramienta valiosa en la investigación cardiovascular y de trasplantes. La técnica del manguito simplifica en gran medida este modelo al evitar las difíciles anastomosis de sutura de pequeños vasos, reduciendo así el tiempo de isquemia caliente. En comparación con la implantación de injerto abdominal, el modelo cervical es menos invasivo y el injerto implantado es fácilmente accesible para exámenes de seguimiento posteriores. Las anastomosis se realizan tirando de la aorta ascendente del injerto sobre el manguito con la arteria carótida común del receptor y tirando de la arteria pulmonar principal sobre el manguito con la vena yugular externa. La selección del tamaño adecuado del manguito y la movilización completa de los vasos son importantes para el éxito de la revascularización. La lesión por isquemia-reperfusión (I/R) puede minimizarse mediante la perfusión del injerto con una solución cardiopléjica y mediante hipotermia. En este artículo, proporcionamos detalles técnicos para una técnica de manguito simplificada y mejorada, que debería permitir a los cirujanos con habilidades microquirúrgicas básicas realizar el procedimiento con una alta tasa de éxito.

Introducción

El modelo de trasplante de corazón se utiliza con frecuencia para investigar I / R-lesión, rechazo de aloinjerto, vasculopatía post-trasplante y la eficiencia de los agentes inmunomoduladores. Los modelos de ratón se combinan muchas ventajas como el inmunológico conocido y antecedentes genéticos, la disponibilidad de muchas cepas puras y transgénicos y los costos experimentales relativamente bajos.

En 1973, una técnica de trasplante de corazón abdominal en ratones fue descrita por primera vez por Corry et al ^1. En este modelo injertos se revascularizados antes de fin de a lado anastomosis de la aorta ascendente a la aorta abdominal del receptor y de la principal arteria pulmonar a la vena cava inferior. En 1991, una técnica de sutura para el trasplante de corazón cervical en ratones fue descrito por Chen et al ^2. En este modelo una perfusión coronaria retrógrada se establece por la anastomosis de la arteria carótida del destinatario a la aorta ascendente del grpopa. Los drenajes de sangre venosa a través del seno coronario en la aurícula derecha, el ventrículo derecho y se expulsa a través de la arteria pulmonar en el receptor vena yugular externa (Figura 1). En comparación con la implantación del injerto abdominal el modelo de cuello uterino es menos invasiva y la localización superficial del injerto permite un acceso muy fácil para los exámenes de seguimiento adicionales (por ejemplo, la palpación, la ecocardiografía, la microscopía de fluorescencia intravital) ^3,4.

A pesar de las mejoras técnicas ^5,6, un uso más generalizado de este modelo ha sido limitado debido a dificultades técnicas para realizar las anastomosis suturadas de vasos pequeños con una alta incidencia de fugas de anastomosis y la trombosis. En 1991, Matsuura et al. introdujo la técnica de manguito en la que la pared del vaso es evertido sobre un cilindro sintético, que facilita en gran medida el modelo de trasplante de corazón ⁷ cervical. La técnica fue further adoptado para varios modelos experimentales de trasplante renal incluyendo ^{8, 9} de páncreas, la integridad física ^{10, 11,12} hepática, pulmonar ^13,14 y el trasplante vascular ^15. En comparación con la técnica de sutura el tiempo requerido para las anastomosis y, por lo tanto, el tiempo de isquemia caliente es más corta y hay complicaciones vasculares significativamente menos usando la técnica del manguito ^16. Además, permite a los cirujanos con poca formación en microcirugía para realizar la operación con una alta tasa de éxito. Una desventaja de la técnica del manguito es el requisito previo de la ligadura de la arteria carótida común, que puede alterar la perfusión cerebral.

En este trabajo de vídeo presentamos una técnica de manguito mejorado y simplificado para el trasplante de corazón cervical en ratones.

Protocolo

Todos los experimentos fueron aprobados por el alemán Corazón Centro de Múnich y el Gobierno de Baviera, Alemania (Gz. 55.2-1-54-2532.3-17-13). Los animales fueron alojados en una instalación específica libre de patógenos y recibieron atención humana en el cumplimiento de los "Principios de Laboratorio Animal Care" formuladas por la Sociedad Nacional para la Investigación Médica y de la "Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio" proporcionada por la Academia Nacional de Ciencias y publicado por los Institutos Nacionales de Salud (NIH Publication no. 86-23, revisado 1985).
NOTA: Un conjunto completo de instrumentos de microcirugía estériles, incluyendo dos pinzas curvas y dilatadores de los vasos, es necesario para el procedimiento (Figura 2a). La profilaxis antibiótica perioperatoria no es habitualmente necesaria, pero pueden estar indicados en animales inmunocomprometidos. Los animales fueron sacrificados por inhalación de isoflurano usando terminal.

Donantes de Preparación y la cosecha del injerto

1. Anestesiar al animal mediante intraperitoneal (ip) de inyección de midazolam (5,0 mg / kg), medetomidina (0,5 mg / kg) y fentanilo (0,05 mg / kg de peso corporal). Coloque el ratón en una posición supina en el campo operatorio y confirmar la tolerancia quirúrgica por el reflejo de retirada pedal.
2. Desinfectar la piel tres veces con clorhexidina y realizar una incisión abdominal en la línea media. Retraer los intestinos con una gasa húmeda a la izquierda para exponer la vena cava inferior.
3. Inyectar 50 UI de heparina diluida en 0,4 ml de solución salina a través de la vena cava inferior para la anticoagulación. Incisión en el vaso 1 min después de heparinización.
4. Abra el diafragma y realizar una toracotomía bilateral para exponer el corazón. La pared torácica anterior se refleja en sentido superior y se mantiene en su lugar con una abrazadera.
5. Retire el timo y sin rodeos diseccionar el tejido conectivo entre la aorta y el tronco pulmonar. Incisión en la vena cava superior derecha.
6. Perforar la aorta ascendente movilizado a nivel de latronco braquiocefálico con una aguja de 30 G montado en una jeringa de 5 ml y lentamente perfundir el corazón retrogradually sin una presión excesiva con 3 ml de 4 ° C solución cardiopléjica fría. Evitar la entrada de aire en la circulación coronaria. Caída de solución salina enfriada con hielo en el injerto para mejorar aún más el paro cardiaco.
7. Seccionar la aorta proximal al origen del tronco braquiocefálico.
8. Ligar la vena inferior y ambas cavas superior cerca del corazón con 8-0 seda y seccionar los distalmente a las ligaduras.
9. Diseccionar libre el tronco pulmonar lo más distante posible. Ligar las arterias pulmonares cerca de la bifurcación con 8-0 seda y seccionar ellos distal.
10. Ligar las venas pulmonares todos juntos con una sola ligadura de 8-0 seda y seccionar ellos.
11. Quite el corazón del donante y almacenarlo en la solución cardiopléjica helada hasta la implantación.

2. Destinatario Preparación

1. Prepararlos puños para anastomosis cortando el tubo de poliimida con un bisturí No. 11 o una tijera bajo el microscopio. El manguito se compone de un cuerpo cilíndrico y una extensión _^(1/3 de la circunferencia) para la colocación de la pinza vascular, cada uno de una longitud de 1 mm (figura 2b).
2. Anestesiar al animal y de confirmar la tolerancia quirúrgica como se describe anteriormente. Inyectar 0,25 ml de solución salina caliente por vía subcutánea (sc) para la reposición de líquidos.
3. Quite el pelo de la región cervical derecha usando una máquina de afeitar eléctrica y coloque el animal en posición supina sobre una almohadilla caliente. Asegure las piernas con hebras de cinta evitando estiramiento excesivo de las extremidades anteriores, ya que puede comprometer la respiración. Cubra los ojos utilizando pomada oftálmica para evitar la sequedad. Desinfectar el sitio quirúrgico tres veces con clorhexidina.
4. Hacer una incisión cutánea transversal desde el ángulo mandibular derecho a la muesca yugular.
5. Sin rodeos movilizar a la extvena yugular ernal. Cauterizar ramas laterales con unas pinzas bipolares y seccionar ellos.
6. Divida la vena yugular externa entre ligaduras en el nivel de la confluencia con la vena de la glándula submandibular.
7. Tire de la vena yugular externa a través del manguito y ocluir el vaso proximal mediante la colocación de una pinza vascular en la extensión del manguito. Retire la abrazadera y el riego de la luz del vaso con solución salina heparinizada 01:10.
8. Evert la pared del vaso sobre el manguito y fijarlo con una circunferencia 8-0 ligadura de seda preestablecido.
9. Retire la parte superficial del músculo esternocleidomastoideo.
10. Movilizar a la arteria carótida común derecha y seccionar el buque entre ligaduras por debajo de la bifurcación de la carótida.
11. Tire de la arteria carótida a través del manguito y ocluir el vaso proximal mediante la colocación de una pinza Yasargil en la extensión del manguito. Retire la abrazadera y el riego de la luz del vaso con solución salina heparinizada 01:10.
12. Suavemente dilate la luz arterial con un dilatador buque, Evert la pared del vaso sobre el manguito y arreglarlo con un circunferencial 8-0 ligadura de seda preestablecido.
13. Para ganar espacio suficiente para la implantación del injerto, quitar el lóbulo derecho de la glándula submandibular.
14. Mantenga el campo quirúrgico húmedo hasta la implantación.

3. Implantación del injerto

1. Coloque el injerto en la región cervical receptor boca abajo con la aorta orientado medialmente y la arteria pulmonar lateralmente.
2. Tire de la aorta del injerto sobre el brazalete con la arteria carótida y asegurar la anastomosis con una ligadura circunferencial 8-0 seda.
3. Incisión en el tronco pulmonar en su cara anterior y tire de ella sobre el brazalete con la vena yugular externa. Una vez más asegurar la anastomosis con una ligadura circunferencial de 8-0 seda.
4. Retire la abrazadera en la vena yugular externa, siguiendo por el desamarre de la arteria carótida. Los corazones se llena inmediatamente con sangre. Para mejorar reperfusion caer 37 ° C una solución salina caliente en el injerto. Normalmente, el corazón se desarrolla el ritmo sinusal en un minuto. Retire la extensión del manguito en el sitio venosa.
5. Asegurar la posición correcta del injerto, anastomosis deben estar libre de tensiones y buques sin torsión. No vasos cauterizados de la piel ya que esto puede afectar la cicatrización de heridas. El sangrado generalmente se detiene espontáneamente. Cierre la piel con una sutura continua única de 8-0.

4. Cuidado posoperatorio

1. Inyectar 0,25 ml cálida sc solución salina para la reposición de líquidos.
2. Para antagonizar narcóticos inyectan naloxona (1,2 mg / kg), flumazenil (0,5 mg / kg) y atipamezol (2,5 mg / kg de peso corporal) sc Izquierda del animal en la almohadilla caliente hasta que se haya recuperado el conocimiento suficiente para mantener decúbito esternal. Observar al animal durante al menos una hora adicional para registrar cualquier comportamiento anormal. No devuelva un animal que se ha sometido a una cirugía para la compañía de otros animales hasta que esté completamente Recoverojo.
3. Proporcionar analgesia preventiva con buprenorfina (0,05 mg / kg sc tres veces por día) o una analgesia alternativa de acuerdo con un protocolo institucional local para una duración mínima de 72 horas después del procedimiento.
4. El cirujano y un veterinario deben ver a los animales con regularidad. En caso de pérdida de peso> 15%, la apatía, la hinchazón o animales de infección lado quirúrgicos son sacrificados mediante inhalación de isoflurano terminal.

Resultados

Nuestro equipo podría realizar con éxito la técnica descrita después de aproximadamente 20 cirugías de formación. La parte más difícil es eversión la pared vascular de la arteria carótida sobre el brazalete, ya que fácilmente voltea hacia atrás y múltiples intentos puede conducir a la rotura de la pared. Después del período de entrenamiento, el tiempo quirúrgico total media fue de 60 ± 8 min. Se requieren alrededor de 20 minutos para la cosecha de donantes, 25 min para la preparación de los vasos cervicales y 15 minutos...

Discusión

Hemos completado más de 200 trasplantes cardíacos con una tasa de éxito superior al 90% en varios parámetros experimentales. Con la técnica descrita aquí, el procedimiento completo se puede hacer dentro de los 60 min por un cirujano experimentado. Mediante la preparación de los vasos cervicales antes de la obtención de órganos, el tiempo total de isquemia del injerto puede ser limitado a 20 min. Tiempo para la implantación (tiempo de isquemia caliente) es significativamente más corto usando la técnica del manguito en co...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Pinza JFC-7.2	S& T	P-00036	Punta curvada 0,20 mm
Dilatador de recipientes D-5a	S& T	S-00124
Tijera Adventita	S& T	S-00102
Pinza vascular B-1V	S& T	S-00396
Yasargil Clip	Peter Lazic	65.097	3,5 mm de longitud
Pinza bipolar	Micromed	148-100-011	punta 0,25 mm
Tubos de poliimida	River Tech Medical		19-24 galga
8.0 ligaduras de seda Catgut
Custodiol solución HTK	Essential Pharmaceuticals