Se presenta un protocolo para evaluar los cambios en los niveles de daño en el ADN y la capacidad de reparación del ADN que pueden ser inducidos por la irradiación crónica in vivo de baja dosis en linfocitos de bazo de ratón, mediante la medición de la histona fosforilada H2AX, un marcador de roturas de doble cadena de ADN, utilizando citometría de flujo.
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Artículo de método
Medición de daños y reparación del ADN en esplenocitos de ratón Después crónica
En este artículo
Resumen
Resumen
Exposición a la radiación en dosis bajas puede producir una variedad de efectos biológicos que son diferentes en cantidad y calidad de los efectos producidos por dosis altas de radiación. Abordar las cuestiones relacionadas con la seguridad ambiental, ocupacional y de salud pública de una manera adecuada y científicamente justificada en gran medida se basa en la capacidad de medir con precisión los efectos biológicos de los contaminantes de dosis bajas, tales como sustancias químicas y radiación ionizante. Daños en el ADN y la reparación son los más importantes indicadores tempranos de riesgos para la salud debido a sus posibles consecuencias a largo plazo, tales como el cáncer. Aquí se describe un protocolo para estudiar el efecto de la crónica exposición in vivo a dosis bajas de γ- y β-radiación en daños y reparación del ADN en las células de bazo de ratón. Utilizando un marcador comúnmente aceptada de ADN de doble filamento se rompe, la histona H2AX fosforilada llamado γH2AX, se demuestra cómo se puede utilizar para evaluar no sólo los niveles de daño en el ADN, pero también cambiaen la capacidad de reparación del ADN potencialmente producido por una baja dosis de exposición in vivo. La citometría de flujo permite la medición rápida, precisa y fiable de immunofluorescently marcado γH2AX en un gran número de muestras. Reparar el ADN de doble filamento romper puede evaluarse mediante la exposición de esplenocitos extraídos a una dosis de 2 Gy reto de producir un número suficiente de ADN se rompe para desencadenar la reparación y midiendo la inducida (1 hora después de la irradiación) y daño del ADN residual (24 hrs después de la irradiación). Daño en el ADN residual sería indicativo de reparación incompleta y el riesgo de la inestabilidad genómica a largo plazo y el cáncer. Combinado con otros ensayos y puntos finales que pueden ser fácilmente medidos en tales estudios in vivo (por ejemplo, las aberraciones cromosómicas, frecuencias de micronúcleos en reticulocitos de la médula ósea, la expresión de genes, etc.), este enfoque permite una evaluación precisa y contextual de los efectos biológicos de los factores de estrés de bajo nivel.
Introducción
Controversia significativa sobre los posibles efectos nocivos de cualquiera de las dosis bajas o muy bajas de radiación y el temor del público de la radiación, impulsado por las imágenes de los bombardeos atómicos de Hiroshima y Nagasaki y de accidentes en plantas nucleares raras ionizante (exacerbada por los medios de comunicación), ha dado lugar a muy estricta regulación de la protección radiológica y normas que potencialmente no son científicamente justificada. En las tres últimas décadas, numerosos informes han documentado tanto la falta de perjudicial y la presencia de efectos biológicos potencialmente beneficiosos inducidos por la radiación de baja dosis 1....
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Protocolo
Todos los procedimientos de manipulación y tratamiento de ratones deben adherirse a las normas establecidas por los programas de la legislatura y / o cuidado de los animales y aprobados por un comité local de cuidado de animales. Todos los métodos descritos en este protocolo se realizaron de acuerdo con las directrices del Consejo Canadiense de los Animales, con la aprobación del comité local de cuidado de animales.
ATENCIÓN: Todos los trabajos con radiactividad (incluyendo, pero no limitado a la manipulación de tritio, γ-irradiación externa, la manipulación de tejidos animales, residuos radiactivos de cama) deben adherirse a las normas establecidas por las autoridades de la legi....
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Resultados
La Figura 2 muestra ejemplos de gráficos de citometría de flujo esperados para esplenocitos preparados usando el método descrito aquí. Las células se gated primero basado en el gráfico de dispersión (Figura 2A y 2D; volumen electrónico es equivalente a dispersión frontal). Histogramas de yodo FL3 / propidio (Figura 2B y 2E) confirman la distribución del ciclo celular normal. Señal γ.......
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Discusión
El protocolo presentado en este documento es útil para la realización del ratón a gran escala en los estudios in vivo que examinan los efectos genotóxicos de los bajos niveles de diversos agentes químicos y físicos, incluyendo la radiación ionizante. Nuestra instalación de animales libres de patógenos específicos único equipado con un irradiador GammaBeam 150 y un pasillo largo irradiación 30 metros permite la realización de estudios de toda la vida que implican radiaciones bajas o muy bajas tasas de d.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no se conocen intereses financieros en competencia.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer la contribución de nuestros colegas Sandrine Roch-Lefevre y Eric Gregoire del Instituto de Radioprotección y Seguridad Nuclear (París, Francia). Este trabajo fue apoyado por el programa de Ciencia y Tecnología del Gobierno de Canadá en los Laboratorios Nucleares Canadienses (Chalk River, Ontario, Canadá), el Grupo de Propietarios de CANDU (Toronto, Ontario, Canadá), la Comisión Canadiense de Seguridad Nuclear y por el Instituto de Protección Radioeléctrica y Seguridad Nuclear (París, Francia).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| HTO: agua tritiada, [3H] | obtenida localmente de un reactor nuclear | actividad de stock 3.7 GBq/mL; puede ser sustituido por HTO de Perkin Elmer | |
| OBT: Alanina, L-[3-3H]: tritio unido orgánicamente (OBT) | Perkin Elmer | NET348005MC | 1 mCi/ml (185 MBq) |
| OBT: Glicina, [2-3H]: tritio unido orgánicamente | Perkin Elmer | NET004005MC | 1 mCi/ml (185 MBq) |
| OBT: Prolina, L-[2,3-3H]: tritio unido orgánicamente (OBT) | Perkin Elmer | NET323005MC | 1 mCi/ml (185 MBq) |
| agua tritiada, [3H] (HTO) | Perkin Elmer | NET001B005MC | sustituto de HTO de origen local |
| El irradiador GammaBeam 150 | de Atomic Energy of Canada Limited | , fabricado localmente | , puede sustituirse por otra fuente de radiación g de actividad suficientemente baja. |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P1379-500ML | |
| RPMI | Fisher Scientific | SH3025501 | Hyclone RPMI 1640 con L-Glutamina y HEPES 500mL |
| suero fetal bovino | Sigma Aldrich | F1051-100ML | |
| anticuerpo anti-gH2AX, clon JBW301 | Millipore | 05-636 | |
| Alexa fluor-488 cabra anti-ratón anticuerpo | Technologies (anteriormente Invitrogen) | A21121 | |
| yodo propidio | Sigma Aldrich | P4864-10ML | 1 mg/ml |
| etanol | Alcoholes comerciales | P006-EAAN | Botellas de 500 ml Etanol absoluto |
| Tubos de 1,5 ml | Tubos de microcentrífuga | Fisher Scientific | 2682550 |
| tubos de 15 ml | Tubos de centrífuga de polipropileno estériles | Fisher Scientific | 05-539-5 |
| nitrógeno líquido | Linde | P110403 | |
| 12 x 75 mm tubos de vidrio sin tapón | Fisher Scientific | K60B1496126 | tubos de vidrio de borosilicato desechables con extremo liso |
| Matraces T25 | VWR | CA15708-120 | nunc Tisue Culture Matraz de 25 ml (n.º de proveedor 156340) |
| tijeras | Fine Science Tools | 14068-12 | tijeras Wagner pinzas afiladas/afiladas de 12 cm |
| , | recta Fine Science Tools | 11008-13 | Pinza Semken 13 cm, |
| recta pinza curvada | Pinza Fine Science Tools | 11003-12 | Narrow Pattern 12 cm, curvada |
| 60 mm placas de Petri | VWR | CA25382-100 | BD Falcon Placa de cultivo de tejidos 60 x 15 mm |
| , 70 mm | Fisher Scientific | 08-771-2 | Filtros de células Falcon 50/caja |
| Receta PBS: 1 tableta disuelta en 200 ml de agua desionizada, ajuste el pH a 7,4 si es necesario. | Sigma Aldrich | P4417-100TAB | Tabletas de solución salina tamponada con fosfato |
| Receta de TBS: para hacer 10x caldo | |||
| 30 g TRIS HCl | Sigma Aldrich | T3253-1KG | Clorhidrato de Trizma |
| 88 g NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | Cloruro de sodio |
| 2 g KCl | Fisher Scientific | P217-500 | Cloruro de potasio |
| Disolver en 1 L de agua desionizada, ajustar el pH a 7,4 |
Referencias
- Mitchel, R. E., Jackson, J. S., McCann, R. A., Boreham, D. R. The adaptive response modifies latency for radiation-induced myeloid leukemia in CBA/H mice. Radiat Res. 152 (3), 273-279 (1999).
- Shadley, J. D. Chromosomal adaptive response in human lymphocytes. Radiat Res<....
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Reimpresiones y permisos
