Introduction
Andning är en komplex och viktig näring styrs av hjärnan, vilket gör dioxygen (O 2) upptag och koldioxid (CO 2) eliminering. Den centrala andningsdrift genereras av ett komplext nätverk som ligger i hjärnstammen i både däggdjur 1, amfibier 2, reptiler 3, fåglar 4 och fiskar 5. Även om studien av andning kan bearbetas in vivo, precisa mekanistiska undersökningar kräver direkt tillgång till andningsnätverksstyrning. För detta ändamål, Adrian och Buytendijk utvecklat en reducerad beredning guldfisk, där elektroder placeras på hjärnstammen ytan posten den genererade rytmen i samband med gill ventilation 5. Detta tillvägagångssätt anpassades därefter av Suzue 1984 6 för användning hos nyfödda gnagare. Tillkomsten av detta preparat har lett till betydande framsteg i andnings neurobiologi. Eftersom det är relativt enkelt, den teknik som presenteras here är mottaglig för ett brett spektrum av grundläggande undersökningar av rytmiska motor beteenden och deras ursprung hos nyfödda gnagare.
Det övergripande målet med denna metod är att registrera neurala korrelat av inandnings aktivitet, en så kallad andningsliknande rytm fiktiva andning, som produceras av andnings nätverket. Denna metod kan användas i ett brett spektrum av forskningsmålen, med inriktning inandnings svar på respiratoriska variationer eller farmakologi i både vilda typ 7 och transgena 8 djur. Med tanke på att experimenten utförs vid låg temperatur, utan sensoriska afferenter, och under förhållanden där koncentrationerna av glukos och O2 inom aCSF är höga, har frågor väckts om den fysiologiska relevansen av signalen registreras. Även om det finns tydliga skillnader mellan in vivo och in vitro-förhållanden (t.ex.., Frekvensen av inandnings skurar) kvarstår det faktum att förekomsten avde centrala delarna av andnings nätverket 6 gör det möjligt att studera en robust rytm associerad med en vital homeostatisk funktion 9,10.
Den logiska grunden bakom utvecklingen och användningen av denna teknik är att underlätta direkt tillgång till hjärnstammen elementen i andnings nätverket, som är knappast tillgängliga in vivo, speciellt i nyfödda. Hjärnstammen placeras under strängt kontrollerade betingelser: den inspelade rytm inte moduleras av perifera afferenta input från lungorna eller hals organ, vilket gör studien att fokusera på central andnings själva enheten 11. Således är denna tillgång utnyttjas för att tillämpa stimuli och registrera utsignalen. I motsats till pletysmografi inspelningar, är andningsrytm modul av alla dess komponenter i hela kroppen (t ex., Lung buk, perifera kemosensorer), vilket gör det svårt att tillämpa exakta stimuli.
I enewborn råtta, protokollet består av registrering av fjärde ventrala roten signal på en isolerad hjärnstam och en stympad ryggmärg, hålls i artificiell cerebrospinalvätska (aCSF). Rytmen genereras av hjärnstammen-ryggmärgen förberedelser består av enskilda långsamma skurar som är kopplade till inandnings signalen 9. Isolerade hjärnstammen-ryggmärg preparat lätt inspelningsbara hos råttor från postnatal dag 0-4 (P0 - P4) 7. Denna metod används ofta för att utvärdera den hypoxiska svaret hos andnings nätverket och också svaret på hyperkapni, acidos eller droger. En akut syrebrist protokollet presenteras här. Denna stimulering erhålles genom indragning av O 2 i aCSF; denna metod används ofta för att bedöma tolerans och lyhördhet för hypoxiska förolämpningar. Protokollet inducerar en rytm depression från första minuten till slutet av hypoxi exponering (Figur 1) 12. Denna fördjupning är omvändunder efter hypoxisk återhämtning 12. När det gäller experimentell design, är det viktigt att märka att pons, som ligger vid den rostrala delen av hjärnstammen, har en hämmande verkan på rytmgeneratorn 8. Således, beredningar av hela hjärnstammen och rostralt ryggmärgen visa ett lägre rytm. Inkludering av hjärnbryggan i det isolerade provet för inspelningen bestäms enligt målet av experimentet 13; studiet av pontina inflytande på förlängda märgen nätverket skulle kräva inspelningar med och utan pons att jämföra resultaten 14. Dessutom är en av fördelarna med denna teknik möjligheten att utvidga rostralt del av förberedelserna för att inkludera mesencefal och / eller diencephalic regioner 15,16, vilket gör det möjligt att bedöma effekten av dessa regioner på ponto-medullär andnings nätverk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denna metod kräver användning av djurpatienter, tillåts av Laval University Animal etikkommitté (protokoll # 2012-170).
1. Inställningar och förberedelse
- Lösningar
- Bered aCSF stamlösningar i enlighet med följande recept 7,17. Andra recept med variationer koncentrations finns i litteraturen. Butiksstamlösningar vid 4 ° C i upp till en månad.
- Salt lösning: tillsätt 75,39 g NaCl (129 mM slutlig); 2,5 g KCl (3,35 mM slutlig); 0,81 g NaH2PO4 (0,58 mM slutlig); 2,33 g MgCl2 (1,15 mM slutlig); 1,85 g CaCl2 (1,26 mM). Lös i 800 ml destillerat vatten och sedan fyll till 1 L med destilleras vatten.
- Bikarbonatlösning: till 17,65 g NaHCO 3 (21 mM slutlig). Lös i 900 ml destilleras vatten fyll till 1 L med destillerat vatten. Variationer av bikarbonatkoncentrationen kommer att resultera i pH-variationer.
- Glukoslösning: tillsätt 54,06g glukos (30 mM slutlig). Lös i 400 ml destilleras vatten fyll till 500 ml med destillerat vatten.
- Förbered aCSF genom att späda 100 ml saltlösning, 100 ml vätekarbonatlösning och 50 ml glukoslösning i 1 L destillerat vatten. Förvaras vid 4 ° C fram till användning.
- Förbered en glaselektrod genom att värma och sträcka ett glasrör tills den går sönder. Slipa spetsen före användning. Elektroden kan återanvändas många gånger så länge som den förblir ren.
- Bered aCSF stamlösningar i enlighet med följande recept 7,17. Andra recept med variationer koncentrations finns i litteraturen. Butiksstamlösningar vid 4 ° C i upp till en månad.
- Experimentuppställning
Obs: uppsättnings detaljer presenteras i figur 2.- Slå på förstärkaren, flytta medelvärdesbildare, datainsamlingssystem, temperaturkontroll och pump. Kontrollera signalförstärkning (vinst = 10 tusen), varvid filtreringen (låg tröskel, 10 Hz; hög tröskel, 5 kHz), och samplingsfrekvensen för analog-till-digitalomvandling av råsignalen (2,5 kHz).
- Fyll en flaska med aCSF och bubbla den med karbogen (95% O 2 5% CO2). Inducerar en bubbled- och värmas-aCSF flöde i inspelningen kammaren (volym 5 ml) vid 4 ml / min. Håll temperaturen i inspelningen kammaren vid 26 (± 1) ° C. pH bör vara 7,4 i dessa standardvillkor.
- Håll 50 ml RT och carbogen-bubblade aCSF i en 50 ml spruta nära dissektion kammaren.
- Slå på datorn och starta programmet inspelningen.
2. Dissektion
- Väg och visuellt avgöra könet på djuret (hanar har en längre ano-genitala avstånd, medan honorna har en kort ano-genitala avstånd, män könsorgan är ofta mörka medan kvinnliga könsorgan är rosa).
- Söva de nyfödda gnagare med ett av följande alternativ: cryoanesthesia (helt fördjupa djuret i is under 4-5 min 18), injektion (equitensine på 4 ml / kg) 19 och inandning av flyktiga anestetika (isofluran 20 eller eter 21). Konrm en tillräcklig plan av anestesi genom frånvaro av en tassbortdragningsreflex.
- Placera djuret på bänken, ventrala nedåt. Avsnitt rostralt delen av huvudet koronalt med en skalpell på bregma nivå (synliga genom huden och skallen). Utför detta steg omedelbart efter det att djuret bedövas.
- § kroppen koronalt med en skalpell under främre medlemmar.
- Ta bort hud, muskler, fettvävnad och viscus med kirurgiska och tunna saxar och tänger. Eftersom ben är mjuka i denna ålder, vara försiktig att inte skada nervsystemet. Utför det här steget på bänken.
- Placera preparatet i dissekering kammaren. Använd aCSF lagras i sprutan att syre beredningen. Från denna punkt till slutet av inspelningen, använder ett mikroskop.
- På ryggsidan av preparatet, skär skallen och kotorna från rostralt till den näst sista delen längs mediet axeln med kirurgiska och tunna saxar och tänger. Öppna cut skallenoch kotorna för att exponera nervvävnad. Använd aCSF strored i sprutan att syre beredningen.
- Med tången, ta bort araknoidala membranen, ett tunt vävnads täcker ytan på nervvävnaden. Behåll pia mater och blodkärl mot nervvävnaden. Använd aCSF lagras i sprutan att syre beredningen.
- Placera preparatet med rygg vänd nedåt, och försiktigt föra ned hjärnstammen och ryggmärgen genom att skära nerver och bindväv med saxen medan du håller förberedelserna på plats. En dorsala tillvägagångssätt är också möjligt. Håll rötterna och nerver så länge som möjligt. Avlägsna benen för att isolera hjärnstammen och ryggmärgen. Använd aCSF lagras i sprutan att syre beredningen.
- Ta bort lillhjärnan och resterande rostralt strukturer genom sektionering dem med skalpell. Använd aCSF lagrad i nålen för att syresätta beredningen.
- Eventuellt beroende på experimental design, ta bort pons med skalpellen med en coronal sektion anterior till sämre cerebellar artären 22. Lägg märke till att hålla hela pons kommer att sakta ner rytmen hos råttor och till fullo hämma den hos möss. Preparat som innehåller endast den bakre delen av pons visar en andnings-liknande aktivitet med en stabil frekvens på C4 roten.
3. Inspelning
- Placera preparatet i inspelningen kammare, ventrala uppåt. Fäst beredning med stiften i den lägsta delen av ryggmärgen och rostralt-mesta delen av hjärnstammen.
- Med användning av en spruta kopplad till elektroden genom dess nål, inducera en fördjupning i elektroden (glas spetsdiameter: 150 - 225 ^ m) genom att dra ut sprutkolven, för att delvis fylla elektroden med aCSF.
- Med hjälp av en mikromanipulator försiktigt placera elektroden nära en av de fjärde ventrala rötter. Andra ventrala rötter kan också presentera en respiratorisk-liknande aktivitet (e.g., XII kranialnerven, C1 ventrala roten).
- Inducera en fördjupning i elektrodbehållaren via sprutan genom att dra ut kolven för att försiktigt aspirera nerv RÖTTER. Sedan försiktigt flytta elektroden för att tillämpa den mot ryggmärgen.
Notera: Helst storlek RÖTTER matchar storleken av elektrodöppningen och sålunda skapar en tätning mellan de inre och yttre avdelningar av elektroden. Eftersom differentialförstärkare används vanligen för sådana inspelningar varje öppning mellan insidan av elektroden och inspelningen kammaren minskar signalkvaliteten och gör det svårt att eliminera bakgrundsljud. - Starta inspelningen.
- Registrera den rytm som produceras genom beredningen enligt normoxiska förhållanden (dvs., aCSF bubblades med karbogen: 95% O2 och 5% CO2) under minst 20 min för att bestämma utgångsvärdet hos beredningen.
- Växla perfusion från karbogen-bubblade aCSF tillstimulans aCSF (dvs., bubblades med 95% N2 och 5% CO2 under hypoxi stimulus) under 15 minuter. Ändra exponeringstid beroende på det experimentella protokollet. Anteckna exponeringstid på inspelningen och djurdatablad. Använd rör av rostfritt stål mellan aCSF flaskan och kammaren när det är möjligt att undvika gasdiffusion till utsidan av röret.
- Växla perfusion tillbaka till standard carbogen-bubblade aCSF under minst 15 minuter för en återhämtning inspelning. Registrera detta på inspelningen och djurdatablad.
- Avsluta inspelningen.
4. Statistisk analys
- Från den integrerade signalen, beräkna frekvensen som antalet skurar per minut (uttryckt i skurar / min), amplituden som skillnaden mellan baslinjen och toppen av skuren (uttryckt i mV), skurlängden som varaktigheten från början till slutet av skuren (uttryckt i s), skurområdet som arean under curve av skuren på den integrerade signalen (uttryckt i mV-s) (Figur 3).
- Beräkna frekvens, amplitud, brast varaktighet och brast området under normoxisk (baslinje), hypoxisk (stimulus) och efter hypoxiska (efter stimulus) återvinningsförhållanden som genomsnittet av de sista 5 min av inspelningarna för varje tillstånd. Analyserar inte den första delen av varje tillstånd eftersom det finns en fördröjning mellan att växla perfusion och aCSF homogenisering i inspelningen kammaren.
- Uttryck sedan stimulus (dvs., hypoxi) och post-stimulus (dvs., efter-hypoxiska) återvinningsvärdena i procent av baslinjevärdena för motsvarande inspelning. Uttryck resultaten som medelvärden ± SD
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Såsom nämndes i inledningen, är en av de viktigaste fördelarna med denna teknik den direkt tillgång till hjärnstammen att tillämpa olika stimuli. Som ett exempel, var hypoxi tillämpas här. Figur 1. AB uppvisar en komplett protokoll inspelning, med både normoxiska och hypoxiska förhållanden. Figur 1.CE visar rytmen inspelad i normoxiska förhållanden (dvs, aCSF bubblade med 95% O2 och 5% CO2 vid 26 ° C). Såsom tidigare visats i denna specifika preparat 11, är frekvensen ca 8 skurar / minut, och amplituden är omkring 0,800 mV. Observera att amplituden är endast indikativa på grund av dess viktiga interberedningsvariationer. Den övre kurvan representerar den integrerade signalen medan den undre kurvan representerar råsignalen. Figur 1.DF visar rytmen inspelad i hypoxiska förhållanden (dvs.., ACSF bubblade med 95% N2 och 5% CO <sub> 2 vid 26 ° C). Som tidigare kännetecknat 23, minskat dramatiskt frekvensen under hypoxi. Figur 1.GH visar en enda serie som visar typiska mönster i normoxiska och hypoxiska förhållanden.
Figur 1. Exempel på inspelningar som erhållits från hjärnstammen-ryggmärg Förberedelser. Andnings Effekt mätt från C4 ventrala roten av preparat från P4 råttor under normoxisk, hypoxisk och efter hypoxiska återvinningsförhållanden ((A) integrerad signal- och (B) råsignal) . För varje tillstånd, förstorade inspelningar ((C) integrerade normoxisk signal, (D) integrerade hypoxisk signal, (E) rå normoxisk signal, (F) rå hypoxisk signal) och enda serie ((G) normoxisk burstoch (H) hypoxisk burst) visas. Som nämns i texten, observera att amplitud måste tolkas med försiktighet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. sammanställning Schema i Setup. Det bubblade aCSF värms och skickas med en pump i inspelningen kammaren. aCSF överskott i inspelningen kammaren sugs med en pump och kasseras. Registreringskammaren är kopplad till marken och temperaturreglaget. Elektrod utgång direkt förmedlas till förstärkaren, sedan till den rörliga medelvärdes och datainsamlingssystemet, och slutligen datorn. Klicka här to se en större version av denna siffra.
Figur 3. Analyserat Burst parametrar. Frekvensen beräknas som antalet skurar per minut (uttryckt i skurar / min), amplituden som skillnaden mellan baslinjen och toppen av skuren (uttryckt i mV), skurlängden som varaktigheten från början till slutet av skuren (uttryckt i s), skurområdet som området under kurvan för skur på integrerade signalen (uttryckt i mV · s). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Exakt kvantifiering av andningsaktivitet kan vara en utmaning. I själva verket är andningen en funktion som kan vara både automatisk och frivilliga, och det regleras i enlighet med miljön, kroppens behov, känslomässiga tillstånd och beteende. Fördelen med denna teknik är isoleringen av de neurala element som är ansvariga för att producera respirations kommandot. Således, elektrofysiologiska inspelningar av hjärnstammen-ryggmärgen förberedelser och pletysmografi är kompletterande tekniker för att studera hela neuronala andnings nätverk in vitro och in vivo, respektive. Patch-clamp inspelningar i hjärnstammen-ryggmärgen preparat (t ex., Närmar sig från ventrala yta) är också tänkbara och möjliggöra studier av en viss neuron i en bevarad andnings nätverk 24.
Detta protokoll innehåller några viktiga steg, främst i dissekering. För att undvika nervvävnadsskada,alla dissektion steg bör utföras snabbt och exakt. Nervvävnaden får inte skadas och noggrant bevaras genom konstant nedsänkning i aCSF. Såsom tidigare nämnts, är kvaliteten på anslutningen mellan nerv RÖTTER och elektroden ett andra kritiskt steg. Aspiration av RÖTTER kan föra elektroden närmare beredningen. Medan kontakten mellan elektroden och hjärnstammen kan förbättra kvaliteten hos tätningen, måste man undvika att göra en fördjupning eller skadas fysiskt preparatet.
Den integrerade signalen ska alltid användas för analys, men råsignaler kan vara användbart för att skilja riktiga skurar från bakgrundsbrus. Dessutom kan en högtalare läggas till inställnings att lyssna på rytmen och bestämma signalkvaliteten och bakgrundsbrus närvarande genom audition. I själva verket kan vissa variationer i bakgrunden baslinjen vara närvarande på grund av elektriska störningar och orsakar en instabil baslinjen. Sådan Interfrenser bör förhindras genom att kontrollera kabelanslutningar och rot sugning av elektroden. Dessutom, på grund skur amplitud är beroende av både bakgrundsbrus och förbindelsen mellan roten och elektroden, är frekvensen en mycket av en pålitlig parameter. Därför bör skur amplituden alltid uttryckas i procent av utgångsvärden för att undvika interindividuella variationer på grund av installationen.
Begränsningar av tekniken bestäms av en ålder av djuret från vilket preparatet kan realiseras. Detta möjliggör en exakt studie av inrättandet av den centrala andningsdrift vid födseln, vilket är mycket intressant och kliniskt relevant, men det är inriktat på dessa tidiga åldrar och kan inte utvidgas till att omfatta senare åldrar. Högre åldrar kan användas i arteriellt perfuserade arbetande hjärthjärnstams preparat 25, men med betydande protokoll modifikationer (se nedan). En isolerad hjärnstammen-ryggmärgen förberedelser från vuxna marsvin har varit att utvecklaed av et al. Morin-Surun 26, i vilken hjärnstammen är perfusion via basilar artären och rytmen registreras i XII kranialnerven. En annan begränsning är experimentets varaktighet. Beredningen kan inte sparas i mer än 7 timmar i de tidigare beskrivna villkor 6. Därför är denna teknik inte är lämpligt för långtidsförsök, även om förberedelserna från grodyngel (se nedan) har hållits 24 timmar i laboratoriet.
Olika modifieringar kan tillämpas på denna teknik. Här har hypoxisk utmaning utförts, men andra gaser varianter är tänkbara (t.ex.., Hyperkapni 27 samt pH-variationer 28). På samma sätt, kan beredningen perfusion med aCSF i vilken läkemedel har upplösts och applicerades på hjärnstammen som en förbehandling 29 eller under 30 inspelningen. I detta fall kan rytmen accelereras 29 eller bromsas down 30 i enlighet med den experimentella drogen. Dessutom med en fack inspelning kammare, olikt aCSF kan appliceras på selektiva delar beredning 6 och temperaturvariationer 9 kan användas. Denna uppdelning gör det möjligt att studera innebörden av utvalda hjärnstams delar i stimulans-inducerade effekter. Medan den teknik som presenteras använder nyfödda råttor, är det också tillämpligt på andra djurmodeller. Med hjälp av ett protokoll som liknar den som tillämpas för råttor, kan möss användas från graviditets dag 16 (E16) tills P4 12. Den största skillnaden är att det är nödvändigt att värma och carbogen-bubbla aCSF under dissekering. Sköldpaddor kan grodyngel och vuxna grodor också användas; Men dessa arter kräver olika dissektion tekniker samt justeringar av sammansättningen av aCSF.
Denna teknik kan också kopplas med patch-clamp inspelningar på den rostrala ytan av preparatet 31, vilket gör attsamtidig visualisering av nätverket utsignalen och aktiviteten för en viss cell i detta nätverk. Spänning känsligt färgämne avbildning kan också appliceras i nyfödda råtthjärnstams-ryggmärg förberedelser för att lokalisera de aktiverade områdena på den ventrala ytan av hjärnstammen 32. c-fos analys i förberedelserna kan också åstadkommas i syfte att identifiera de neurala populationer som är involverade i specifika andningssvar. Slutligen, kan preparatet modifieras för att hålla andra organ såsom hjärtat 25, ribbor 6, eller fysiologisk artär perfusion med andra fysiologiska rytmer 33. Dock skulle dessa mycket viktiga ändringar krävs andra dissektion protokoll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard | Sigma Aldrich | 761036-5EA | Use under hood |
| NaCl | Bioshop | SOD002 | |
| KCl | Bioshop | POC888 | |
| CaCl2 | Bioshop | CCL444 | |
| MgCl2 | Bioshop | MAG510 | |
| NaHCO3 | Bioshop | SOB999 | |
| NaH2PO4 | Bioshop | SPM306 | |
| D-glucose | Bioshop | GLU501 | |
| Carbogen | Linde | 343-02-0006 | |
| Temperature Controller | Warner Instruments, Hamden, CT, USA | TC-324B | |
| Suction electrode | A-M Systems, Everett, WA, USA | model 573000 | |
| Differential AC amplifier | A-M Systems, Everett, WA, USA | model 1700 | |
| Moving averager | CWE, Ardmore, PA, USA | model MA-821 | |
| Data acquisition system | Dataq Instruments, Akron, OH, USA | model DI-720 | |
| LabChart software | ADInstruments, Colorado Springs, CO, USA | ||
| Prism sofware | Graphpad, La Jolla, CA, USA | ||
| Dissection chamber | Plastic box (e.g. petri box) will do | ||
| Recording chamber | Home made | ||
| Base | Kanetec, Bensenville, IL, USA | MB | |
| Micromanipulator | World Precision Instrument Inc, Sarasota, FL, USA | KITE-R | |
| Base | Kanetec, Bensenville, IL, USA | MB | |
| Peristaltic pump | Gilson, Middleton, WI, USA | MINIPULS 3 | |
| Faraday Cage | Home made | ||
| Computer |
References
- Feldman, J. L., Del Negro,, A, C., Gray, P. A. Understanding the rhythm of breathing: so near, yet so far. Annu Rev Physiol. 75, 423-452 (2013).
- Taylor, A. C., Kollros, J. J. Stages in the normal development of Rana pipiens larvae. Anat Rec (Hoboken). 94, 7-13 (1946).
- Takeda, R., Remmers, J. E., Baker, J. P., Madden, K. P., Farber, J. P. Postsynaptic potentials of bulbar respiratory neurons of the turtle. Respir Physiol. 64, 149-160 (1986).
- Bouverot, P. Control of breathing in birds compared with mammals. Physiol Rev. 58, 604-655 (1978).
- Adrian, E. D., Buytendijk, F. J. Potential changes in the isolated brain stem of the goldfish. J Physiol. 71, 121-135 (1931).
- Suzue, T. Respiratory rhythm generation in the in vitro brain stem-spinal cord preparation of the neonatal rat. J Physiol. 354, 173-183 (1984).
- Fournier, S., et al. Gestational stress promotes pathological apneas and sex-specific disruption of respiratory control development in newborn rat. J Neurosci. 33, 563-573 (2013).
- Caravagna, C., Kinkead, R., Soliz, J. Post-natal hypoxic activity of the central respiratory command is improved in transgenic mice overexpressing Epo in the brain. Respir Physiol Neurobiol. 200, 64-71 (2014).
- Onimaru, H., Arata, A., Homma, I. Neuronal mechanisms of respiratory rhythm generation: an approach using in vitro preparation. Jpn J Physiol. 47, 385-403 (1997).
- Onimaru, H. Studies of the respiratory center using isolated brainstem-spinal cord preparations. Neurosci Res. 21, 183-190 (1995).
- Ballanyi, K., Onimaru, H., Homma, I. Respiratory network function in the isolated brainstem-spinal cord of newborn rats. Prog Neurobiol. 59, 583-634 (1999).
- Viemari, J. C., Burnet, H., Bevengut, M., Hilaire, G. Perinatal maturation of the mouse respiratory rhythm-generator: in vivo and in vitro studies. Eur J Neurosci. 17, 1233-1244 (2003).
- Rybak, I. A., Abdala, A. P., Markin, S. N., Paton, J. F., Smith, J. C. Spatial organization and state-dependent mechanisms for respiratory rhythm and pattern generation. Prog Brain Res. , 165-201 (2007).
- Hilaire, G., Viemari, J. C., Coulon, P., Simonneau, M., Bevengut, M. Modulation of the respiratory rhythm generator by the pontine noradrenergic A5 and A6 groups in rodents. Respir Physiol Neurobiol. 143, 187-197 (2004).
- Okada, Y., Kawai, A., Muckenhoff, K., Scheid, P. Role of the pons in hypoxic respiratory depression in the neonatal rat. Respir Physiol. 111, 55-63 (1998).
- Voituron, N., Frugiere, A., Gros, F., Macron, J. M., Bodineau, L. Diencephalic and mesencephalic influences on ponto-medullary respiratory control in normoxic and hypoxic conditions: an in vitro study on central nervous system preparations from newborn rat. Neuroscience. 132, 843-854 (2005).
- Somjen, G. G. Ion regulation in the brain: implications for pathophysiology. Neuroscientist. 8, 254-267 (2002).
- Danneman, P. J., Mandrell, T. D. Evaluation of five agents/methods for anesthesia of neonatal rats. Lab Anim Sci. 47, 386-395 (1997).
- Formenti, A., Zocchi, L. Error signals as powerful stimuli for the operant conditioning-like process of the fictive respiratory output in a brainstem-spinal cord preparation from rats. Behav Brain Res. 272, 8-15 (2014).
- Bierman, A. M., Tankersley, C. G., Wilson, C. G., Chavez-Valdez, R., Gauda, E. B. Perinatal hyperoxic exposure reconfigures the central respiratory network contributing to intolerance to anoxia in newborn rat pups. J App Physiol. 116, 47-53 (2014).
- Umezawa, N., et al. Orexin-B antagonized respiratory depression induced by sevoflurane, propofol, and remifentanil in isolated brainstem-spinal cords of neonatal rats. Respir Physiol Neurobiol. 205, 61-65 (2015).
- Ruangkittisakul, A., Secchia, L., Bornes, T. D., Palathinkal, D. M., Ballanyi, K. Dependence on extracellular Ca2+/K+ antagonism of inspiratory centre rhythms in slices and en bloc preparations of newborn rat brainstem. J Physiol. 584, 489-508 (2007).
- Cayetanot, F., Bodineau, L., Frugiere, A. 5-HT acting on 5-HT(1/2) receptors does not participate in the in vitro hypoxic respiratory depression. Neurosci Res. 41, 71-78 (2001).
- Onimaru, H., Homma, I. Whole cell recordings from respiratory neurons in the medulla of brainstem-spinal cord preparations isolated from newborn rats. Pflugers Archiv : European journal of physiology. 420, 399-406 (1992).
- Paton, J. F. Rhythmic bursting of pre- and post-inspiratory neurones during central apnoea in mature mice. J Physiol. 502 (Pt 3), 623-639 (1997).
- Morin-Surun, M. P., Boudinot, E., Kato, F., Foutz, A. S., Denavit-Saubie, M. Involvement of NMDA receptors in the respiratory phase transition is different in the adult guinea pig in vivo and in the isolated brain stem preparation. J Neurophysiol. 74, 770-778 (1995).
- Otsuka, H. Effects of volatile anesthetics on respiratory activity and chemosensitivity in the isolated brainstem-spinal cord of the newborn rat. Hokkaido Igaku Zasshi. 73, 117-136 (1998).
- Gestreau, C., et al. Task2 potassium channels set central respiratory CO2 and O2 sensitivity. PNAS. 107, 2325-2330 (2010).
- Caravagna, C., Soliz, J. PI3K and MEK molecular pathways are involved in the erythropoietin-mediated regulation of the central respiratory command. Respir Physiol Neurobiol. 206C, 36-40 (2014).
- Tree, K., Caravagna, C., Hilaire, G., Peyronnet, J., Cayetanot, F. Anandamide centrally depresses the respiratory rhythm generator of neonatal mice. Neuroscience. 170, 1098-1109 (2010).
- Arata, A. Respiratory activity of the neonatal dorsolateral pons in vitro. Respir Physiol Neurobiol. 168, 144-152 (2009).
- Onimaru, H., Homma, I. A novel functional neuron group for respiratory rhythm generation in the ventral medulla. J Neurosci. 23, 1478-1486 (2003).
- St-John, W. M., Paton, J. F. Characterizations of eupnea, apneusis and gasping in a perfused rat preparation. Respir Physiol. 123, 201-213 (2000).
