Por encargo Microdiálisis Sonda Diseño

Resumen

La microdiálisis es una técnica muy utilizada en la investigación en neurociencias. Por lo tanto sondas comerciales están en gran demand.In esta obra un conjunto de sonda se explica en detalle la construcción de una sonda fiable, concéntrico a medida microdiálisis por menos de $ 10.

Resumen

La microdiálisis es una técnica muy utilizada en la investigación en neurociencias. Por lo tanto sondas comerciales tienen una gran demanda para monitorear los cambios fisiológicos, farmacológicos y patológicas en el líquido cefalorraquídeo. Por desgracia, las sondas comerciales son caros para los grupos de investigación en las instituciones públicas. En este trabajo, un conjunto de sonda se explica en detalle la construcción de una sonda fiable, concéntrico a medida microdiálisis por menos de $ 10. La sonda de microdiálisis se compone de una membrana de polisulfona con un corte molecular de 30 kDa. Sonda in vitro se comparan recuperaciones de sustancias con diferente peso molecular (en el intervalo de 100-1,600 Da) y diferentes propiedades fisicoquímicas. La sonda produce una recuperación in vitro de aproximadamente 20% para los compuestos pequeños glucosa, lactato, acetilcolina y ATP. En vitro recuperaciones para los neuropéptidos con un peso molecular entre 1.000-1.600 Da cantidad de 2-6%. Por lo tanto, mientras que la mayor w molecularocho de los neuropéptidos bajó en los valores de recuperación in vitro, la diálisis de compuestos en el rango inferior (hasta 500 Da) de pesos moleculares no tiene gran impacto en la tasa de recuperación en vitro. El presente método permite la utilización de una membrana de diálisis con otro valor de corte y material de la membrana. Por lo tanto, este conjunto de la sonda a medida tiene la ventaja de la flexibilidad suficiente para dializar sustancias en una gama amplia de peso molecular. Aquí, se introduce una sonda de microdiálisis con una longitud de intercambio de 2 mm, que es aplicable para microdiálisis en regiones del cerebro de ratón y rata. Sin embargo, las dimensiones de la sonda se pueden adaptar fácilmente para longitudes de cambio más grandes para ser utilizado en animales más grandes.

Introducción

La microdiálisis es una técnica muy utilizada en la investigación en neurociencias. Durante los últimos 50 años, la técnica de microdiálisis mínimamente invasiva ha sido mejorada continuamente para convertirse en un método bien establecido para monitorear las concentraciones locales de compuestos de bajo peso molecular en el espacio extracelular. Casi cada fluido del tejido intersticial puede ser investigado en animales con libertad de movimientos.

Gaddum introdujo la técnica de vaivén en la década de 1960. Se modificó un enfoque de Feldberg et al. En la que tubocurarina se perfundió a través de una cánula termina en el ventrículo lateral y recoger el efluente también a través de una cánula ^1. Gaddum desarrolló la técnica de vaivén en el que se implantó una cánula que consta de dos agujas de acero concéntricos en áreas del cerebro distintas y perfundido por una solución mientras se quita de forma simultánea los neurotransmisores liberados por las neuronas que rodean la punta ^2. Desafortunadamente, dama de tejidoge causada por la cánula alrededor de la punta limita la aplicación de este método. Como un avance adicional de este método, Bito y compañeros de trabajo introdujeron un método de la bolsa de diálisis en el que la solución recogida se separó del tejido circundante por una membrana de diálisis. Se implantaron un saco de diálisis en el tejido subcutáneo de los cuellos de perro. El contenido de la bolsa de diálisis es libre de proteínas y podría analizarse muchas semanas más tarde para los iones y aminoácidos ^3. El siguiente desarrollo fue el dialytrode, una sonda de microdiálisis primitivo, que originalmente fue descrito por Delgado en 1972 ^4. Finalmente, Ungerstedt y colegas mejoró el diseño de sonda de microdiálisis de modo que era más pequeño y menos tejido desplazado ^5.

Una sonda de microdiálisis concéntrico comporta de manera similar a un capilar de sangre. El sistema está constantemente perfundida por una solución con la composición iónica del fluido tejido circundante mientras que carecen del analito de interés. The membrana de diálisis expuesta a la disolución o tejido externa es semi-permeable. Se permite la difusión pasiva de las sustancias en la sonda a lo largo de su gradiente de concentración ^6. La permeabilidad depende de muchas variables tales como el peso molecular, forma, carga y pH del compuesto. También está limitado debido a las propiedades del material de la membrana, tamaño de poro de la membrana y la tasa de ⁷ fluir.

Las figuras 1 y 2 muestran una sonda de microdiálisis concéntrica. El líquido de perfusión entra a través de un tubo de entrada en el manguito de metal, que rodea la sílice fundida. Dentro de la funda de metal, que fluye a lo largo de la sílice fundida y lo deja en la punta. En el espacio entre la membrana de diálisis y el politetrafluoroetileno (PTFE) -tubing (tal como Teflón) el fluido de perfusión a continuación, fluye hacia arriba. Aquí, la difusión de sustancias desde el tejido se produce que rodean la membrana. El dializado sale de la sonda a través de la PTFE-tubo, que está conectado al tubo de salida y se puede recoger.

La técnica de microdiálisis tiene varias ventajas con respecto a otros en técnicas in vivo. La sonda constituye una barrera física con el resultado de que el dializado no contiene enzimas o células. Por lo tanto, no hay necesidad de purificación del eluato antes del análisis, y no la degradación enzimática de los analitos se lleva a cabo. La degradación oxidativa puede ocurrir durante el paso de analitos en el tubo, pero esto a menudo puede ser evitado mediante la adición de un antioxidante (por ejemplo, ácido ascórbico) al perfundido. Alternativamente, el daño oxidativo a neuropéptidos, por ejemplo, se suprimió de manera eficiente mediante la sustitución de la tubería de salida con una punta para recoger el dializado ^8. El dializado se puede investigar directamente con casi cualquier tipo de método analítico y múltiples analitos se pueden recoger de forma simultánea. Este sistema puede ser utilizado en animales despiertos, y casi todas las regiones del cerebro puede serexaminado. Por otra parte, la infusión de medicamentos a través de la sonda es posible (retrodialysis). Sin embargo, también hay limitaciones de la técnica de microdiálisis. El tiempo de resolución algo baja no proporciona información en tiempo real sobre los cambios de neurotransmisores. Debido a que es una técnica invasiva, la implantación de la sonda provoca trauma quirúrgico y la anestesia, que puede afectar a las concentraciones de neurotransmisores, se requiere durante este paso ^7,9,10.

La concentración del compuesto en el dializado comprende sólo una pequeña cantidad de la concentración del compuesto real en el líquido extracelular. Para el cálculo de la concentración de compuesto desconocido en el líquido extracelular, relativa recuperación in vitro tiene que ser calculado. Determinación de la relación individuo en recuperaciones in vitro para cada sonda y cada compuesto es necesario antes de comenzar el experimento in vivo. Para este propósito, la sonda se sumerge en una solución que contiene elanalito de interés mientras que el fluido de perfusión es la misma solución que carece del analito de interés. Después de la determinación de concentraciones de compuesto en el dializado, esta información tiene que ser refiere a su concentración en el fluido circundante. En vitro determinaciones de recuperación de varias sustancias se pueden implementar simultáneamente ^9.

Muchos grupos de investigación neurociencia utilizan la técnica de microdiálisis para investigar los neurotransmisores y metabolitos en el espacio extracelular de las áreas del cerebro distintas. Por lo tanto, las sondas comerciales tienen una gran demanda en el entorno de la investigación en neurociencias. Una gran ventaja de las sondas disponibles comercialmente es la fiabilidad funcional alta. El montaje experimental para sondas comerciales está bien establecido y validado para muchos neurotransmisores y metabolitos conocidos. Sin embargo, mientras que el equipo de microdiálisis disponible comercialmente es caro y tiene menos flexibilidad en la aplicación ^11, en ​​THes trabajar un conjunto de sonda de microdiálisis se presenta en detalle, que puede adaptarse a cualquier aplicación y puede ser fabricado por menos de 10 dólares. Esta sonda a medida es una sonda de microdiálisis concéntrica probado para las investigaciones en diversas áreas cerebrales ^8.

En recuperaciones de sonda in vitro de sustancias con peso molecular diferente (gama de 100-1,600 Da) y se comparan con diferentes propiedades fisicoquímicas. Determinación in vitro de recuperación de la glucosa, el lactato y la acetilcolina con un peso molecular inferior a 200 Da, ATP con un peso molecular de aproximadamente 500 Da y el neuropéptidos de la angiotensina II, la sustancia P y la somatostatina con un peso molecular por encima de 1.000 Da se realiza.

Protocolo

1. Preparación de PTFE-tubing

1. Acortar PTFE tubo en 2,5 cm pieza. Utilice un papel escala para estimar las dimensiones físicas. (Véase la figura 3a)
2. Cortar un final en un ángulo para facilitar la conexión de la tubería de salida. (Véase la figura 3a)
3. Roughen PTFE de la tubería mediante el uso de papel de lija para permitir adherencia de la cola epoxi.

2. Preparación de sílice fundida

1. Acortar sílice fundida en 2,25 cm pieza. (Véase la figura 3a)

3. Inserción de la sílice fundida en el tubo de PTFE

1. Inserte una cánula G 30 en la fibra PTFE hueco para perforar a una distancia de 1 cm desde el extremo plano. Doble el PTFE de la tubería para simplificar el proceso. (Véase la Figura 3b)
2. Inserte la sílice fundida en el tubo de PTFE utilizando la cánula como orientación. (Véase la Figura 3c)
3. Retire con cuidado la cánula y asegurar la sílice fundida. (VerFigura 3d)
4. La sílice fundida se supone proyectar 5 mm en el extremo plano. (Véase la Figura 3e)
5. Pegue la sílice fundida en su lugar en el sitio de la punción por el pegamento de cianoacrilato y deje que se endurezca durante la noche. (Véase la Figura 3e)

4. Preparación de Epoxy Glue (pegamento de dos componentes)

1. Añadir 30 partes de endurecedor amarilla a 70 partes de pegamento epoxi negro con la ayuda de una aguja fina y mezclar suavemente. Es directamente listo para usar.

5. La aplicación de la membrana (Todos Otros pasos deben realizarse bajo el microscopio y un Libro de escala se utiliza para estimar Dimensiones físicas)

1. Tire de la membrana de polisulfona con cuidado sobre la sílice fundida, a continuación, tire de la membrana hacia el tubo de PTFE y ajustar la membrana de 5,5 mm con un bisturí afilado. (Véase la Figura 3f)
2. Establezca un punto marcado en la membrana con una fina pluma para definir la longitud de cambio de 2 mmdesde el extremo de la membrana.
3. Aplicar una pequeña cantidad de pegamento epoxi para cubrir la punta de la membrana con la ayuda de una aguja fina. (Véase la Figura 3g)
4. Cierre de la articulación entre la membrana de diálisis y fibra de PTFE con la ayuda de la misma aguja fina que se usa en el paso 5.3) con el pegamento de epoxy. (Véase la Figura 3g)
5. Añadir suficiente pegamento epoxi sobre la membrana hasta el punto marcado para asegurar una longitud intercambio de 2 mm. Deje que se endurezca durante la noche. (Véase la Figura 3g) antes de la determinación de la longitud de intercambio, la membrana es 5,5 mm. Después de aplicar el pegamento epoxi sobre la membrana, solamente 2 mm de la membrana está disponible para la difusión.

6. La aplicación de la manga del metal

1. Cortar una aguja de 25 G en pedazos manga metálica 1 cm con ayuda de unas pinzas de flexión.
2. Tire del 1 cm manguito de metal (25 G) sobre la parte restante de la sílice fundida. El manguito de metal más tarde permite la conexión de la tubería de entrada con el MICRODIAsonda de lisis. (Véase la Figura 3h)
3. Selle conjunta entre el manguito de metal y PTFE-tubo con el pegamento epoxi restante. Deje que se endurezca durante al menos 24 horas. (Ver Figura 3i)
4. La aplicación de pegamento caliente alrededor de la bifurcación de la sonda para la fijación y estabilización adicional.
   NOTA: El volumen interno de entrada de la sonda es 0.045 l y el volumen interno de salida es 2,5 l. Por lo tanto, con una velocidad de flujo de 1 l / min, se tarda aproximadamente 2,5 min después de conectar el tubo de entrada para iniciar la recogida del dializado. Con el presente protocolo, el procedimiento de montaje de la sonda produce sondas de microdiálisis que son el 95% de confianza.

7. Realización de experimentos in vitro de recuperación

1. Sumergir la sonda con un punto de corte de 30 kDa y una longitud intercambio de 2 mm en una solución madre de compuesto de LCRa que contiene glucosa 1 mM y 1 mM de lactato y, en un experimento separado, en un CSF que contiene 100ATP nM y 100 nM acetilcolina.
2. Perfundir las sondas con LCRa. Establecer caudal de 1 l / min y llevar a cabo experimentos a temperatura ambiente (22 ° C). Permita que las sondas se equilibren durante 1 hora en la solución madre, y recoger las muestras cada 30 minutos después y se almacena a -80 ° C hasta su medición.
3. Para el cálculo de las recuperaciones in vitro, comparar las concentraciones de analitos en los dializados con las concentraciones de analito conocidas en la solución madre. Expresar los resultados en porcentajes de concentración de la sustancia en el dializado frente a solución madre.

Resultados

La sonda de microdiálisis a medida concéntrica consta de una membrana de polisulfona con un corte molecular de 30 kDa. El conjunto de la sonda se ilustra en la Figura 3.

Se exhibió una recuperación in vitro para la glucosa metabolitos pequeña de energía (180,16 Da) y lactato (112,06 Da) de 19,10 ± 1,2% y 21,2 ± 1,6%, respectivamente. Para la acetilcolina cargado positivamente con un peso molecular de 181,66 Da, que mostró un valor de in vitro de recuperació...

Discusión

La Figura 3 muestra un conjunto de sonda ejemplar. Cotas de diámetro interior y exterior Corregir tienen que ser cuidadosamente monitorizados por tubo (OD 1,6 mm; ID 350 micras), sílice fundida (OD 105 m; ID 40 micras) y la membrana de diálisis (OD 245 m; ID 210 micras). También es importante mantener un espacio entre la membrana y la sílice fundida de (105 m) y entre la membrana y el tubo (105 micras) también. Si los valores son diferentes, la presión en la sonda puede elevarse y producir la pérdida de...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Pegamento epoxi	SunChrom GmbH, Fiedrichsdorf, Alemania
Sílice fundida ID 40 y micro; m OD 105 y micro; m	Ziemer-Chromatographie, Mannheim, Alemania	Art. Nº: 6.040105
Membrana de polisulfona (filtro de hemodiálisis FX Cor Diax 600)	Fresenius Medical Care AG & Co. KGaA, Bad Homburg, Alemania	REF: F00001593
Pegamento de cianacrilato (Pattex® superglue plastic)	Henkel AG&Co. KGaA, Dü sseldorf, Alemania
Tubo de teflón 1,6 x 0,35 mm	SunChrom® GmbH, Friedberg, Alemania	Art. Nº: 969-195.219
Bisturí (Feather® Cuchilla quirúrgica n.º 10)	pfm medical ag, colonia, Alemania	Art. No: 07310
Microscopio	MEIJI Techno	EMZ-8TR
Cánula de 30 G x 11" (0,3 x 25 mm); Sterican® Z	B.Braun Melsungen AG, Melsungen, Alemania	REF: 9324500
Cánula de 25 G x 11/2" (0,5 x 40 mm) 100 Sterican®	B.Braun Melsungen AG, Melsungen, Alemania	REF: 9186166
Bolígrafo fino (Stabilo point 88 fine 0.4)	Schwan-STABILO Schwanhä uß er GmbH & Co. KG	Art. No: 88/36
Pegamento caliente  (Barras de pegamento ULTRA Power x 11 mm)	Steinel® GmbH, Herzebrock-Clarholz, Alemania	Art. No: 4007841046910
Papel de lija P60 230 x 280	Robert Bosch GmbH, Gerlingen-Schillerhö he, Alemania	Número de catálogo: 2608605397