Un Sistema organotípicos de alto rendimiento para la Caracterización de la sensibilidad a los fármacos de las células del mieloma múltiple primaria

Resumen

Describimos un ensayo de sensibilidad a fármacos de alto rendimiento para células primarias de mieloma múltiple. Consiste en una reconstrucción del microambiente de la médula ósea (incluyendo matriz extracelular y estroma) en placas de pocillos múltiples, y un método no invasivo para la cuantificación longitudinal de la viabilidad celular.

Resumen

En este trabajo se describe un nuevo método que combina ensayos ex vivo de sensibilidad de drogas y análisis de imágenes digitales para estimar quimiosensibilidad y heterogeneidad de mieloma múltiple las células derivadas del paciente (MM). Este enfoque consiste en la siembra de células MM primarias recién extraídos de aspirados de médula ósea en las cámaras de microfluidos implementadas en placas de múltiples pocillos, cada uno compuesto de una reconstrucción del microambiente de la médula ósea, incluyendo la matriz extracelular (colágeno de la membrana basal o matriz) y el estroma (el paciente células madre mesenquimales derivadas) o células endoteliales derivadas de seres humanos (HUVEC). Las cámaras están drogados con diferentes agentes y concentraciones, y se crean imágenes de forma secuencial durante 96 horas a través de la microscopía de campo claro, en un microscopio motorizado equipado con una cámara digital. Software de análisis de imagen digital detecta células vivas y muertas de la presencia o ausencia de movimiento de la membrana, y genera curvas de cambio en la viabilidad como una función of concentración del fármaco y el tiempo de exposición. Usamos un modelo computacional para determinar los parámetros de la quimiosensibilidad de la población tumor para cada fármaco, así como el número de sub-poblaciones presentes como una medida de la heterogeneidad tumoral. Estos modelos adaptados al paciente se pueden utilizar para simular los regímenes terapéuticos y estimar la respuesta clínica.

Introducción

El objetivo de este método es caracterizar la sensibilidad a los fármacos de mieloma múltiple (MM) células primarias a un panel de agentes ex vivo, lo más cerca posible a las condiciones fisiológicas, y con suficiente precisión que estos resultados se pueden utilizar para identificar quimiorresistente sub- poblaciones dentro de la carga tumoral y, en última instancia, para parametrizar modelos computacionales diseñados para estimar la respuesta clínica.

Los modelos computacionales son herramientas poderosas para analizar sistemas complejos, como las interacciones huésped-terapia del cáncer. Sin embargo, los modelos sólo son tan b....

Protocolo

El uso de células humanas derivadas de biopsias que se describen a continuación fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional de Moffitt y llevó a cabo en el marco del ensayo clínico MCC # 14745 realizado en el Centro de Cáncer H. Lee Moffitt y el Instituto de Investigación.

1. Clasificación de las células MM de Médula Ósea aspirados

1. Recoger aspirados de médula ósea (20 ml) de pacientes en la jeringa de heparina de sodio.
2. Aislar las células mononucleares por centrifugación ósea diluido (1: 1 con PBS estéril) sobre un gradiente de centrifugación medio acuoso estéril a 400 xg durante 30 min a temperatura ambiente.....

Resultados

El flujo del experimento se describe brevemente en la Figura 1 Si todos los pasos se han completado con éxito, las imágenes obtenidas por el microscopio debe ser equivalente a la Figura 2:. Viven células MM deben verse claramente discos tan brillantes y BMSCs o HUVECs deben ser apenas visible y bien distribuida en el fondo. Como se ve en la Figura 2A, las células MM varían en tamaño de un paciente a otro, pero en general son más pequeños que las líneas celulares. Puesto.......

Discusión

En resumen, este es un método potente rendimiento y alta para cuantificar la quimiosensibilidad de las células MM primarias y farmacodinámica ex vivo de fármacos en una reconstrucción de la médula ósea. Los pasos críticos dentro de este protocolo son la siembra adecuada de los pozos y centrándose adecuada (véase la Figura 2 para los resultados esperados): asegurar que las células estromales MM y se distribuyen de manera uniforme, que las células estromales son adherentes a la parte inferior del.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Microscopio digital EVOS FL AUTO	AMG	AMAFD1000 + AMC1000	equipado con platina motorizada e incubadora de sobremesa.
Placa de 384 pocillos CellBind	CORNING CLS3683	SIGMA	Corning Placas de 384 pocillos Placa de 384 pocillos, poliestireno, superficie CellBIND, estéril, transparente de fondo plano, negro, con tapa
Placa de 1.536 pocillos CellBind	CORNING	CLS3832 ALDRICH	Corning Placas de 1.536 pocillos, base baja, tratamiento de superficies CellBIND, estéril
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	GE17-1440-02 SIGMA	Para el aislamiento in vitro de linfocitos de sangre periférica humana.
Cuentas magnéticas CD138	Miltenyi	130-051-301	Perlas magnéticas conjugadas con anticuerpos para la selección de células CD138+.
Columnas LS	Miltenyi	130-042-401	Columna para separación de células.
Separador MidiMACS	Miltenyi	130-042-302	Imán para columna de separación.
Matrigel	Sigma-Aldrich	E6909 SIGMA	ECM Gel de Engelbreth-Holm-Swarm sarcoma murino
Getrex	Life Technologies	A1413201	Matriz de membrana basal de factor de crecimiento reducido sin LDEV
HUVEC	Life Technologies	C-003-25P-B	Células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC
RPMI-1640 medios	GIBCO	11875-093	RPMI 1640 Medio + L-Glutamina + Rojo Fenol
FBS Inactivado por calor	GIBCO	10082-147	Suero fetal bovino, certificado, inactivado por calor, origen
3,1 mg/ml Colágeno bovino tipo I	Advanced Biomatrix	5005-B Solución de	colágeno bovino, tipo I, 3 mg/ml, 100 ml
Precision XS	BIOTEK	PRC3841	Sistema de pipetas robóticas

) estadounidense