Un modelo de tejido 3D Pulmón humano de Estudios funcionales en<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Infección

Resumen

La infección por tuberculosis humana es un proceso complejo, difícil de modelar in vitro. Aquí describimos un nuevo modelo de tejido pulmonar humano en 3D que recapitula la dinámica que ocurre durante la infección, incluida la migración de células inmunitarias y la formación temprana de granuloma en un entorno fisiológico.

Resumen

La tuberculosis (TB) sigue teniendo una gran amenaza para la salud de las personas en todo el mundo, y hay una necesidad de modelos rentables, pero fiables para ayudarnos a entender los mecanismos de la enfermedad y promover los descubrimientos de nuevas opciones de tratamiento. Cultivos celulares in vitro de las monocapas o co-cultivos carecen de la tridimensional medio ambiente (3D) y las respuestas de los tejidos. En este documento, se describe un innovador modelo in vitro de un tejido pulmonar humano, que promete ser una herramienta eficaz para el estudio de los complejos acontecimientos que ocurren durante la infección por Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis). El modelo de tejido 3D consiste en células epiteliales y fibroblastos específicos de tejido, que son cultivadas en una matriz de colágeno en la parte superior de una membrana porosa. Tras la exposición de aire, las células epiteliales estratificar y secretar moco en la parte apical. Mediante la introducción de los macrófagos primarios humanos infectados con M. tuberculosis al modo de tejidol, hemos demostrado que las células inmunitarias migran al tejido infectado y forman primeras etapas de granuloma TB. Estas estructuras recapitulan la característica distintiva de la tuberculosis humana, el granuloma, que es fundamentalmente diferente o no se observa comúnmente en modelos animales experimentales utilizados. Este método de cultivo organotípico permite la visualización en 3D y el análisis cuantitativo robusto que proporciona información fundamental sobre las características espaciales y temporales de las interacciones célula-patógeno de acogida. En conjunto, el modelo de tejido pulmonar proporciona un tejido microambiente fisiológicamente relevante para los estudios sobre la tuberculosis. Por lo tanto, el modelo de tejido pulmonar tiene implicaciones potenciales para ambos estudios mecanicistas y aplicados básicos. Es importante destacar que el modelo permite la adición o manipulación de tipos de células individuales, que de este modo amplía su uso para modelar una variedad de enfermedades infecciosas que afectan a los pulmones.

Introducción

En los seres humanos, las respuestas a la infección, la inflamación del tejido, el reclutamiento celular, la remodelación tisular y la regulación de la homeostasis del tejido son eventos complejos que implican diferentes tipos de células. Por lo tanto, estos procesos son los más estudiados en el entorno del tejido local. Anteriormente, esto ha sido principalmente posible utilizando modelos animales experimentales. Sin embargo, los animales experimentales utilizados tienen muchos límites ya que a menudo responden a los patógenos de una manera diferente que los humanos y también muestran un curso diferente de la enfermedad ^1. Un humano en el modelo de tejido pulmonar vitro tiene las posibilidades para estudiar las respuestas inmunes específicas en el pulmón humano.

Infección de tuberculosis humana (TB) es una enfermedad que afecta principalmente a los pulmones. Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis), el agente causante de la TB, alcanza el pulmón a través de gotitas de aerosol que son transportados al espacio alveolar, donde las bacterias son engullidas por dendri pulmonarcélulas de tics y macrófagos alveolares como parte de la respuesta inmune innata a la infección ^2,3. La fagocitosis del patógeno conduce a la compartimentación del error dentro de un fagosoma e idealmente como resultado la neutralización y el asesinato del agente patógeno por el fagocito. Hasta 50% de los individuos expuestos a M. la tuberculosis se cree que son capaces de eliminar la infección a través de la respuesta inmune innata ^4. Otros resultados de la infección son un despeje de la adaptación del sistema inmunológico en una etapa posterior, la infección latente o en el peor de los casos la enfermedad activa crónica ^5.

Anteriormente no se han presentado los modelos de tejidos in vitro para el estudio de la tuberculosis humana. Cultivos de células individuales de los macrófagos humanos u otras células de sangre periférica a menudo se han utilizado ^6,7. La desventaja de este enfoque es que no pueden reflejar la dinámica de los diferentes tipos de células que operan juntos en un tejido pulmonar expuesto a M. tuberculosis . Por lo tanto, hay una necesidad de un modelo in vitro para ser capaz de realizar estudios funcionales y mecanicistas sobre la tuberculosis. El modelo en el tejido pulmonar humano in vitro descrito aquí basada en células fue establecida originalmente por nuestro grupo de estudios sobre las funciones celulares dendríticas ^8. Hemos adaptado este método para el estudio de la tuberculosis.

El modelo de tejido pulmonar humano que aquí se presenta se compone de células epiteliales y fibroblastos ⁸ específicos de tejido. Estas células se cultivan en una matriz de colágeno en la parte superior de una membrana porosa en un inserto de transwell y las estructuras de forma que se asemeje tejido pulmonar humano normal (Figura 1). Cuando se expone al aire las células comienzan a secretar moco en la parte apical ^8. Mediante la implantación de los macrófagos primarios humanos infectados con M. tuberculosis al modelo, hemos observado cómo las células inmunes migran en el tejido y forman primeras etapas de granulomas TB ^9. Este es el primer modelo de tejido descr humanaibed para la tuberculosis y plantea una herramienta prometedora para el estudio de la respuesta inmune innata a la tuberculosis y otras enfermedades del pulmón. Hasta la fecha, hemos utilizado sólo monocitos y macrófagos como células inmunes en el modelo, pero el nivel de complejidad se puede aumentar mediante la inclusión de tipos de células relevantes adicionales.

Figura 1. Esquema Esquema del modelo de tejido pulmonar. (A) El modelo se compone de células epiteliales pulmonares-específica humanos, M. tuberculosis infectados con macrófagos primarios y tinte rojo monocitos marcados sembró en colágeno incrustado fibroblastos preparados en un filtro transwell. La exposición de la modelo de tejido al aire inicia la producción de proteínas de la matriz extra-celular, la secreción de moco y la estratificación por el epitelio. El modelo de tejido 3D así desarrollada es una herramienta útil para estudiar M. infección de tuberculosis en un entorno que closely se asemeja a un pulmón humano. (B) imágenes microscópicas representativas de los diferentes pasos en la preparación del modelo de tejido. (C) estructura completa de la sección de tejido modelo de pulmón. Escala -. 100 m Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Protocolo

Nota: sangre periférica humana de donantes de sangre sanos anónimos comprados en el banco de sangre del Hospital Universitario de Linköping, Suecia fue usada como la fuente de las células inmunes para este estudio. Este protocolo está diseñado para insertos de placas de 24 mm de 6 pocillos. Adaptación directa a otros formatos, así no se recomienda ya que los contratos tipo de tejido, tanto vertical como horizontalmente durante el desarrollo.

1. Preparación de Materiales, Medios de Comunicación y Cultura de las bacterias / Líneas Celulares

1. Cultura de las bacterias:
   1. Crece la tensión por micobacterias M. tuberculosis H37Rv que lleva el plásmido pFPV2 para expresar constitutivamente la proteína fluorescente verde (GFP), en medio 7H9 Middlebrook que contiene 0,05% de Tween-80, 0,5% de glicerol, kanamicina (20 mg / ml), y suplementado con albúmina de Middlebrook, dextrosa y enriquecimiento catalasa ( Middlebrook ADC Enriquecimiento), a 37 ° C con 5% de CO ₂ durante 7-10 días.
      Nota: Todas paso experimentals que implica vivo virulenta M. cepas de tuberculosis se deben realizar en una instalación BSL-3.
2. Preparar el medio completo de 1x Dulbecco medio de Eagle modificado (DMEM) (suplementado con piruvato 1 mM de sodio, 2 mM L-glutamina, 100 U / ml de penicilina, / ml de estreptomicina, HEPES 10 mM, 0,1 mM aminoácidos no esenciales 100 mg y 10 % inactivado por calor suero bovino fetal (FBS)). Prepara también un medio completo DMEM libre de antibióticos.
3. Preparar Medium (MEM) medio esencial mínimo 1x completa (piruvato de sodio 1 mM, 2 mM L-glutamina, 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina, HEPES 10 mM, 0,1 mM aminoácidos no esenciales y 10% al calor suero bovino fetal inactivado (FBS)).
4. Preparación de fibronectina / matraces recubiertos con colágeno (total 10 ml):
   1. Pipetear 8,8 ml de fosfato 1x solución salina estéril tamponada (PBS) en un tubo limpio. Añadir 1 ml de albúmina de suero bovino (1 mg / ml), 100 l tipo I colágeno bovino (3 mg / ml) y 100 l recombinante huhombre fibronectina (1 mg / ml).
   2. Mezclar la solución girando el tubo boca abajo 5 veces. Los matraces se recubren con una solución de fibronectina / colágeno (1 ml para un T-25 y 2 ml para un matraz T-75). Déjelo O / N a 37 ° C. Después de la incubación, se retira la solución y almacenar los matraces recubiertos a TA.
      Nota: La solución recogida se puede almacenar a 4 ° C y se reutiliza por tres veces. Almacenamiento durante más de 2 semanas puede provocar que el líquido a tomar color (formación de cristales), donde sobre él debe ser desechado.
5. Cultura de los fibroblastos:
   1. Crecer y mantener MRC-5, (una línea celular de fibroblastos de pulmón humano derivado de tejido pulmonar normal de un niño de 14 semanas de edad feto masculino), en DMEM completo en 5% de CO ₂ a 37 ° C. Utilice los fibroblastos en pasajes 24-26 y crecer hasta 70-80% de confluencia.
      Nota: MRC-5 línea celular en el paso> 30 tienden a perder la morfología y no se recomienda para su uso en el modelo de tejido.
6. Cultura de las células epiteliales:
   1. Obtener 16HBE14o- (16HBE), una línea bronquial humana inmortalizada de células epiteliales que conserva la morfología diferenciada y la función del epitelio normal de la vía aérea humana, (esto fue un regalo del doctor Dieter Gruenert, Centro de Cáncer Sión Monte de la Universidad de California en San Francisco , EE.UU. ^10.). Células 16HBE Cultura en frascos de fibronectina / recubiertos con colágeno y mantienen las células en MEM completo en 5% de CO ₂ a 37 ° C.
7. Preparación de 5x DMEM
   1. Preparar 5x DMEM disolviendo 13,4 g de polvo de DMEM y 3,7 g de bicarbonato de sodio en 150 ml de agua destilada estéril. Ajustar el pH del medio a 7,3, completar el volumen de 200 ml y filtrarla usando 0,22 micras filtro de membrana. Recoger el medio filtrado en un recipiente estéril y se almacenó hasta su uso a RT.

2. Preparación de los fibroblastos embebidos-colágeno

1. Alícuotas Descongele de FBS y L-glutamina en un 37 ° C baño de agua.Después de la descongelación mantener las muestras en hielo. Coloque bicarbonato de sodio (71,2 mg / ml) y gentamicina (50 mg / ml) a 4 ° C. Pre-cool 50 ml tubos de centrífuga y 10 ml pipetas estériles a 4 ° C.
   Nota: Todos los materiales utilizados (excepto el 5x DMEM) se enfrían en hielo antes de su uso y todos los pasos se llevan a cabo en el hielo. El colágeno de tipo I bovino (1,1 mg / ml) se debe mantener frío, ya que esto impide la solidificación de colágeno.
2. Preparar las células de fibroblastos:
   1. Tripsina caliente en un baño de agua ° C 37 e incubar cantidad suficiente con fibroblastos pulmonares (MRC-5) las células durante 10 min a _5% de CO2 a 37 ° C. Neutralizar la tripsina mediante la adición de 1x DMEM completo. Aspirar la suspensión de células y se centrifuga a 300 xg durante 5 min. Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en 2,3 x 10 ⁵ células / ml en DMEM completo. Colocar las células en hielo hasta que esté listo para su uso.
3. Preparar la premezcla:
   1. Agregue lo siguiente a un tubo rotulado "premezcla"; 395l de 5x DMEM, 40 l L-glutamina, 120 l de NaHCO3 (71,2 mg / ml), 440 mu l de FBS, 5 l de gentamicina (50 mg / ml), Total volumen de 1.000 l, a continuación, haga girar la pre-mezclar bien y poner en hielo.
      Nota: Los volúmenes indicados se refieren a un solo 24 mm de 6 pocillos inserto de cultivo. Calcular las cantidades específicas que se requieren para el número total de inserciones pero agrega uno más para estar seguro, se prepara lo suficiente premezcla.
4. Preparar la mezcla de colágeno acelular:
   1. Para cada cultura añadir 1 ml de mezcla de colágeno acelular. Agregue lo siguiente a un tubo cónico de 50 ml en el hielo en el orden dado; 686 l de 1,1 mg / ml de colágeno, 250 l Pre-mix y 64 mu l 1x DMEM completo a un volumen total de 1.000 l. Mezclar la solución así garantizar no hay burbujas de aire. Trabajo rápido y añadir el colágeno en la pared del tubo para evitar burbujas de aire.
   2. Añadir 1 ml de la mezcla de la capa acelular para el inserto colocado en la placa de 6 pocillos. No agregue cualquier medio al pozo fuera de la inserción. EnCubate durante 30 min en una incubadora a 37 °. Asegúrese de que la mezcla acelular cubre todo el inserto sin burbujas de aire.
5. Preparar la mezcla de colágeno celular:
   1. Mezclar los componentes de la capa celular en un tubo cónico de 50 ml se mantuvieron en hielo en el siguiente orden; 2 ml de colágeno, 615 l Pre-mix, 58 l de 1x DMEM completo y 327 en suspensión de células fibroblastos pulmonares l (MRC-5) para compensar el volumen total a 3.000 l. Cada cultura requiere 3 ml de mezcla de colágeno celular.
      PASO CRÍTICO: Asegúrese de mezclar el colágeno y la premezcla cuidadosamente antes de la adición de la suspensión celular. Esto neutralizar el pH del colágeno para evitar efectos tóxicos sobre los fibroblastos.
   2. Añadir la capa celular (3 ml) en la parte superior de la capa de colágeno acelular y se incuba durante 2 horas en una incubadora a 37 °. Trabajo rápido y añadir el colágeno en la pared del tubo para evitar burbujas de aire.
   3. Después de la polimerización, añadir 2 ml de DMEM completo a tél parte inferior de la placa de 6 pocillos (bajo el inserto) e incubar durante 24 hr.
      NOTA: Si no se produce la polimerización, deseche los insertos de placas que contienen la matriz de fibroblastos-colágeno y puesta de nuevo. La causa más probable es un error en la adición o volumen incorrecto de uno de los reactivos enumerados anteriormente.

3. Cultura continua de la Matriz-fibroblastos colágeno

1. Cuidadosamente levante el inserto usando un fórceps limpios y aspirar el medio de cultivo desde el fondo del pozo. Añadir 2 ml de DMEM completo a la parte inferior del pozo seguido de 2 ml de DMEM completo dentro del inserto. Evitar la introducción de burbujas de aire debajo de la inserción, ya que esto evitará la difusión de nutrientes entre las cámaras interior y exterior. Quite las burbujas de aire con una punta de micropipeta.
2. Cambie el medio de cultivo (por dentro y por debajo de la inserción) cada dos días y la cultura durante aproximadamente 5-7 días. Tenga cuidado en la eliminación de los medios de comunicación de la inserción. Para evitar contact con la matriz de fibroblastos colágeno, incline ligeramente el inserto usando unas pinzas limpias y aspirar los medios de comunicación de las paredes de inserción.
   PASO CRÍTICO: Los fibroblastos en la matriz de colágeno deben recibir un fenotipo alargado, y la remodelación del colágeno, que luego los contratos. En alrededor de 5-7 días, la matriz se ha contraído para formar una plataforma (10-14 mm de diámetro) en el centro de la pieza de inserción. La matriz contraído está listo para su uso en el siguiente paso. Para obtener una contracción uniforme de la matriz es crítico que los fibroblastos son bien mezclado con el colágeno antes de sembrar (Paso 2.6.1).

4. La siembra de las células inmunes (infectados / no infectadas monocitos-macrófagos Mezcla)

Nota: Los siguientes pasos experimentales implican micobacterias virulentas y por lo tanto se deben realizar en una instalación BSL-3.

1. Preparación de los monocitos y macrófagos primarios:
   1. Aislar los monocitos de sangre periférica de la sangre del donante utilizando un establiarrojar protocolo. Aislar los monocitos en el mismo día como la creación del modelo y cultivo de tejidos y diferenciarlos en macrófagos durante aproximadamente 7 días antes de la infección con M. tuberculosis.
      NOTA: Esto asegurará tanto los macrófagos y la matriz de fibroblastos colágeno contraído están disponibles después de 7 días. También aislar monocitos frescas que se añadirán junto con los macrófagos infectados.
2. Preparación de M. tuberculosis con infección por macrófagos
   1. Cosecha de las bacterias cultivadas, lavar con 1x PBS que contenía 0,05% de Tween-80, resuspender en DMEM completo libre de antibióticos, pasar a través de un truncada estéril 27 G aguja para dispersar aglomeraciones bacterianas y medir la densidad óptica.
      Nota: Pre-determinar la M. colonia tuberculosis formación de equivalentes de unidades de densidad óptica en el laboratorio. Esto le dará una estimación del número de bacterias que se utilizará para la infección.
   2. Incubar los macrófagos durante 4 horas con M. tuberculosis en la multiplicidad de infección (MOI) 10). Después de la infección, se lava 3 veces con 1x PBS para eliminar las bacterias extracelulares. Utilice macrófagos no infectados cultivadas de la misma manera pero sin M. tuberculosis, como controles.
   3. Separar los macrófagos de la placa de cultivo mediante tratamiento con EDTA 2 mM durante 10 min a 37 ° C y se resuspendieron las células en DMEM libre de antibióticos completa.
3. Etiquetado de los monocitos
   Nota: El aislamiento y el etiquetado de los monocitos se pueden realizar en el banco BSL-2 y, a continuación tenidos en instalación BSL-3 para su posterior procesamiento.
   1. Tinción de monocitos recién preparado (2 x 10 ⁷ células) con una concentración final de 2 mM PKH26 colorante rojo durante 5 min, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Lavar 3x y resuspender las células con DMEM libre de antibióticos completa a una densidad de 1 x 10 ⁷ células / ml.
4. La adición de las células inmunes para fibroblastos-colágeno de la matriz
   1. LAespués de 5-7 días de la cultura de la matriz-fibroblastos colágeno, aspirar el medio de cultivo de las cámaras exteriores e interiores y añadir 1,5 ml de DMEM libre de antibióticos fresca completa a la cámara exterior.
   2. Preparar un monocito-macrófago marcado (infectados no infectada /) mezcla con una proporción de MO: MQ (5: 1) en 50 l DMEM completo. Por 50.000 macrófagos, tome 250.000 monocitos etiquetados.
   3. Añadir 50 l MO: mezcla de MQ a la matriz de colágeno de los fibroblastos y se incuba durante 1 h en 5% de CO ₂ a 37 ° C. Después de la incubación, añadir con cuidado 2 ml de medio de cultivo en el inserto y se incuba durante 24 hr un adicional en _5% de CO2 a 37 ° C.
      Nota: A medida que las células añadidas están débilmente unidos, además de los medios de comunicación debe ser lento añadiendo suavemente sobre las paredes de la inserción.

5. La siembra de las células epiteliales de pulmón (16HBE)

Nota: Los siguientes pasos se deben realizar en una instalación BSL-3.

1. Semilla de pulmón ecélulas pithelial (16HBE) en la parte superior de la MO: MQ-fibroblastos-colágeno capa. Para llevar a cabo esto, primero disociar 16HBE células del matraz mediante el tratamiento con tripsina (como en 2.2.1.) Y resuspender en 4 x 10 ⁶ células / ml en DMEM libre de antibióticos.
2. Aspirar los medios de cultivo dentro y fuera de la inserción. A continuación, añadir 1,5 ml de DMEM completo en la parte inferior del pozo fuera de la inserción libre de antibióticos.
3. Añadir 50 l de 16HBE en la parte superior de la matriz de colágeno-celular de fibroblastos inmune. Deja durante 2 minutos en el capó y se incuba durante 1 hora en 37 ° C incubadora con 5% de CO _2. Después de la incubación, añadir suavemente 2 ml de DMEM completo dentro de la inserción y la cultura libre de antibióticos a 37 ° C durante 3 días. La etapa de cultivo facilita la proliferación de células epiteliales en el modelo de tejido.
   Nota: A medida que las células añadidas están débilmente unidos, además de los medios de comunicación debe ser lento y suave deslizando a través de las paredes de la inserción.

6. Aire exposición del pulmón 3DModelo

Nota: Después de 5 días después de la adición de los macrófagos infectados, los modelos de tejidos tienen aire expuesto y los siguientes pasos se deben realizar en una instalación BSL-3.

1. Aspirar los medios de cultivo dentro y fuera de la inserción.
   Nota: En este paso sobrenadantes se pueden recoger para la detección de factores secretados. Centrífuga, de filtro estéril y almacenar sobrenadantes a -70 ° C.
2. Añadir 1,8 ml de DMEM libre de antibióticos completos en la cámara exterior y se incuban en 5% de CO ₂ a 37 ° C incubadora durante 2 días. No agregue medios de cultivo dentro del inserto.
   NOTA: Air-levantamiento del modelo de tejido facilita la formación de epitelio estratificado y la secreción de moco, que proporciona la fuerza para el tejido y la semejanza fisiológica al tejido pulmonar humano.

7. Recolección y Montaje del Tejido modelo 3D de pulmón

Nota: Los siguientes pasos se deben realizar en una instalación BSL-3.

1. En el día 7 después de la implantación de los macrófagos infectados, los modelos de tejidos están listos para la cosecha. Retire los medios de cultivo por completo del modelo de tejido. Fijar el modelo de tejido con paraformaldehído al 4% durante 30 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente. Este paso mata a las bacterias y fija la morfología del tejido / célula para su posterior procesamiento.
2. El uso de un bisturí, separar la membrana del inserto así. La transferencia de la membrana que contiene el tejido a un pocillo que contiene PBS 1x.
3. Corte y retire los lados del modelo de tejido utilizando un escalpelo limpio. Luego cortar el modelo de tejido en 4 trozos cuadrados aproximadamente iguales. Transferir una porción de tejido en un portaobjetos de vidrio SuperFrost. Guarde las piezas de tejido en 1x PBS a 4 ° C.
4. Se seca el tejido durante 5 min y montar usando prolongar Oro antifade con DAPI y cubreobjetos. Deja las diapositivas sin molestar en la oscuridad a temperatura ambiente hasta que se seque.
   Nota: El espesor del tejido puede variar entre el centro y la periferia, causando una ligera tilting del cubreobjetos. Para evitar esto, un espaciador (por ejemplo parafina) se puede colocar en la esquina de la hoja de la cubierta.
5. Aplicar el esmalte de uñas de los bordes del cubreobjetos y deje que se seque. Sumergir los portaobjetos en etanol al 70% para que sean seguros para llevar a cabo de la instalación BSL-3.

8. Visualización, Adquisición y Análisis Cuantitativo 3D

1. Visualizar las diapositivas de tejido utilizando un sistema de microscopio confocal con láser que emite a 488 nm para la excitación de GFP (canal verde), 420 nm para DAPI (azul) y 555 nm para los monocitos marcados con PKH26 (rojo), respectivamente.
2. Adquirir imágenes en 3D con una resolución de 512x512 con Z-pilas que cubre a un mínimo de 20 micras de espesor y que tiene 1 - 1.5 m de separación entre las pilas. Adquirir 5-10 campos diferentes que cubren todo el pedazo de tejido.
   Nota: Utilice la configuración como Nyqvist para los ajustes óptimos de resolución óptica (longitud de onda, láser de potencia / exposición, tamaño de píxel y zoom). Evite la ONUder o más de saturación de píxeles.
3. Analizar las imágenes confocal con el software de procesamiento de imágenes en 3D. Para la cuantificación 3D de grupos de células, se recomiendan los siguientes pasos para el análisis óptimo.
4. Abra el software de procesamiento de imágenes 3D y cargar la imagen. Medir las dimensiones de los objetos que deben ser analizadas en la imagen, por ejemplo, del tamaño de un núcleo, monocitos individual y bacterias individuales. Estas observaciones son útiles para definir o filtrar los objetos.
5. Con una herramienta de ajuste de pantalla, optimizar la representación de volumen mediante el ajuste de cada canal para contraste de la imagen, el brillo y mezclar opacidad. Este paso es reducir al mínimo la interferencia de ruido en representación de volumen.
   Nota: La corrección gamma puede conducir a la manipulación de las imágenes y por lo tanto debe evitarse.
6. Crear superficies seleccionando el canal rojo (monocitos) y establecer el umbral (selección automática o manual). Si es necesario, utilice filtros para restringir la selección de los monocitos rojas o excluir la bANTECEDENTES. Del mismo modo, para crear superficies verde (M. tuberculosis) y azul (núcleos) canales como se ha descrito anteriormente.
7. Exportación de los datos en los archivos de MS-Excel. Es posible exportar un parámetro en particular o todos los datos. Los parámetros que son relevantes para el análisis de agrupación de células son el volumen, la intensidad, el número de objetos, el número de voxels y esfericidad.
8. Guardar y exportar las imágenes en un formato de imagen adecuado preferentemente TIFF.
   NOTA: Las animaciones también se puede hacer mediante el menú de animación y se guarda como un archivo multimedia.
9. Guarde la configuración de análisis de cada canal utilizando la opción de añadir parámetros y se pueden recuperar posteriormente utilizando la función Reconstruir. Analizar simultáneamente varios archivos utilizando la herramienta de procesamiento por lotes.
   Nota: Todas las imágenes que se comparan deben ser adquiridos, procesados ​​y analizados de la misma manera. Por ejemplo, una imagen de 8 bits (256 entero) no debe compararse una imagen de 12 bits (4096 entero) con.

Resultados

Un modelo de tejido pulmonar 3D para la tuberculosis humana puede ser utilizado eficazmente para estudiar las interacciones huésped-patógeno en M. infección por tuberculosis. Los pasos básicos de este método, las imágenes microscópicas representativas de diferentes pasos y una estructura microscópica general de una sección de tejido se indica en la Figura 1. El modelo tiene varios componentes del tejido pulmonar humano, incluyendo fibroblastos de pulmón, células epiteliales bronquiales y monocitos primarios / macrófagos incrustado en el entorno del tejido 3D. Además de la incorporación de componentes de tejido de pulmón humano, el modelo se asemeja a condiciones fisiológicas a saber, la estratificación de los epitelios y la secreción de moco.

Un ejemplo para el uso del modelo de tejido pulmonar en el seguimiento de una infección de TB se presenta en la Figura 2. Para visualizar la M. tuberculosis migración celular -immune e interacción, que introdujeron los macrófagos infectados con M. tuberculosis que expresan GFP(verde) junto con los monocitos PKH26 marcado recién aisladas (rojo) en el modelo de tejido (azul, manchado DAPI para los núcleos). En el día 7 después de la adición de M. tuberculosis células infectadas en el modelo de tejido, microscopía confocal revela la agrupación de los monocitos de color rojo en el sitio de infección (verde) (Figura 2), que imita las lesiones característicos de la TB humana ^9.

Una serie de imágenes representativas para la visualización 3D de M. tuberculosis infectados con modelo de tejido y la cuantificación de los grupos de células se muestra en la Figura 3. La visualización en 3D da la flexibilidad para el usuario para interactuar, examinar y cuantificar varias características en una imagen en 3D. La disposición espacial de las bacterias verdes y rojos racimos de monocitos se puede ver desde la vista apical, rotacional y lateral como se ilustra en la figura 3B, lo que revela la agrupación de los monocitos en el sitio de M. Los racimos de tuberculosis. no se observido en los tejidos no infectados (Figura 3A). Hemos cuantificado el tamaño y el número de grupos de células de monocitos y encontramos que el tamaño (volumen) de grupos de células se ha mejorado (p <0,001), mientras que el número de monocitos individuales disminuyó (p <0,01) en M. tuberculosis tejidos infectados en comparación con los modelos de tejido no infectadas (Figura 3C y 3D). Estos datos valida nuestra anterior conclusión de la formación de granulomas a principios de M. infección tuberculosa observa en los modelos de tejido pulmonar analizados en secciones de tejido 2D ^9.

Nuestros datos sugieren que el modelo de tejido proporciona un hábitat natural 3D para investigar el complejo de acogida por células M. red de comunicación tuberculosis. También se encontró que la visualización en 3D y el análisis cuantitativo son mejores herramientas para el estudio de las características del modelo de tejido (Figura 3). La cuantificación de un grupo de células (granuloma por ejemplo) a menudo stretch hes a varias capas de células y pueden ser capturados por completo por un análisis cuantitativo 3D. Además, la visualización de las características espaciales y temporales exactas de las células individuales o bacterias en el modelo permite estudios de imagen en vivo, de migración y de seguimiento en un laboratorio designado.

Figura 2. monocitos en el clúster modelo tejido alrededor virulenta M. tuberculosis. confocal de imágenes representativas de los no infectados y M. se presenta la tuberculosis modelo de tejido infectado. Paneles de verde (M. tuberculosis- GFP), rojo (monocitos PKH26 marcado), azul (núcleos teñidos con DAPI) y canales fusionadas muestran el reclutamiento de monocitos en el tejido infectado en comparación con los tejidos infectados. Scale - 100 micras.large.jpg "style =" font-size: 14px; line-height: 28px; "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3. Visualización 3D y el análisis cuantitativo de modelo de tejido proporcionan información útil. Imágenes representativas de visualización en 3D de todo el modelo de tejido (A) del tejido infectado, (B) infectados con M. tuberculosis, a través de seccionamiento óptico Zeiss LSM700 usando microscopio confocal y análisis cuantitativo por el software de procesamiento de imágenes Imaris (versión 7.6.8). Estas imágenes fueron adquiridas a 20X aumentos, 14 z-pilas que cubren un espesor de tejido de 19,5 m con 1,5 micras intervalo, permitiendo la visualización de la posición horizontal apical, de rotación, vista vertical y lateral de rotación (A y B). (C) Quaanálisis ntitative de grupos de células de monocitos revelan mejorada (p <0,0001) tamaño de los clusters granuloma primeros después M. infección de tuberculosis cuando se compara con la ausencia de infección. (D) Cuantificación de número de monocitos mostró una disminución (p <0,01) en el tejido infectado en comparación con el tejido no infectado, reiterando más grupos en el tejido infectado. Verde - M. GFP tuberculosis, Red - monocitos marcados PKH26, Azul - núcleos celulares, Escala -. 100 m Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

La capacidad de reclutar y formar grupos de células organizadas en el sitio de la infección es el sello distintivo de la tuberculosis humana ¹¹. Estas estructuras dinámicas conocidas como granulomas tuberculosos consisten principalmente en células inmunitarias (macrófagos, monocitos, células T y células B) y células gigantes multinucleadas que rodean a M. tuberculosis. Durante mucho tiempo se ha considerado que el papel del granuloma es aislar la infección, evitando la propagación local de bacterias. Sin embargo, estudios más recientes muestran que la formación de granulomas es fundamental para la supervivencia, el crecimiento y la diseminación bacterianos tempranos ¹². Una estrategia de nuevos estudios es identificar moléculas o vías que podrían dirigirse de manera eficiente para inhibir la migración celular en la formación de granulomas y/o la diseminación de la TB.

Una advertencia para los nuevos estudios sobre la tuberculosis es la falta de modelos que recapitulen la tuberculosis humana. Los animales de experimentación más utilizados no forman un verdadero granuloma tras la infección por M. tuberculosis y, por lo tanto, no son opciones apropiadas para los estudios de TB ^13-16. Los primates no humanos tienen el mayor parecido con la tuberculosis humana ¹⁷, pero no son la opción preferida debido a los altos costos operativos y los problemas éticos. La tuberculosis humana es un proceso inmunológico complejo y es difícil de modelar in vitro. Los cultivos celulares de monocapas o cocultivos carecen del entorno 3D y las respuestas tisulares. Por lo tanto, hemos desarrollado un modelo innovador de tejido pulmonar basado en células inmunitarias primarias humanas y líneas celulares específicas de pulmón humano ^8,9. El modelo muestra rasgos característicos del tejido pulmonar humano, incluidos epitelios con macrófagos uniformemente integrados, formación de matriz extracelular, epitelio estratificado y secreción de moco ⁹.

El modelo de tejido pulmonar humano en 3D tiene varios beneficios sobre los cultivos individuales o conjuntos in vitro sembrados en placas de cultivo de tejidos o insertos transwell. En primer lugar, las células específicas de los pulmones humanos (fibroblastos y células epiteliales) no se incluyen comúnmente en los cultivos individuales o cocultivos in vitro . En segundo lugar, las células inmunitarias y las células específicas de los pulmones están integradas en un contexto fisiológico 3D (productos de matriz extracelular ricos en colágeno). La respuesta de las células a un estímulo/infección y el comportamiento migratorio de las células, por ejemplo, la formación de un granuloma, difieren significativamente entre un entorno 2D y 3D. Además, el método descrito permite la visualización 3D y el análisis cuantitativo 3D robusto que proporciona información fundamental sobre la distribución espacial y las intrincadas interacciones celulares.

La infección experimental en el tejido modelo con M. tuberculosis dio lugar a la agrupación de macrófagos en el sitio de la infección, que recuerda al granuloma de tuberculosis temprano (Figura 2 y 3). Recientemente hemos demostrado que las cepas mutantes defectuosas en la capacidad de secretar el factor de virulencia ESAT-6 o Mycobacterium bovis BCG que carece de ESAT-6 no indujeron la agrupación de monocitos (sin granuloma temprano), en contraste con la virulenta M. tuberculosis ⁹. Estos datos son consistentes con las observaciones realizadas a partir de embriones de pez cebra infectados con Mycobacterium marinum, cuya transparencia permite obtener imágenes en vivo elegantes de la formación de granulomas ¹². Como no existe un modelo estándar de oro para la TB, aprovechamos las biopsias de tejido resecadas quirúrgicamente de pacientes con TB para la validación del método ⁹. Nuestro modelo de tejido in vitro comparte varias características con las biopsias de pulmón y ganglios linfáticos de pacientes con TB, incluida la agregación de macrófagos en el granuloma, la presencia de bacterias intra y extracelulares ¹⁸ y la inducción de necrosis ¹¹.

Aunque el modelo descrito tiene relevancia fisiológica para la TB humana y tiene varias ventajas sobre otros modelos in vitro , tiene algunas limitaciones. Por ejemplo, de las más de 20 proteínas de colágeno identificadas en humanos, solo el tipo I se incluye en el modelo para imitar la matriz extracelular. Sin embargo, el colágeno tipo I es una mezcla compleja de productos de matriz extracelular y es el colágeno más abundante en el cuerpo humano. Además, hemos demostrado la presencia de colágeno IV y varias proteínas de la matriz extracelular como la tropoelastina, la vimentina y la laminina, que son producidas por las células epiteliales y los fibroblastos en el modelo tisular, lo que indica la síntesis de nuevo colágeno ⁸. Actualmente, el modelo de tejido pulmonar solo tiene monocitos y macrófagos, además de células específicas del pulmón. Carece de neutrófilos y linfocitos que también se sabe que están presentes en el granuloma. Sorprendentemente, el modelo no se limita a la introducción de células inmunitarias adicionales y es de interés explorar cómo contribuyen a las complejas interacciones celulares en la tuberculosis humana. La implantación de macrófagos alveolares primarios, células específicas de la piel y células de carcinoma de pulmón ya se ha probado en el modelo. Dado que nuestro objetivo era utilizar un modelo que se pareciera mucho a la tuberculosis humana, no se ha intentado la introducción de células de ratón.

En resumen, el modelo de tejido pulmonar tiene implicaciones tanto para los estudios mecanicistas básicos como para los aplicados. Las aplicaciones potenciales del modelo pulmonar incluyen el estudio de la inmunidad innata, la investigación de aspectos mecanicistas de las defensas del huésped, como la maduración fagosomal, la autofagia, la producción de citocinas, quimiocinas y péptidos antimicrobianos, y la caracterización funcional de tipos de células individuales. Sorprendentemente, el modelo de tejido in vitro permite la manipulación de uno o más tipos de células y proporciona un microambiente tisular relevante, no solo para estudios sobre tuberculosis, sino para una variedad de enfermedades infecciosas y no infecciosas que afectan los pulmones.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Insertos de cultivo celular	BD Falcon	353092
placas de cultivo de 6 pocillos	BD Falcon	353046
células MRC-5, fibroblastos pulmonares			ATCC#CCL-171
16HBE células, células			Regalo del Dr. Dieter Gruenert, Mt. Zion Cancer Center, Universidad de California, San Francisco, EE. UU.
5 x Dulbecco' Águila modificada' s medium (5 x DMEM)	Gibco	12800-082	Hecho de polvo pero añadir 5 veces menos agua. Ajuste el pH a 7.3 y fíltrelo con un 0.2 µ Filtro M.
Dulbecco' Águila modificada' s medio con glucosa (DMEM) 1x	Gibco	41965-039
Medio esencial mínimo (MEM) 1x con Earle' sales s	Sigma	M4655
Solución de aminoácidos no esenciales, 100x	Life Technologies	11140-035
L-glutamina 200 mM (100x)	Gibco	25030-024
Piruvato de sodio	Life Technologies	11360-039
NaHCO3 (71,2 mg/ml)			Preparado internamente
Suero fetal bovino inactivado por calor (FBS)	Gibco	10270-106	Calor inactivado durante 30 min, 56 ° C
Gentamicina (50 mg/ml)	Gibco	15750-060
Hepes solución tampón 1M	Gibco	15630-056
Penicilina Estreptomicina (estreptococo en pluma)	Gibco	15140-122
Lymphoprep	Axis-Shield	7801
Ultrapure 0,5 M EDTA	Gibco	15575
Colágeno bovino tratado con PA (500 ml)	Organogénesis	200-055
Solución purificada de colágeno bovino purificado (100 ml)	Biomatrix avanzado	5005-B
Proteína de matriz extracelular, Fibronectina (1 mg)	BD	354008
Monocitos/macrófagos			primarios Aislados de sangre entera humana o pelajes leucocitarios.
PKH26 Enlazador de células rojas fluorescentes	Sigma	MINI26
Mycobacterium tuberculosis H37Rv que expresa la proteína			M. tuberculosis H37Rv tipo salvaje se transformó con el plásmido pFPV2 que expresa constitutivamente GFP.
Middlebrook 7H9 medio	Difco	271310
BBL Middlebrook ADC Enriquecimiento	BBL	211887
Tween-80
Glicerol
Sulfato de kanamicina B (20 µ g/ml)	Sigma	B5264
Prolong Gold reactivo anti=-decoloración con DAPI	Invitrogen	P36935
Tripsina -EDTA
Paraformaldehído
DAPI
Software de procesamiento de imágenes iMaris Scientific 3D/4D, versión 7.6.8	Bitplane AG