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Artículo de método

Medición de daños y reparación del ADN en esplenocitos de ratón Después crónica

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DOI:

10.3791/52912

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3 de julio de 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Radiological Protection Research and Instrumentation, Canadian Nuclear Laboratories

En este artículo

Resumen

Se presenta un protocolo para evaluar los cambios en los niveles de daño en el ADN y la capacidad de reparación del ADN que pueden ser inducidos por la irradiación crónica in vivo de baja dosis en linfocitos de bazo de ratón, mediante la medición de la histona fosforilada H2AX, un marcador de roturas de doble cadena de ADN, utilizando citometría de flujo.

Resumen

Exposición a la radiación en dosis bajas puede producir una variedad de efectos biológicos que son diferentes en cantidad y calidad de los efectos producidos por dosis altas de radiación. Abordar las cuestiones relacionadas con la seguridad ambiental, ocupacional y de salud pública de una manera adecuada y científicamente justificada en gran medida se basa en la capacidad de medir con precisión los efectos biológicos de los contaminantes de dosis bajas, tales como sustancias químicas y radiación ionizante. Daños en el ADN y la reparación son los más importantes indicadores tempranos de riesgos para la salud debido a sus posibles consecuencias a largo plazo, tales como el cáncer. Aquí se describe un protocolo para estudiar el efecto de la crónica exposición in vivo a dosis bajas de γ- y β-radiación en daños y reparación del ADN en las células de bazo de ratón. Utilizando un marcador comúnmente aceptada de ADN de doble filamento se rompe, la histona H2AX fosforilada llamado γH2AX, se demuestra cómo se puede utilizar para evaluar no sólo los niveles de daño en el ADN, pero también cambiaen la capacidad de reparación del ADN potencialmente producido por una baja dosis de exposición in vivo. La citometría de flujo permite la medición rápida, precisa y fiable de immunofluorescently marcado γH2AX en un gran número de muestras. Reparar el ADN de doble filamento romper puede evaluarse mediante la exposición de esplenocitos extraídos a una dosis de 2 Gy reto de producir un número suficiente de ADN se rompe para desencadenar la reparación y midiendo la inducida (1 hora después de la irradiación) y daño del ADN residual (24 hrs después de la irradiación). Daño en el ADN residual sería indicativo de reparación incompleta y el riesgo de la inestabilidad genómica a largo plazo y el cáncer. Combinado con otros ensayos y puntos finales que pueden ser fácilmente medidos en tales estudios in vivo (por ejemplo, las aberraciones cromosómicas, frecuencias de micronúcleos en reticulocitos de la médula ósea, la expresión de genes, etc.), este enfoque permite una evaluación precisa y contextual de los efectos biológicos de los factores de estrés de bajo nivel.

Introducción

Controversia significativa sobre los posibles efectos nocivos de cualquiera de las dosis bajas o muy bajas de radiación y el temor del público de la radiación, impulsado por las imágenes de los bombardeos atómicos de Hiroshima y Nagasaki y de accidentes en plantas nucleares raras ionizante (exacerbada por los medios de comunicación), ha dado lugar a muy estricta regulación de la protección radiológica y normas que potencialmente no son científicamente justificada. En las tres últimas décadas, numerosos informes han documentado tanto la falta de perjudicial y la presencia de efectos biológicos potencialmente beneficiosos inducidos por la radiación de baja dosis 1-4. El factor de riesgo para la salud de radiación mayor es la probabilidad de cáncer, que se calcula sobre la base de los estudios epidemiológicos de sobrevivientes de las bombas atómicas que reciben dosis altas o medianas de la radiación. Linear extrapolación de estos datos (los llamados lineal-no-umbral o modelo LNT) se utiliza para estimar los riesgos de cáncer a dosis bajas. Sin embargo, este enfoque no ha recibido la aceptación científica mundialy está fuertemente debatido 5.

Es evidente que se necesitan más estudios para aclarar esta cuestión y, posiblemente, mejorar las normas de protección radiológica. Tales estudios deben incluir tratamientos crónicos (mejor aproximación de las exposiciones ambientales y ocupacionales), en modelos animales in vivo (en el mejor de los efectos para la salud humana) y la extrapolación de estos puntos finales como los tipos de daño en el ADN, la reparación del ADN y mutagénesis. Se sabe que el ADN es el principal objetivo de dañar efectos de la radiación y incompletos o mis-reparación puede conducir a mutagénesis y cáncer de desarrollo 6.

Roturas de doble hebra de ADN (OSD) son uno de los tipos más perjudiciales de las lesiones del ADN y pueden conducir a la muerte celular y tumorigénesis 7. Es, por lo tanto, importante para ser capaz de medir de forma fiable y precisa el nivel de DSB después de la exposición a bajas dosis de radiación y / o otros factores de estrés, tales como contaminantes químicos. Uno de los marcadores más sensibles y específicosde DSB de ADN es la histona H2AX fosforilada, llamado γH2AX 8, sin embargo, otros marcadores y métodos Se han sugerido 9,10. Se estima que miles de moléculas de H2AX, en las proximidades de un OSD inducida, están implicados en la formación de γH2AX que permite la detección de individuo OSD, mediante el etiquetado de inmunofluorescencia con un anticuerpo y microscopía de fluorescencia anti-γH2AX 11. La respuesta es muy rápida, alcanzando su máximo entre 30 y 60 min. Existen pruebas de que γH2AX facilita la reparación de DSB de ADN mediante la atracción de otros factores de reparación a los sitios de las pausas y al modificar la estructura de la cromatina para anclar los extremos de ADN rotos y facilitar el acceso de otras proteínas de reparación (revisado en 12). Sobre la terminación de la reparación de DSB de ADN, se γH2AX De fosforilada y / o se somete a la degradación, y las moléculas recién sintetizadas H2AX reemplazar γH2AX en las zonas afectadas de la cromatina 10. La formación y la pérdida de γH2AX Vigilancia puede,por lo tanto, proporcionar una estimación precisa de la cinética de reparación del ADN OSD. Este enfoque ha sido utilizado para estudiar la reparación de DSB en diversas líneas celulares tumorales humanas irradiadas con altas dosis de radiación y su tasa de OSD y los niveles residuales se han demostrado que se correlaciona con la radiosensibilidad 13-15.

Hemos modificado este enfoque experimental y lo aplicamos a un estudio en ratones in vivo para examinar los efectos de las dosis bajas de γ- crónica y β-irradiación en los niveles de ADN del OSD y reparación (Figura 1). En primer lugar, demostramos un método para realizar una exposición crónica a largo plazo de ratones para β-radiación sea emitida por tritio (hidrógeno-3) en forma de agua tritiada (HTO) o como tritio orgánico (OBT) disuelto en el agua potable . Se espera que las dos formas de acumular y / o distribuir de manera diferente en el cuerpo y por lo tanto, producir diferentes efectos biológicos. Ambas formas son posibles peligros en la industria nuclear. Este tratamientoes paralelo por la exposición crónica a la radiación γ-a una tasa de dosis equivalente para permitir una correcta comparación de los dos tipos de radiación, que es crucial para la evaluación de su eficacia biológica relativa. Beta-radiación se compone de electrones, lo que es muy diferente de la γ-radiación, fotones de alta energía. Debido a esta diferencia, Β-radiación representa peligro para la salud principalmente interna y puede producir diferentes efectos biológicos en comparación con γ-radiación. Esta complicación se tradujo en controversias significativas sobre la regulación de la exposición a β-radiación emitida por OTA. Por lo tanto, los niveles de regulación de HTO en el agua potable para el público varían de 100 Bq / L en Europa a 75.000 Bq / L en Australia. Es, por lo tanto, importante para comparar los efectos biológicos de HTO a dosis equivalentes de γ-radiación. En segundo lugar, la tasa de DSB de ADN se mide en esplenocitos aislados a la finalización de las exposiciones crónicas usando immunofluorescently marcado γH2AX detectared por citometría de flujo. Esto permite la evaluación de la extensión del daño de ADN infligido por las exposiciones in vivo. Sin embargo, es razonable esperar que tales exposiciones de bajo nivel pueden no producir ningún tasas detectables de ADN OSD; en cambio, / puede esperarse algunos cambios ocultos respuestas que afectaría a la capacidad de las células para reparar el daño del ADN. Estos cambios, si se encuentra, pueden ser o bien estimulador (produciendo un efecto beneficioso) o inhibidor (produciendo un efecto perjudicial). El protocolo propuesto permite revelar tales cambios desafiando a los esplenocitos extraídos con una alta dosis de radiación que produce una cantidad significativa de daño (por ejemplo, 2 Gy producir aproximadamente 50 DSB de ADN por célula o un 3 -. Incremento de 5 veces en nivel total γH2AX) . Posteriormente, la formación y la pérdida de γH2AX, lo que refleja el inicio y la finalización de la reparación de DSB, se controla mediante citometría de flujo. De esta manera, no sólo basal y los niveles inducidos por el tratamiento de DSB de ADN pueden medirse, perotambién su efecto potencial sobre la capacidad de las células para responder y daño del ADN inducido por la reparación de los niveles estresantes mucho más altas.

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Protocolo

Todos los procedimientos de manipulación y tratamiento de ratones deben adherirse a las normas establecidas por los programas de la legislatura y / o cuidado de los animales y aprobados por un comité local de cuidado de animales. Todos los métodos descritos en este protocolo se realizaron de acuerdo con las directrices del Consejo Canadiense de los Animales, con la aprobación del comité local de cuidado de animales.

ATENCIÓN: Todos los trabajos con radiactividad (incluyendo, pero no limitado a la manipulación de tritio, γ-irradiación externa, la manipulación de tejidos animales, residuos radiactivos de cama) deben adherirse a las normas establecidas por las autoridades de la legislatura y / o de protección radiológica y se realizará por personal autorizado personal de un laboratorio y / o instalación certificada.

1. Trabajar Animal

  1. Agrupación Animal
    1. Si los ratones están llegando de una organización externa, aclimatar animales durante al menos 10 días en el animalario. Si el estudio incluye múltiples grupos de tratamiento, asegúrese de que el proveedor de los animales puede enviar all animales como un solo lote.
    2. Asignar aleatoriamente los ratones a grupos de tratamiento de 10 ratones por grupo. Si el uso de ratones macho de la cepa C57BL / 6, que el proveedor de los animales pre-organizar aleatorización de muy corta edad C57BL / 6 machos en sus instalaciones para mitigar problemas de agresión.
  2. La exposición crónica de ratones de β-radiación interna
    1. Preparar las concentraciones de trabajo de tritio (10 kBq / L y 1 MBq / L) en el agua potable de ratón mediante la dilución de la población original de HTO y OBT (una mezcla de prolina tritiada, alanina y aminoácidos glicina) soluciones.
    2. Validar las concentraciones finales de tritio en el agua potable mediante la medición de la radiactividad utilizando un contador de centelleo líquido. Ajuste concentraciones, si es necesario.
    3. Tratar a los animales durante un mes mediante el acceso ad libitum al agua tritio. Si el agua de tratamiento se baja durante el período de dos semanas, añada más agua. De lo contrario, cambie las botellas a las dos semanas.
    4. Farsa irradiado Tratar de controlratones idénticamente. Manténgalos en una habitación "limpia" separada o en un estante separado "limpio" bajo la presión de aire positiva para evitar tritio contaminación cruzada desde el aire.
  3. La exposición crónica de ratones a la radiación externa γ-
    Nota: facilidad de γ-irradiación / equipo variará dependiendo de la ubicación.
  4. El uso de métodos disponibles de dosimetría, determinar las distancias de una fuente γ-radiación que tienen campos de radiación que producen las dosis deseadas. Garantizar la homogeneidad de los campos de radiación dentro de las áreas que cubren las jaulas de los animales.
    Nota: 1,7 μGy / h es equivalente a una tasa de dosis producida por 1 MBq / L tritio en el cuerpo.
  5. Exponer los ratones mediante la colocación de jaulas de ratón en las distancias determinadas en el paso 1.3.1 para un mes. Minimizar interrupción diaria de la γ-irradiación a 30 min. Utilice dosímetros de termoluminiscencia para medir dosis total absorbida.

2. Sacrificio y Muestreo

  1. Preparar instrumentos quirúrgicos estériles, 60 mm placas de Petri con coladores insertados celulares 70 micras, 15 ml y tubos de 1,5 ml, medio RPMI suplementado con 5% de suero fetal bovino (FBS) y el lugar todo dentro de una cabina de seguridad biológica. Asegurar la esterilidad de la obra es crucial.
  2. Dispense 5 ml de medio RPMI en cada 60 mm placa de Petri.
  3. Sacrificar los ratones utilizando un método aprobado por el comité local de cuidado de los animales. Dislocación cervical es una buena opción para el trabajo de esplenocitos se describe en este protocolo. Sin embargo, si se requieren muestras de sangre para otros ensayos (por ejemplo, para el mFISH, el bloque de micronúcleos citocalasina u otros ensayos genetoxicity común), utilice la punción intracardiaca después de la anestesia con isoflurano.
  4. Colocar el animal en decúbito dorsal, con la cabeza apuntando lejos de usted. Rocíe el ratón hacia abajo con etanol al 70%. Con unas pinzas, agarre la piel en sentido anterior a la abertura de la uretra y hacer una pequeña incisión con tijeras en la región perineal.
    1. De esta incisión, corte a lo largo de la línea media ventral a la cavidad torácica, teniendo cuidado de cortar solamente la piel y no la pared muscular debajo. Diseccionar la piel lejos de la línea media.
    2. Agarre la pared abdominal con fórceps y cortar a lo largo del eje medio de la pared muscular de abrir la cavidad abdominal.
  5. Extirpar el bazo ligeramente agarre con pinzas estériles y suavemente tirando de él y al mismo tiempo cortando el tejido conectivo con unas tijeras.
  6. Corte un pequeño trozo del bazo (aproximadamente 1/10 del bazo) y colocar en un tubo de 1,5 ml. Snap congelar en nitrógeno líquido para su posterior almacenamiento a -80 ° C para los ensayos suplementarios.
  7. Coloque el resto del bazo en un filtro de células dentro de una placa de Petri de 60 mm con 5 ml de medio RPMI pre-dispensado.
  8. Continúe con el siguiente ratón.
    Nota: Extraído bazos se pueden mantener en placas de 60 mm con los medios de comunicación (para un máximo de 2 horas), mientras que el resto de los ratones son Sacrificed. Dependiendo del número de personas que participan, entre 5 y 15 ratones se pueden procesar en un día.

3. Preparación de cultivos de esplenocitos

  1. Homogeneizar el bazo mediante el picado dentro de un filtro de células con unas pinzas estériles con un extremo curvo.
  2. Retire el filtro de células y recoger la suspensión de células se filtra desde el plato de 60 mm en un tubo de 15 ml.
  3. Enjuague el filtro de células con 5 ml de medio para recoger el resto de las células.
  4. Tubos de centrifugar a 300 xg durante 5 min a TA.
  5. Decantar el sobrenadante y volver a suspender el sedimento en 10 ml de RPMI.
  6. Tubos de centrifugar a 300 xg durante 5 min a TA.
  7. Decantar el sobrenadante y volver a suspender el sedimento en 5 ml de RPMI.
  8. Transferencia de 4 ml de la suspensión celular en un matraz de cultivo de 25 ml de tejido y trasladarlo a un incubador de CO2 (37 ° C, 5% de CO 2, 80% de humedad)

4. Desafiando irradiación y Fijación

  1. Transferir elrestante 1 ml de suspensión celular desde el paso 3.8 en un tubo de 1,5 ml en hielo y centrifugar a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Daño en el ADN medido en esta muestra representará tanto daño inducido por el tratamiento y t = 0 de datos punto para la construcción de una curva de reparación del ADN.
  2. Aspirar con cuidado el sobrenadante utilizando una bomba de vacío. Suavemente volver a suspender el sedimento en 1 ml de tampón TBS (20 mM Tris pH 7,4, NaCl 150 mM, KCl 2,7 mM).
  3. Tubos centrífuga a 300 g durante 5 min a 4 ° C. Aspirar con cuidado el sobrenadante utilizando una bomba de vacío. Suavemente volver a suspender el sedimento en 300 l de TBS.
  4. Mientras se mezcla en un vórtice a baja velocidad, añadir 700 l de -20 ° C 100% de etanol. Cierre la tapa e invierta varias veces para mezclar.
  5. Almacenar las muestras a -20 ° C. Los esplenocitos fijos en etanol se pueden almacenar a -20 ° C durante al menos 12 meses sin ninguna pérdida notable en la señal de γH2AX.
  6. Irradiar los cultivos de esplenocitos del paso 3.8 con un desafiante γ-rad iation dosis de 2 Gy a una tasa de dosis ≥ 200 mGy / min utilizando dispositivo de irradiación disponible.
    Nota: El propósito de esta irradiación es inducir ADN OSD para desafiar la maquinaria de reparación. Los rayos X también se pueden utilizar para este propósito.
  7. Inmediatamente devolver las culturas para una incubadora de CO 2.
  8. 1 hora después de la desafiante 2 Gy de irradiación, retire las culturas de la incubadora a una cabina de seguridad biológica. Para recoger una alícuota de la muestra representativa, suavemente volver a suspender las células utilizando una pipeta y la transferencia de 1 ml de la suspensión celular a un tubo de 1,5 ml en hielo. Devolver los cultivos celulares a una incubadora de CO 2.
  9. Tubos centrífuga a 300 g durante 5 min a 4 ° C. Aspirar con cuidado el sobrenadante utilizando una bomba de vacío. Suavemente volver a suspender el sedimento en 1 ml de TBS.
  10. Repita los pasos 4.3 a 4.5.
  11. 24 horas después de la desafiante 2 Gy γ-irradiación, cosecha y fijar en = 24 hrs muestra como se describe en el paso 4.8 a 4.10.
tle "> 5. El etiquetado de inmunofluorescencia con anticuerpos anti-γH2AX

Nota: Por lo general, 15 a 30 muestras por día pueden immunofluorescently etiquetados y se analizaron por citometría de flujo en una sola corrida. Para garantizar una comparación exacta entre los grupos de tratamiento, incluyen la muestra (s) de cada grupo. Ver también Referencia 16 para más detalles.

  1. Preparar un conjunto marcado de tubos para el número de muestras a procesar y el lugar en el hielo. Utilice 12 x 75 mm tubos de vidrio debutantes. La esterilidad no se requiere para este trabajo. Incluir una muestra de control histórica adicional para el marcaje con anticuerpo secundario solamente ("segunda Ab única"). Utilice esta muestra histórica de control en todos los citometría de flujo funcionar dentro de un estudio.
  2. Añadir 0,5 ml de TBS helado a cada tubo.
  3. Eliminar esplenocitos fijos de -20 ° C, vórtice durante 5 s y transferir una alícuota de 0,5 ml a tubos preparados con TBS. Coloque el resto de las muestras de vuelta a -20 ° C y almacenamientomantener como muestra de respaldo.
  4. Esplenocitos centrifugar a 300 g durante 5 min a 4 ° C. Decantar suavemente el sobrenadante y resuspender el sedimento en 1 ml de hielo-frío TBS que contiene 1% de FBS
  5. Células centrifugar a 300 g durante 5 min a 4 ° C. Decantar el sobrenadante y volver a suspender suavemente el sedimento en 1 ml de tampón TST (0,05% de Triton X-100, 2% de FBS en TBS). Incubar durante 20 min en hielo.
  6. Células centrifugar a 300 g durante 5 min a 4 ° C. Decantar el sobrenadante y volver a suspender suavemente el sedimento en 200 l de anticuerpo primario anti-γH2AX diluidos 1: 150 en tampón TST. Utilice 200 l de TST para el "segundo Ab única" muestra de control.
  7. Tubos de posición en un agitador que gira a un ángulo de 45 - 60 ° y agitar durante 1,5 horas a 300 xg a temperatura ambiente.
  8. Mientras que los tubos están incubando, preparar un volumen suficiente (200 l / muestra) de la cabra anti-ratón anticuerpo secundario conjugado con Alexa-488 en una dilución 1: 200 en tampón TST.
    Nota: Todos los trabajos que Alexa-488anticuerpo conjugado (pasos 5.10 a 5.16 más abajo) debe hacerse bajo condiciones de luz tenue y muestras etiquetadas debe protegerse de la luz, envolviendo los tubos en papel de aluminio.
  9. Una vez completada la incubación 1,5 hrs, añadir 1 ml de TBS frío con hielo que contenía FBS al 2% a cada tubo y centrifugar a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Decantar el sobrenadante y volver a suspender suavemente el sedimento en 1 ml de TBS que contenía 2% de FBS.
  10. Centrifugar a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Decantar suavemente el sobrenadante y resuspender el sedimento en 200 l de la solución de anticuerpo secundario desde el paso 5.8.
  11. Incubar las muestras en una plataforma de agitación durante 1 hora como en el paso 5.7.
  12. Añadir 1 ml de TBS frío con hielo que contenía 1% de FBS.
  13. Centrifugar a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Decantar suavemente el sobrenadante y resuspender el sedimento en 1 ml de TBS enfriado con hielo.
  14. Centrifugar a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Decantar el sobrenadante y volver a suspender suavemente el sedimento en 0,5 ml de TBS que contenía 50 mg / mlyoduro de propidio.
  15. Incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente protegido de la luz.
  16. Analizar las muestras en un citómetro de flujo a través de protocolos específicos de los instrumentos 16. Leer al menos 10.000 células por muestra.

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Resultados

La Figura 2 muestra ejemplos de gráficos de citometría de flujo esperados para esplenocitos preparados usando el método descrito aquí. Las células se gated primero basado en el gráfico de dispersión (Figura 2A y 2D; volumen electrónico es equivalente a dispersión frontal). Histogramas de yodo FL3 / propidio (Figura 2B y 2E) confirman la distribución del ciclo celular normal. Señal γ...

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Discusión

El protocolo presentado en este documento es útil para la realización del ratón a gran escala en los estudios in vivo que examinan los efectos genotóxicos de los bajos niveles de diversos agentes químicos y físicos, incluyendo la radiación ionizante. Nuestra instalación de animales libres de patógenos específicos único equipado con un irradiador GammaBeam 150 y un pasillo largo irradiación 30 metros permite la realización de estudios de toda la vida que implican radiaciones bajas o muy bajas tasas de d...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no se conocen intereses financieros en competencia.

Agradecimientos

Los autores desean agradecer la contribución de nuestros colegas Sandrine Roch-Lefevre y Eric Gregoire del Instituto de Radioprotección y Seguridad Nuclear (París, Francia). Este trabajo fue apoyado por el programa de Ciencia y Tecnología del Gobierno de Canadá en los Laboratorios Nucleares Canadienses (Chalk River, Ontario, Canadá), el Grupo de Propietarios de CANDU (Toronto, Ontario, Canadá), la Comisión Canadiense de Seguridad Nuclear y por el Instituto de Protección Radioeléctrica y Seguridad Nuclear (París, Francia).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
HTO: agua tritiada, [3H]obtenida localmente de un reactor nuclear actividad de stock 3.7 GBq/mL;  puede ser sustituido por HTO de Perkin Elmer
OBT: Alanina, L-[3-3H]: tritio unido orgánicamente (OBT)Perkin ElmerNET348005MC1 mCi/ml (185 MBq)
OBT: Glicina, [2-3H]: tritio unido orgánicamentePerkin ElmerNET004005MC1 mCi/ml (185 MBq)
OBT: Prolina, L-[2,3-3H]: tritio unido orgánicamente (OBT)Perkin ElmerNET323005MC1 mCi/ml (185 MBq)
agua tritiada, [3H] (HTO)Perkin ElmerNET001B005MCsustituto de HTO de origen local   
El irradiador GammaBeam 150de Atomic Energy of Canada Limited, fabricado localmente, puede sustituirse por otra fuente de radiación g de actividad suficientemente baja.
Tween-20Sigma AldrichP1379-500ML
RPMIFisher ScientificSH3025501Hyclone RPMI 1640 con L-Glutamina y HEPES 500mL
suero fetal bovinoSigma AldrichF1051-100ML
anticuerpo anti-gH2AX, clon JBW301Millipore05-636
Alexa fluor-488 cabra anti-ratón anticuerpoTechnologies (anteriormente Invitrogen)A21121
yodo propidioSigma AldrichP4864-10ML1 mg/ml
etanolAlcoholes comercialesP006-EAANBotellas de 500 ml Etanol absoluto
Tubos de 1,5 mlTubos de microcentrífugaFisher Scientific2682550
tubos de 15 mlTubos de centrífuga de polipropileno estérilesFisher Scientific05-539-5
nitrógeno líquidoLindeP110403
12 x 75 mm tubos de vidrio sin tapónFisher ScientificK60B1496126tubos de vidrio de borosilicato desechables con extremo liso
Matraces T25VWRCA15708-120nunc Tisue Culture Matraz de 25 ml (n.º de proveedor 156340)
tijerasFine Science Tools14068-12tijeras Wagner pinzas afiladas/afiladas de 12 cm
, recta Fine Science Tools11008-13Pinza Semken 13 cm,
recta pinza curvadaPinza Fine Science Tools11003-12Narrow Pattern 12 cm, curvada
60 mm placas de PetriVWRCA25382-100BD Falcon Placa de cultivo de tejidos 60 x 15 mm
, 70 mmFisher Scientific08-771-2Filtros de células Falcon 50/caja
Receta PBS: 1 tableta disuelta en 200 ml de agua desionizada, ajuste el pH a 7,4 si es necesario.Sigma AldrichP4417-100TABTabletas de solución salina tamponada con fosfato
Receta de TBS: para hacer 10x caldo
30 g TRIS HClSigma AldrichT3253-1KGClorhidrato de Trizma
88 g NaClFisher ScientificS271-500Cloruro de sodio
2 g KClFisher ScientificP217-500Cloruro de potasio
Disolver en 1 L de agua desionizada, ajustar el pH a 7,4
Life

Referencias

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