Un accidente cerebrovascular trombótico Basado En transitoria cerebral por hipoxia-isquemia Modelo

Resumen

Los modelos de ictus tromboembólicos son herramientas vitales para optimizar la terapia de recanalización. Presentamos un modelo murino de ictus trombótico basado en el insulto hipóxico-isquémico cerebral transitorio (tHI), que desencadena trombosis e infarto, y responde favorablemente a la fibrinólisis mediada por el activador tisular del plasminógeno (tPA) en una ventana terapéutica similar a la de los pacientes con ictus.

Resumen

Investigación Stroke ha sufrido muchos reveses en la traducción de las terapias neuroprotectoras en la práctica clínica. En contraste, la terapia del mundo real (tPA trombolisis) rara vez produce beneficios en modelos experimentales basados ​​en la oclusión mecánica, que dominan la investigación preclínica derrame cerebral. Esta división entre el banco y la cabecera sugiere la necesidad de emplear modelos tPA-sensibles en la investigación preclínica derrame cerebral. Para este fin, un modelo de accidente cerebrovascular trombótico simple y tPA-reactiva se inventó y se describe aquí. Este modelo consiste en la oclusión transitoria de la arteria carótida común unilateral y la entrega de 7,5% de oxígeno a través de una máscara facial en ratones adultos durante 30 min, manteniendo la temperatura rectal de los animales a 37,5 ± 0,5 ° C. Aunque la ligadura reversible de la arteria carótida unilateral o hipoxia cada suprime el flujo sanguíneo cerebral sólo transitoriamente, la combinación de ambos insultos causada duradera déficit de reperfusión, la fibrina y la deposición de plaquetas, y gran INFARct en el territorio de la arteria cerebral media suministrado. Es importante destacar que la cola de la vena inyección de tPA recombinante en 0,5, 1, o 4 horas después de la THI (10 mg / kg) proporcionó una reducción dependiente del tiempo de la tasa de mortalidad y el tamaño del infarto. Este nuevo modelo de accidente cerebrovascular es simple y puede ser estandarizado a través de laboratorios para comparar los resultados experimentales. Además, se induce la trombosis sin craniectomía o introducir émbolos preformadas. Teniendo en cuenta estas ventajas únicas, el modelo THI es una adición útil al repertorio de la investigación preclínica derrame cerebral.

Introducción

Trombolisis y recanalización es la terapia más eficaz de accidente cerebrovascular isquémico agudo en la práctica clínica ^1. Sin embargo, la mayoría de la investigación preclínica neuroprotección se realizó en un modelo transitorio mecánico obstrucción (oclusión de la arteria cerebral media de sutura intraluminal) que produce la rápida recuperación del flujo sanguíneo cerebral después de la retirada de la oclusión vascular y muestra poco a ningún beneficio por tPA trombólisis. Se ha sugerido que la dudosa elección de los modelos de accidente cerebrovascular contribuyó, al menos en parte, a la dificultad en la traducción de la terapia neuroprotectora a los pacientes ^2,3. Por lo tanto, hay una demanda creciente para el empleo de modelos de ictus tromboembólico tPA-respuesta en la investigación preclínica, pero estos modelos también tienen problemas técnicos (ver Discusión) ^4-7. Aquí se describe un nuevo modelo basado en accidente cerebrovascular trombótico (THI) unilateral insulto hipóxico-isquémico transitorio y sus respuestas a la terapia intravenosa tPA ^8.

El modelo de carrera THI fue desarrollado sobre la base del procedimiento de Levine (ligadura permanente de la arteria carótida común unilateral seguido por la exposición a la hipoxia transitoria en una cámara) que se inventó para los experimentos con ratas adultas en 1960 ^9. El procedimiento original Levine desvaneció en la oscuridad, porque sólo produce daño cerebral variable, pero el mismo insulto causado neuropatología consistente en crías de roedores cuando fue reintroducido por Roberto Vannucci y sus colegas como un modelo de neonatal encefalopatía hipóxico-isquémica (EHI) en 1981 ^10. En los últimos años, algunos investigadores re-adaptar el modelo Levine-Vannucci a ratones adultos mediante el ajuste de la temperatura en la cámara hipóxica ^11. Es plausible que las lesiones cerebrales inconsistentes en el procedimiento original Levine pueden surgir de la fluctuación de las temperaturas corporales de roedores adultos en la cámara hipóxica. Para probar esta hipótesis, hemos modificado el procedimiento Levine mediante la administración de gas hipóxicoa través de una mascarilla, mientras se mantiene la temperatura del núcleo de roedores a 37 ° C sobre la mesa quirúrgica ^12. Como era de esperar, el control estricto de la temperatura corporal aumenta considerablemente la reproducibilidad de la patología cerebral inducida por HI. El insulto HI también provoca la coagulación, la autofagia y grises y lesiones ¹³ la sustancia blanca. Otros investigadores también han utilizado el modelo HI para investigar después del accidente cerebrovascular respuestas inflamatorias ^14.

Una característica única del modelo de accidente cerebrovascular HI es que sigue de cerca la tríada de la Virchow de la formación de trombos, incluida la estasis del flujo de sangre, lesión endotelial (por ejemplo, debido al estrés oxidativo inducido-HI), y la hipercoagulabilidad (activación de las plaquetas HI inducida) ( Figura 1 A) ^15. Como tal, el modelo HI puede capturar algunos mecanismos fisiopatológicos relacionados con el accidente cerebrovascular isquémico en el mundo real. Con esta idea en mente, hemos perfeccionado aún más el modelo HI con ligadura reversible de la ONUarteria carótida común ilateral (por lo tanto, para crear un insulto HI transitorio), y se ensayó sus respuestas a tPA trombolisis con o sin edavarona. Edaravona es un eliminador de radicales libres ya aprobado en Japón para tratar el ictus isquémico dentro de las 24 horas de aparición ^9. Nuestros experimentos mostraron que lo más breve 30 min transitoria HI desencadena el infarto trombótico, y que combinado tratamiento con tPA-edaravona confiere beneficios sinérgicos ^8. Aquí se describen los procedimientos quirúrgicos detalladas y consideraciones metodológicas del modelo de THI, que pueden ser utilizados para optimizar los tratamientos de reperfusión de accidente cerebrovascular isquémico agudo.

Protocolo

Este protocolo ha sido aprobado por el Cuidado y Uso de Animales Comité Institucional (IACUC) de la Universidad de Emory y sigue los Institutos Nacionales de la Salud Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio.

1. Configuración

1. Preparar el lecho quirúrgico en el cojín de calentamiento conectada con bomba de calor a 37 ° C durante al menos 15 minutos antes de la cirugía. Coloque un rollo de cuello con el cañón de 3 ml jeringa en el lecho quirúrgico. Preparar el gas de la anestesia con isoflurano 2% en el aire médica.
2. Preparar fórceps tratado al autoclave, tijeras, tenedores micro agujas, pinzas hemostáticas, hisopos de algodón y suturas. Preparar adhesivo tisular y ungüento para los ojos.
3. Configurar el sistema de hipoxia y controladores de temperatura con lámpara de calefacción y la sonda rectal. Preparar gas hipoxia con 2% de isoflurano en 7,5% de O ₂ equilibrada por el 92,5% de N _2.
4. Una hora antes de la cirugía, los ratones se analgesized por inyección subcutánea de una liberación lenta Meloxicam (4,0 mg / kg).

2. Transient cerebral hipoxia-isquemia (Figura 1B)

1. Anestesiar C57BL macho 10-13 semanas de edad / 6 ratones con un peso de 22 a 30 g en la cámara de inducción de la anestesia con isoflurano 3% hasta que el animal no responde a la compresión de los pies, y luego quitar el pelo en el cuello derecha usando una máquina de afeitar electrónica.
2. Coloca los ratones en el lecho quirúrgico conectado con 2% de isoflurano en el aire médica a un caudal de 2 l / min. Extremidades anteriores Secure estiradas a lo largo rollo de cuello a los lados con cinta médica.
3. Limpie el sitio de la cirugía para la incisión con betadine seguido por el alcohol y luego hisopos de algodón.
4. Bajo el microscopio de disección, hacer una incisión de 0,5 cm derecha del cuello uterino usando un fórceps rectos y un micro tijeras aproximadamente 0,2 cm lateral de la piel en la línea media.
5. Use un par de pinzas dentadas finas de separar la fascia y el tejido para exponer la arteria carótida común derecha (RCCA). Separar cuidadosamente el RCCA desde el nervio vagal usando un par de pinzas lisas finas.
6. Vivo nudo dos precortadas 5-0 sutura de seda (desmontable) del RCCA, y luego coser la piel utilizando 4-0 Nylon sutura monofilamento (Figura 1C).
7. Aplicar pomada ocular en ambos ojos para evitar la sequedad.
8. Transferir rápidamente los ratones al sistema de hipoxia y poner la nariz y la boca en la cara-máscara con 2% de isoflurano en 7,5% O ₂ a un caudal de 0,5-1 L / min durante 30 min.
   1. Durante la hipoxia, utilizar reguladores de temperatura con lámparas de calor para controlar la temperatura rectal a 37,5 ± 0,5 ° C. Monitorear la frecuencia respiratoria en 80 a 120 respiraciones / min. El mantenimiento de la temperatura corporal por encima de 37 ° C durante la hipoxia es importante crear infarto cerebral coherente. Frecuencia respiratoria baja por lo general ocurre después de 20 min de hipoxia. Retire la mascarilla y permitir el suministro de aire normal si la frecuencia respiratoria cae por debajo de 40. Esto se lleva a 1-2 minutos y no cuenta en la duración hipoxia 30 min.
9. Después de la hipoxia, transferirlos ratones a una cama quirúrgica y suelte las dos suturas de RCCA. Cierre la herida con pegamento tisular y, a continuación, volver a la jaula de los ratones. Excluir a los animales si tanto de dos nudos vivos se liberan de forma inesperada después de la hipoxia.
10. Monitorear los ratones para 5-10 minutos para recuperarse de la hipoxia y la anestesia. Coloque la comida humedecida en la jaula y devolverlo al centro de cuidado de los animales.
    Nota: Los animales que presenten leves a comportamientos en circuito severa a las 24 horas después de THI se correlacionan con infracción cerebro. La mayoría de los animales con síntomas convulsivos mueren antes de que el punto de tiempo de 24 horas después de THI.

3. láser Speckle de contraste de imagen

Nota: Aunque este no es un procedimiento esencial del modelo THI, un láser speckle sistema de imágenes de contraste de dos dimensiones ¹⁶ puede ser utilizado para caracterizar los cambios de flujo sanguíneo cerebral (CBF) durante o después de la hipoxia transitoria-isquemia. Para documentar las alteraciones de la CBF bajo THI, ficha inmediatamente después del step 2.6. Alternativamente, para comparar la recuperación CBF después THI insulto, estos procedimientos se pueden realizar después de la etapa 2.10.

1. Publicar un ratón anestesiado en decúbito prono y realizar una incisión de 1 cm de largo en el cuero cabelludo con el cráneo impresionados pero sin abrir.
2. Monitorear CBF en ambos hemisferios cerebrales bajo un generador de imágenes del flujo sanguíneo de acuerdo con el protocolo del fabricante y empezar a grabar el flujo sanguíneo cerebral inmediatamente después de la cirugía CCAO (paso 2.6). Continuar durante 50 minutos.
3. Mostrar imagen CBF con unidades arbitrarias en una paleta de 16 colores y analizar en tiempo real las regiones seleccionadas utilizando el software MoorFLPI siguiendo las instrucciones del fabricante (Figura 2).
4. Después de grabar la imagen CBF, cierre el cuero cabelludo con adhesivo tisular y devolver el animal a la jaula.

4. Administración de tPA

1. Inyectar animales en la vena de la cola con el disolvente o 10 mg / kg de tPA recombinante (220-300 y# 956; l de 1 mg / m tPA) a las 0,5, 1, o 4 horas después de tCCAo más hipoxia (Figura 4).

Detección de Daño 5. cerebro con varios diferentes opciones

Nota: Para recoger muestras de cerebro, la eutanasia a los ratones a los 1, 4 ó 24 horas después de THI.

1. Realizar cuantificación del volumen de infarto por in vivo cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio método (TTC) a las 24 horas después de THI insulto como se describe anterior. ¹⁷
   1. Intraperitoneal inyectar animales con solución 1,4 M manitol (~ 0,1 ml / g de peso corporal) 30 minutos antes de la perfusión transcardial. Ratones perfundir transcardial con PBS seguido por 10 ml de 2% TTC.
   2. Retire el cerebro de los animales con los instrumentos quirúrgicos después de 10 minutos y colocar en paraformaldehído al 4% para la fijación durante la noche y en la sección 1 mm de espesor con un vibratome.
   3. Toma una serie de cuatro diapositivas cerebro seccionado por microscopio digital y quantify el volumen del infarto como la relación de la zona infartada (área blanca en el lado derecho) a la zona de la intacto, hemisferio contralateral usando el software ImageJ.
2. Alternativamente, lleve a cabo la formación de trombosis por inmunofluorescencia en 1 hora después de THI insulto.
   1. Congelar el cerebro fija en compuesto OCT y la sección de los cerebros de 12 micras de espesor utilizando un criostato.
   2. Incubar el portaobjetos cerebro con anticuerpo de conejo anti-fibrinógeno (1: 100) siguiendo por cabra anti-conejo Alexa 488 Fluro colorante (1: 200) para observar la fluorescencia en un microscopio fluorescente.
3. Alternativamente, realice la obstrucción buque por inyección en la vena de la cola de 100 l 2% colorante azul de Evans en 4 horas después de THI insulto.
   1. La eutanasia a los ratones y rápidamente cortar la cabeza para eliminar cerebros en paraformaldehído al 4% después de la inyección de azul de Evans. Nota: Se necesita 5-10 min para Evans circulación azul con el color azul de tanto delanteras y traseras extremidades.
   2. SECTIen cerebros fijos a 100 micras de espesor usando un micrótomo de deslizamiento y observar la fluorescencia utilizando un filtro de emisión de 680 nm en un microscopio fluorescente.

Resultados

Bidimensional de imágenes de contraste de moteado de láser (LSCI) ¹⁶ se utilizó para comparar las alteraciones del flujo sanguíneo cerebral (CBF) por la oclusión transitoria de la carótida 30 min unilateral (tCCAO), la exposición 30 min a la hipoxia (7,5% de oxígeno), y 30 min unilateral carotídea ligadura en condiciones de hipoxia (THI). Este experimento reveló que tCCAO bajo normoxia suprimió la CBF en el hemisferio carótida se ligó a ~ 50% del valor de línea de base, que se recuperó rápidamente a por encim...

Discusión

El ictus es un problema de salud importante de creciente importancia para cualquier sociedad con una población que envejece. A nivel mundial, el accidente cerebrovascular es la segunda causa principal de la muerte con un estimado de 5.9 millones de eventos fatales en 2010, lo que equivale al 11,1% de todas las muertes ^18. El accidente cerebrovascular es también la tercera causa de discapacidad años de vida ajustados (AVAD) perdidos a nivel mundial en 2010, pasando de la quinta posición en 1990 ^19. ...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
ratones machos adultos	Charles River	C57BL/6	10-13 semanas de edad (22-30 g)
sistema móvil de anestesia para animales de laboratorio	VetEquip		901807 anestesia
Tanque de aire medicinal (comprimido)	Airgas	UN1002	anestesia
isoflurano	Piramal Healthcare	NDC 66794-013-25	anestesia
Multi-Station Lab Animal AnesthesiaSystem	Surgive	V703501	Sistema
de hipoxia7,5% O2 equilibrado por un tanque de N2	Airgas	Sistema de hipoxia	UN1956
Controlador de temperatura con lámpara de calefacción	Cole Parmer	Controladores de temperatura EW-89000-10
Sonda rectal	Cole Parmer	NCI-00141PG Controladores de	temperatura
Microscopio de disección	Olimpo	Configuración quirúrgica	SZ40
Bomba de calor con almohadilla térmica	Gaymar	Configuración quirúrgica TP700
Pinza curvada fina (dentada)	FST	11370-31	instrumental quirúrgico
Pinza curva fina (lisa)	FST	11373-12	instrumental quirúrgico
microtijeras	FST	15000-03	instrumental quirúrgico
microportaagujas	FST	12060-01	instrumental quirúrgico
Halsted-Mosquito hemostáticos	FST	13008-12	instrumental quirúrgico
5-0 sutura de seda	Harvard Apparatus	624143	suministros quirúrgicos
4-0 Sutura de monofilamento de nailon	LOOK	766B	quirúrgicos
Pegamento para tejidos	Abbott Laboratories	NC9855218	suministros quirúrgicos
Puralube Vet ungüento	Fisher	NC0138063	prevención de la sequedad ocular
Generador de imágenes de flujo sanguíneo MoorFLPI-2	Fuente láser Moor	780-nm Laser	Speckle Contrast Imaging
Mannitol	Sigma	M4125	in vivo TTC
Cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTC)	Sigma	T8877	in vivo TTC
Vibratome	Stoelting	51425	sección de cerebro para in vivo TTC
Microscopio digital	Dino-Lite	AM2111	de imágenes de todo el cerebro
compuesto O.C.T	Sakura Finetek	4583
cabra anti-conejo Alexa Fluro 488	Invitrogen	A11008	Inmunohistoquímica
Cryostat	Vibratome	ultrapro 5000	sección cerebral para IHC
Evans azul	Sigma	E2129	Detección vascular
micrótomo	Microscopía electrónica Sciences	5000	sección del cerebro para histología
Avertin (2, 2, 2-tribromoetanol)	Sigma	T48402	eutanasia
Microscopio fluorescente	Olympus	DP73
Meloxicam SR	ZooPharm		Analgesia AINE

t suministros de perfusión