Los canales iónicos expresadas en el epitelio tubular renal desempeñan un papel importante en la patología de la enfermedad poliquística del riñón. Aquí se describen los protocolos experimentales utilizados para realizar mediciones de análisis y el nivel de calcio intracelular patch-clamp en el epitelio quística recién aisladas de los riñones de roedores.
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Artículo de método
La implementación de Patch Clamp y vivo microscopía de fluorescencia para supervisar propiedades funcionales de recién aisladas PKD Epitelio
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Resumen
Resumen
Iniciación quiste y expansión durante la enfermedad renal poliquística es un proceso complejo caracterizado por anormalidades en la proliferación celular tubular, acumulación de líquido luminal y la formación de matriz extracelular. La actividad de los canales iónicos y la señalización de calcio intracelular son parámetros fisiológicos clave que determinan las funciones de epitelio tubular. Hemos desarrollado un método adecuado para la observación en tiempo real de la actividad de los canales iónicos con la técnica de patch-clamp y el registro de nivel intracelular de Ca2 + en monocapas epiteliales recién aisladas de quistes renales. PCK ratas, un modelo genético de la enfermedad poliquística autosómica recesiva del riñón (ARPKD), se utilizaron aquí para el análisis ex vivo de los canales iónicos y el flujo de calcio. Descrito aquí es un procedimiento detallado paso a paso diseñado para aislar monocapas quísticas y túbulos no dilatado de PCK o ratas normales Sprague Dawley (SD), y supervisar la actividad de un solo canal e intracelulares de Ca 2+ dinámica.Este método no requiere procesamiento enzimático y permite el análisis en un entorno nativo de recién aisladas monocapa epitelial. Además, esta técnica es muy sensible a los cambios de calcio intracelular y genera imágenes de alta resolución para mediciones precisas. Por último, aislado epitelio quístico se puede utilizar más de tinción con anticuerpos o colorantes, preparación de cultivos primarios y purificación de diversos ensayos bioquímicos.
Introducción
Los canales iónicos juegan un papel importante en muchas funciones fisiológicas, incluyendo el crecimiento y la diferenciación celular. Enfermedades renales autosómicos dominantes y recesivos poliquísticos (PQRAD y ARPKD, respectivamente) son trastornos genéticos caracterizados por el desarrollo de quistes llenos de líquido renales de origen de las células epiteliales tubulares. PQRAD está causada por mutaciones de los genes PKD1 o PKD2 codifican poliquistinas 1 y 2, las proteínas de membrana que participan en la regulación de la proliferación y diferenciación celular. PKD2 por sí mismo o como un complejo con PKD1 también funcionan como un canal catiónico -permeable ....
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Protocolo
Los procedimientos experimentales se describen a continuación fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional en el Colegio Médico de Wisconsin y la Universidad de Texas Health Science Center en Houston y estaban de acuerdo con los Institutos Nacionales de Salud de Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. La Figura 1 demuestra principales etapas del aislamiento de tejido y procedimiento de procesamiento. En pocas palabras, los riñones de ratas PCK o SD se utilizan para el aislamiento Manual de monocapas epiteliales de los conductos colectores, ya sea a partir de los túbulos o quistes no marcado saludables. Aquí....
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Resultados
Participación ENaC potencial en quistogénesis ha sido demostrado por varios estudios que observan factor de crecimiento epidérmico perturbado (FEAG) de señalización en PKD progresión de 22-25 y la reabsorción de sodio anormal en ARPKD modelos murinos y cultivos de tejidos 26-28. Por ejemplo, Veizis et al. Mostraron que la absorción sensible a amilorida Na + se reduce en las células de CD desde el modelo de ratón BPK no ortólogos de ARPKD 29. Recientemente hemos demost.......
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Discusión
Describimos aquí las aplicaciones de la técnica de patch-clamp convencional y imágenes de calcio epifluorescencia a monocapas epiteliales quísticas derivadas de un modelo genético murino de ARPKD. El protocolo consiste en tres pasos, de los cuales se debe prestar la mayor atención al aislamiento de los quistes (paso 1.5 de la sección de protocolos) y para los estudios electrofisiológicos. Estos procedimientos clave requieren una amplia formación y la paciencia, y el lector no debe ser frustrada a la vez.
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer a Glen Slocum (Colegio Médico de Wisconsin) y Colleen A. Lavin (Nikon Instruments Inc) para una excelente asistencia técnica con los experimentos de microscopía. Este estudio fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud otorga R01 HL108880 (AS), R01 DK095029 (OPO) y K99 HL116603 (con TSP), la Fundación Nacional del Riñón IG1724 (con TSP), Asociación Americana del Corazón 13GRNT16220002 (OPO) y Ben J. Lipps de Becas de Investigación de la Sociedad Americana de Nefrología (DVI).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Fura-2 AM | Life Technologies | F-14185 | |
| Fluo-8 | AAT Bioquest | 21091 | |
| Poly-L-lisina | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| Ácido plurónico | Sigma-Aldrich | F-68 | solución |
| Agitador | Boekel Scientific | 260350 | |
| Fuente de luz | Sutter Instrument Co | Lambda XL | con controlador de rueda de obturador/filtro integrado |
| Filtros de densidad neutra | Nikon | ND4, ND8 | |
| Objetivo | Nikon | SFluo | 40/1.3 DIC WD 0.22 óleo |
| Cámara | Andor Technologies | Zyla sCMOS | |
| Nikon microscopio (invertido) | Nikon Nikon Eclipse TE2000-S | ||
| Cubierta de vidrio | Thermo Scientific | 6661B52 | |
| Lápiz de diamante | Fisher Scientific | 22268912 | |
| Software de adquisición de imágenes | Nikon | Nikon NIS-Elements | |
| El software de análisis de imágenes | ImageJ | http://imagej.nih.gov/ | ND Utility plugin permite importar imágenes en formato .nd2 nativo de Nikon Instruments |
| Cámara de grabación/perfusión | Instruments | RC-26 | |
| Patch Clamp Amplificador | |||
| Dispositivos moleculares | Digidata 1440A | Axon Digidata® Sistema | |
| de filtro de paso bajo | Warner Instruments | LPF-8 | Bessel de 8 polos |
| World Precision Instruments | 1B150F-4 | ||
| Extractor de micropipetas | Sutter Instrument Co | P-97 | Tirador de micropipetas de tipo Flaming/Brown |
| Microforge | Narishige | MF-830 | Japan |
| Micromanipulador | motorizadoSutter Instrument Co | MP-225 | |
| Microscopio invertido | Nikon | Eclipse Ti | |
| Mesa de aislamiento de microvibraciones | TMC | equipada con jaula de Faraday | |
| Sistema de perfusión de válvula | multicanal AutoMake | Scientific Banco de válvulas II | |
| Cámara de registro/perfusión | Instruments | RC-26 | |
| Software | Molecular Devices | pClamp 10 . 2 | |
| Mesa quirúrgica con control de temperatura | Núcleo | para roedores | |
| Microscopio estereoscópico binocular | Nikon | SMZ745 | |
| Sistema de perfusión basado en bomba de jeringa | Harvard Apparatus | ||
| tubo de polietileno | Sigma-Aldrich | PE50 | |
| Anestesia con isofluorano | http://www.vetequip.com/ | 911103 | |
| Otros reactivos básicos | Sigma-Aldrich |
Referencias
- Torres, V. E., Harris, P. C., Pirson, Y. Autosomal dominant polycystic kidney disease. Lancet. 369 (9569), 1287-1301 (2007).
- Zhang, M. Z., et al. PKHD1 protein encoded by the gene for autosomal recess....
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Reimpresiones y permisos
