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Artículo de método

La implementación de Patch Clamp y vivo microscopía de fluorescencia para supervisar propiedades funcionales de recién aisladas PKD Epitelio

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DOI:

10.3791/53035

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1 de septiembre de 2015

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1Department of Physiology, Medical College of Wisconsin, 2Department of Integrative Biology & Pharmacology, University of Texas Health Science Center at Houston

En este artículo

Resumen

Los canales iónicos expresadas en el epitelio tubular renal desempeñan un papel importante en la patología de la enfermedad poliquística del riñón. Aquí se describen los protocolos experimentales utilizados para realizar mediciones de análisis y el nivel de calcio intracelular patch-clamp en el epitelio quística recién aisladas de los riñones de roedores.

Resumen

Iniciación quiste y expansión durante la enfermedad renal poliquística es un proceso complejo caracterizado por anormalidades en la proliferación celular tubular, acumulación de líquido luminal y la formación de matriz extracelular. La actividad de los canales iónicos y la señalización de calcio intracelular son parámetros fisiológicos clave que determinan las funciones de epitelio tubular. Hemos desarrollado un método adecuado para la observación en tiempo real de la actividad de los canales iónicos con la técnica de patch-clamp y el registro de nivel intracelular de Ca2 + en monocapas epiteliales recién aisladas de quistes renales. PCK ratas, un modelo genético de la enfermedad poliquística autosómica recesiva del riñón (ARPKD), se utilizaron aquí para el análisis ex vivo de los canales iónicos y el flujo de calcio. Descrito aquí es un procedimiento detallado paso a paso diseñado para aislar monocapas quísticas y túbulos no dilatado de PCK o ratas normales Sprague Dawley (SD), y supervisar la actividad de un solo canal e intracelulares de Ca 2+ dinámica.Este método no requiere procesamiento enzimático y permite el análisis en un entorno nativo de recién aisladas monocapa epitelial. Además, esta técnica es muy sensible a los cambios de calcio intracelular y genera imágenes de alta resolución para mediciones precisas. Por último, aislado epitelio quístico se puede utilizar más de tinción con anticuerpos o colorantes, preparación de cultivos primarios y purificación de diversos ensayos bioquímicos.

Introducción

Los canales iónicos juegan un papel importante en muchas funciones fisiológicas, incluyendo el crecimiento y la diferenciación celular. Enfermedades renales autosómicos dominantes y recesivos poliquísticos (PQRAD y ARPKD, respectivamente) son trastornos genéticos caracterizados por el desarrollo de quistes llenos de líquido renales de origen de las células epiteliales tubulares. PQRAD está causada por mutaciones de los genes PKD1 o PKD2 codifican poliquistinas 1 y 2, las proteínas de membrana que participan en la regulación de la proliferación y diferenciación celular. PKD2 por sí mismo o como un complejo con PKD1 también funcionan como un canal catiónico -permeable Ca 2 + 1. Las mutaciones del gen que codifica PKHD1 fibrocystin (una proteína similar al receptor de los cilios asociada a involucrados en el tubulogenesis y / o mantenimiento de la polaridad del epitelio) son el impulso genético de ARPKD 2. Crecimiento quiste es un fenómeno complejo acompañada con la proliferación perturbado 3,4, la angiogénesis 5, la desdiferenciación y pérdida de polardad de las células tubulares 6-8.

Reabsorción defectuosa y secreción aumentada en el epitelio quístico contribuyen a la acumulación de líquido en el lumen y el quiste de expansión 9,10. Flujo dependiente Deterioro [Ca 2 +] i de señalización también se ha vinculado a la quistogénesis durante PKD 11-15.

Aquí se describe un método adecuado para mediciones de patch-clamp de la actividad de un solo canal e intracelulares de Ca 2+ niveles en monocapas epiteliales quísticas aisladas de ratas PCK. Este método fue aplicado con éxito por nosotros para caracterizar la actividad del canal epitelial de Na + (ENAC) 10 y la [Ca2 +] i dependiente de procesos inducidos por Ca2 + TRPV4 -permeable y la cascada de señalización purinérgico 13.

En estos estudios se utilizaron ratas PCK, un modelo de ARPKD causada por una mutación espontánea en el gen PKHD1. La cepa PCK fue originally derivados de las ratas 16 ratas de ese modo SD se utilizan como un control apropiado para la comparación con la cepa Sprague-Dawley PCK (SD). Como resultado, ambos segmentos de la nefrona de ratas SD y conductos no dilatado recogida aisladas de ratas PCK mismos pueden servir como dos grupos de comparación diferentes para experimentos en el epitelio quística.

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Protocolo

Los procedimientos experimentales se describen a continuación fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional en el Colegio Médico de Wisconsin y la Universidad de Texas Health Science Center en Houston y estaban de acuerdo con los Institutos Nacionales de Salud de Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. La Figura 1 demuestra principales etapas del aislamiento de tejido y procedimiento de procesamiento. En pocas palabras, los riñones de ratas PCK o SD se utilizan para el aislamiento Manual de monocapas epiteliales de los conductos colectores, ya sea a partir de los túbulos o quistes no marcado saludables. Aquí estudiamos riñones de 4-16 semanas de edad ratas PCK 10,13.

1. Aislamiento del renales Quistes y Tubos de conexión (CNT) / conductos colectores (CD) Segmentos

  1. Anestesiar animal experimental con isoflurano (5% de inducción, 1,5 a 2,5% de mantenimiento) / O de grado médico 2 u otro método aprobado. Los animales deben ser monitoreados continuamente para asegurar le adecuadavel de la anestesia. Reacción tasa y puntera pizca respiratoria estable se utiliza para confirmar la anestesia adecuada.
  2. Realizar laparotomía y lavar los riñones con tampón fosfato salino (PBS) a través de la aorta abdominal 17.
    1. Preparar un catéter tubo de polietileno (PE50) y conectarlo a una bomba de jeringa llena con PBS. Cortar la piel y la pared abdominal a lo largo de la línea alba, a continuación, hacer una incisión abdominal transversal a través del abdomen de lado a lado y cambiar los órganos abdominales con hisopos de algodón obtener acceso a la aorta descendente que con ramificación arterias mesentéricas y celíacos. Humedezca los órganos internos con solución salina caliente durante los procedimientos adicionales para evitar su sequedad.
    2. Coloque una ligadura (# 1) alrededor de las arterias mesentéricas y celíacos y otra ligadura (# 2) alrededor de la aorta por debajo del diafragma (no atar). Separar suavemente a. abdominalis por embotar la disección de los tejidos conectivos alrededor de ella con unas pinzas finas y colocar dos ligaduras ~ 3mm por debajo de la arteria renal izquierda (# 3) y por encima de la bifurcación arterias ilíacas (# 4).
    3. Ate ligadura # 4 y adjuntar una pinza recipiente alrededor de la aorta entre la arteria renal izquierda y ligadura # 3. Hacer una incisión entre la abrazadera y la ligadura # 4 de sondar la aorta, utilice ligadura # 3 para fijar firmemente el catéter.
    4. Suelte la abrazadera y asegurarse de que el pulso de la sangre es visible en el catéter para asegurar una correcta instalación. Iniciar la perfusión a una velocidad de 6 ml / min, atar ligaduras # 1 y # 2, y se cortó la vena renal izquierda. Continuar enjuagando durante 1-2 minutos hasta que los órganos están completamente blanqueadas.
    5. Cortar los vasos sanguíneos renales, la uretra y los tejidos conectivos circundantes y adiposo con unas tijeras para recoger los riñones. A continuación, hacer un corto desgarro en la cápsula renal y la cáscara de los riñones para decapsulate ellos. Coloca los riñones en helado de PBS. La eutanasia se confirma mediante una toracotomía.
  3. Preparar 5 x 5 mm chips de vidrio cubierta revestidas con poli-L-lisina. Corte un gla cubiertass con un lápiz de diamante y el lugar aproximadamente 20 l de solución de 0,01% esterilizada por filtración de poli-L-lisina en cada chip de vidrio. Preparar solución salina y dos pares de pinzas de relojero para la disección.
  4. Cortar los riñones con una hoja de afeitar a lo largo del plano frontal en rodajas de ~ 1-2 mm de espesor. Coloque una de las rebanadas bajo un microscopio estereoscópico. Aislamiento de tejidos debe hacerse en solución salina enfriada con hielo.
  5. Busque quistes bajo un microscopio estereoscópico como cavidades redondo (Figura 2); sus paredes contienen a menudo la red prominente de vasos sanguíneos proliferado. Utilizando unas pinzas de punta fina diseccionar la capa epitelial interna de un quiste tan delgada como sea posible para obtener una zona de monocapa. Adjuntar a un chip de vidrio cubierto con poli-L-lisina. Sticky superficie de poli-L-lisina permite al investigador para posicionar firmemente la capa interna del quiste en el vidrio. Exponer el quiste con la parte apical hasta facilitar el acceso de las pipetas (Figura 2B).
  6. Utilice PCK o rata SD niñorebanadas centrales ney contienen papila para el aislamiento de no dilatadas CNT / CCDsegments 18-21.
    NOTA: los tejidos papilares son más duraderas que la corteza y mediante la celebración de bandas tubulares papilares con fórceps y desgarrando a lo largo de eje radial de la rebanada puede escindirse en sectores delgadas. Túbulos individuales son visibles y pueden ser sacados para ser colocados en los chips de vidrio cubierta.
  7. Identificar los segmentos de CNT / CCD por bifurcaciones, una mayor transparencia de los túbulos proximales y grandes células prominentemente visibles (Figura 2C). Coloque el chip de vidrio cubierta con túbulos unidos bajo un microscopio equipado con micromanipuladores adecuados para micropipetas conducción. El uso de micropipetas afilados túbulos dividida abiertos y fije sus extremos a la copa para que la superficie apical accesible (Figura 2D).

Electrofisiología 2. Single Channel Patch-clamp

  1. Llenar la cámara de patch-clamp con solución de baño y transferir el chip de vidrio cubiertacon tejidos aislados a la cámara. Asegúrese de que las micropipetas patch-clamp tienen una resistencia de 7.10 mO para mediciones (células adjunta) fiables sobre las células.
  2. Para las mediciones de células adjunta, establecer la relación de ganancia del amplificador de 20x y de paso bajo las corrientes de 300 Hz por un filtro de ocho polos de Bessel. Para el monitoreo canales CENa, utilice una solución de baño, en mm: 150 NaCl, CaCl2 1, 2 MgCl2, 10 HEPES (pH 7,4); pipeta: 140 LiCl, 2 de MgCl 2 y 10 HEPES (pH 7,4).
  3. Llevar a cabo un experimento de patch-clamp convencional en un modo celular conectado a 10. Seleccione una celda en la monocapa epitelial y acercarse a la pipeta a la membrana apical. Forma un sello de alta resistencia entre una pipeta y la membrana celular mediante la aplicación de una suave succión. Una vez que se forma un sello de alta GigaOhm resistentes, un protocolo sin huecos en un potencial de mantenimiento se debe iniciar la actividad de seguimiento del canal de interés.
  4. Datos actuales tienda brecha gratis solo canal de gigaSellos ohmios para su posterior análisis. Analizar los eventos de canal utilizando un paquete de software en general, se suministra con configuraciones de patch-clamp 18. Calcular la actividad del canal como NPO donde N se refiere al número de canales activos en el parche y Po es probabilidad de apertura promedio de los canales.
    NOTA: Utilice quistes o túbulos aislados en experimentos de patch-clamp para no más de 30 min.

3. Ratiometric epifluorescencia Las mediciones de concentración de calcio intracelular en las células epiteliales

  1. Utilice 5 mM Fura-2AM disuelto en DMSO. Solución Alícuota caldo en tubos cónicos de 500 l individuales (aproximadamente 10 l). Proteger de la luz y guardar en el congelador a -20 ° C durante un máximo de seis meses.
  2. Incubar quistes aislados y túbulos reventados por 30-40 min en PSS (en mM: 145 NaCl, 4,5 KCl, MgCl2 2, 2 CaCl2 y 10 HEPES a pH 7,35) que contiene 5 mM Fura-02 a.m. colorante y 0,05% de ácido plurónico para ayudar a dispersar los ésteres de acetoximetilo. Para eso, lugar tejidos en el plato de 3,5 cm que contenía cóctel de carga, protegerlo de la luz y se incuba en un agitador lento a temperatura ambiente.
  3. Cambie Fura-02 a.m. contiene medios para limpiar PSS después de la incubación y colocar el tejido bajo un microscopio para realizar más imágenes de epifluorescencia.
  4. A su vez en la cámara CCD y la fuente de luz estable (sistema monocromador) equipado con rueda de filtros (filtro de cada posición puede asociarse con su propio nivel de atenuación, seleccionado cada vez que el filtro se llama).
  5. Encuentra el tejido en campo claro. Cambie a la detección de la señal de fluorescencia y ajustar la intensidad de la fuente de luz utilizando filtros de densidad neutra y potencia de la lámpara para evitar la saturación de la señal.
  6. Monitorear Fura-2 AM fluorescencia en la muestra de tejido con excitación radiométrica a 340/380 nm con una frecuencia de 0.125 Hz o superior. Use un 40 × / NC 1.3 o similar lente objetivo para resolu adecuadala imagen.
  7. Para el procesamiento de imágenes y los cálculos importar la secuencia de imágenes. Asegúrese de dividir los canales y utilizar un modo de escala de grises HyperStack. Seleccione varias regiones de interés (células quiste único o áreas seleccionadas de tejido quística) y calcular valores de intensidad para cada canal (340 y 380 nm) en el software de análisis de datos preferido; valores de intensidad fondo restar de cada punto de datos.
  8. Para cada punto de tiempo de calcular la relación de intensidades de las Fura-2 AM 340 a 380 canales. Gráfico de dispersión / línea cambios en tiempo punto de Ca 2+ transitorio para cada región y calcular los valores medios / SE.

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Resultados

Participación ENaC potencial en quistogénesis ha sido demostrado por varios estudios que observan factor de crecimiento epidérmico perturbado (FEAG) de señalización en PKD progresión de 22-25 y la reabsorción de sodio anormal en ARPKD modelos murinos y cultivos de tejidos 26-28. Por ejemplo, Veizis et al. Mostraron que la absorción sensible a amilorida Na + se reduce en las células de CD desde el modelo de ratón BPK no ortólogos de ARPKD 29. Recientemente hemos demost...

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Discusión

Describimos aquí las aplicaciones de la técnica de patch-clamp convencional y imágenes de calcio epifluorescencia a monocapas epiteliales quísticas derivadas de un modelo genético murino de ARPKD. El protocolo consiste en tres pasos, de los cuales se debe prestar la mayor atención al aislamiento de los quistes (paso 1.5 de la sección de protocolos) y para los estudios electrofisiológicos. Estos procedimientos clave requieren una amplia formación y la paciencia, y el lector no debe ser frustrada a la vez.

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Los autores desean agradecer a Glen Slocum (Colegio Médico de Wisconsin) y Colleen A. Lavin (Nikon Instruments Inc) para una excelente asistencia técnica con los experimentos de microscopía. Este estudio fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud otorga R01 HL108880 (AS), R01 DK095029 (OPO) y K99 HL116603 (con TSP), la Fundación Nacional del Riñón IG1724 (con TSP), Asociación Americana del Corazón 13GRNT16220002 (OPO) y Ben J. Lipps de Becas de Investigación de la Sociedad Americana de Nefrología (DVI).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Fura-2 AMLife TechnologiesF-14185
Fluo-8AAT Bioquest21091
Poly-L-lisinaSigma-AldrichP4707
Ácido plurónicoSigma-AldrichF-68 solución
AgitadorBoekel Scientific260350
Fuente de luzSutter Instrument CoLambda XLcon controlador de rueda de obturador/filtro integrado
Filtros de densidad neutraNikonND4, ND8
ObjetivoNikonSFluo 40/1.3 DIC WD 0.22    óleo
CámaraAndor TechnologiesZyla sCMOS
Nikon  microscopio (invertido)Nikon Nikon Eclipse TE2000-S
Cubierta de vidrioThermo Scientific6661B52
Lápiz de diamanteFisher Scientific22268912
Software de adquisición de imágenesNikonNikon NIS-Elements 
El software de análisis de imágenesImageJhttp://imagej.nih.gov/ND Utility plugin permite importar imágenes en formato .nd2 nativo de Nikon Instruments
Cámara de grabación/perfusiónInstrumentsRC-26
Patch Clamp Amplificador
Dispositivos molecularesDigidata 1440AAxon Digidata® Sistema
de filtro de paso bajoWarner InstrumentsLPF-8Bessel de 8 polos
World Precision Instruments1B150F-4
Extractor de micropipetasSutter Instrument CoP-97Tirador de micropipetas de tipo Flaming/Brown
MicroforgeNarishigeMF-830Japan
MicromanipuladormotorizadoSutter Instrument CoMP-225
Microscopio invertidoNikonEclipse Ti
Mesa de aislamiento de microvibracionesTMCequipada con jaula de Faraday
Sistema de perfusión de válvulamulticanal AutoMakeScientific Banco de válvulas II
Cámara de registro/perfusiónInstrumentsRC-26
SoftwareMolecular DevicespClamp 10 . 2
Mesa quirúrgica con control de temperatura Núcleopara roedores
Microscopio estereoscópico binocularNikonSMZ745
Sistema de perfusión basado en bomba de jeringaHarvard Apparatus
tubo de polietilenoSigma-AldrichPE50
Anestesia con isofluoranohttp://www.vetequip.com/911103
Otros reactivos básicosSigma-Aldrich
Warner Sistema de adquisición de datos MultiClamp 700B de Molecular Devices Capilares de vidrio de borosilicato Warner MCW

Referencias

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