Un método computarizado reproducible para la cuantificación de la densidad capilar utilizando periungueal capilaroscopia

Summary

La capilaroscopia es una metodología no invasiva, eficiente, relativamente barata y fácil de aprender para visualizar directamente los capilares en la microcirculación. Sin embargo, hasta la fecha, solo una publicación describe la fiabilidad de un complejo programa informático disponible para cuantificar los datos de la capilaroscopia. Aquí, presentamos un protocolo simple y confiable para cuantificar capilares utilizando un algoritmo estandarizado.

Abstract

Capilaroscopia es una metodología no invasiva, eficiente, relativamente barato y fácil de aprender para visualizar directamente la microcirculación. La técnica capilaroscopia puede proporcionar información sobre la salud de un paciente microvascular, lo que lleva a una variedad de dermatológica potencialmente valiosa, oftalmológica, aplicaciones clínicas reumatológicas y cardiovasculares. Además, el crecimiento del tumor puede ser dependiente de la angiogénesis, que puede ser cuantificó midiendo la densidad de microvasos dentro del tumor. Sin embargo, en la actualidad existe poca o ninguna estandarización de las técnicas, y sólo una publicación a la fecha reporta la fiabilidad de unas actualmente disponibles algoritmos basados ​​ordenador y complejas para cuantificar los datos capilaroscopia. ¹ En este trabajo se describe un nuevo, más simple,, algoritmo fiable recuento capilar estandarizado para cuantificar los datos capilaroscopia nailfold. Un algoritmo capilaroscopia computarizada simple, reproducible como esto facilitaría másuso generalizado de la técnica entre los investigadores y los clínicos. Muchos investigadores analizan actualmente imágenes capilaroscopia a mano, la promoción de la fatiga del usuario y de la subjetividad de los resultados. Este documento describe un nuevo, fácil de uso automatizado algoritmo de procesamiento de imágenes, además de un algoritmo de conteo semi-automatizado reproducible. Este algoritmo permite el análisis de las imágenes en cuestión de minutos, mientras que la reducción de la subjetividad; sólo una cantidad mínima de tiempo de entrenamiento (en nuestra experiencia, a menos de 1 hora) es necesario para aprender la técnica.

Introduction

Formación de imágenes microvascular es un campo en rápido crecimiento con muchas aplicaciones clínicas potenciales. ² Por ejemplo, los oncólogos están utilizando formación de imágenes de los microvasos para determinar la extensión de la angiogénesis tumoral, produciendo una valiosa información sobre el estado del tumor y una visión de posibles opciones de tratamiento. ^{3 4} Sin embargo, capilaroscopia lecho ungueal es quizás la forma eficiente y ampliamente aplicable costo mayor parte de las imágenes microvascular. Los investigadores están utilizando el vídeo lecho ungueal capilaroscopia para estudiar las tasas de flujo de sangre e investigar la morfología capilar. ^{5 6} Tanto vídeo y de imágenes fijas lecho ungueal capilaroscopia están adjuntos a la atención para diagnosticar y tratar fenómeno y varias enfermedades del tejido conectivo de Raynaud, como la esclerosis sistémica. ²

Capilaroscopia periungueal tiene diversas aplicaciones cardiovasculares potenciales. La investigación actual sugiere usar lecho ungueal capilaroscopiaEse tipo diabetes mellitus 1 y Tipo 2 pacientes presentan una alta prevalencia de la morfología capilar anormal, sin embargo, tienen densidades capilares sin cambios en comparación con los individuos no diabéticos. ^8.7 capilaroscopia también se ha estudiado experimentalmente en la hipertensión. Estructural rarefacción capilar que conduce a una reducción de la densidad capilar se ha demostrado en individuos hipertensos en comparación con los individuos no hipertensos. ^9-10 En contraste con estos pacientes hipertensos de edad avanzada que presentan rarefacción estructurales, la investigación más reciente ha demostrado que (edad 40 y por encima de la media) pacientes hipertensos más jóvenes (media de edad menores de 40 años) tienen rarefacción funcional sin rarefacción estructural. ¹¹ Esto sugiere que la rarefacción funcional se produce antes y puede progresar con el tiempo para rarefacción estructural.

Curiosamente, los pacientes hipertensos tratados con fármacos antihipertensivos específicos como perindopril / indapamida representada normaAl densidad capilar y la función endotelial después del tratamiento, mientras que los tratados con ACE (Inhibidores de la enzima convertidora de) inhibidores o diuréticos mantiene una baja densidad capilar a pesar del control de la presión arterial comparable. ¹² Esto sugiere que algunos medicamentos antihipertensivos pueden normalizar la densidad capilar invirtiendo el capilar rarefacción causado por la hipertensión. Además, otros investigadores han demostrado que una reducción en la ingesta de sal conduce a la reversión de tanto rarefacción capilar funcional y estructural en individuos hipertensos. ¹³

A pesar de las diversas aplicaciones clínicas potenciales de esta tecnología, hay poca estandarización de la técnica para la cuantificación de las imágenes de densidad capilar. ² Hasta la fecha, los investigadores han encontrado que los resultados de densidad capilar son reproducibles, tanto desde el intra-observador y la perspectiva inter-observador sólo si la exacta misma área está siendo contado cada vez. ^{1,14 15} Es de destacar que los investigadores anteriores han realizado gran parte recuentos capilares manualmente con el ojo desnudo, ^{9 16 17 18,} que es un proceso lento y subjetiva.

Algoritmos estandarizados, basados ​​informáticos para la cuantificación de las imágenes capilares teóricamente proporcionan un análisis de datos más eficiente y reproducible con menos subjetividad, lo que facilita las aplicaciones clínicas de capilaroscopia. Algunos investigadores han utilizado efectivamente los programas basados ​​en computadoras para cuantificar los datos de nailfold imágenes capilaroscópicos. ^{1,6 19 20} Sin embargo, sólo una publicación a la fecha describe fiabilidad de un programa de software complejo disponibles para cuantificar los datos ^{capilaroscopia,} 1 y este programa es complicado como anteriormente se ha indicado anteriormente por el requisito de contar el mismo campo visual exacto. A continuación, presentamos un protocolo sencillo y fiable para cuantificar los capilares utilizando un algoritmo estandarizado que permiteel uso de múltiples campos visuales. El uso de múltiples campos visuales no sólo simplifica el procedimiento, sino que también permite la evaluación de la variación biológica normal en el recuento capilar.

El objetivo de este estudio es describir un algoritmo computarizado reproducible y eficiente, que estandariza el proceso de cuantificación capilar. Si bien estos métodos no están completamente automatizados que requieren muy poca intervención del usuario, y proporcionan la cuantificación rápida y fiable de las imágenes.

Protocol

Nota: El proceso de adquisición para la obtención de imágenes capilares ya ha sido publicado y se logra utilizando una cámara fotográfica digital con un programa informático de adquisición y análisis de imágenes correspondiente ^{11 21} Esta práctica de laboratorio utiliza imágenes fijas para el análisis, no vídeos, lo que simplifica la adquisición de imágenes para el análisis.. A continuación se describe la nueva técnica para cuantificar los capilares a partir de las imágenes.

1. Mejora de la imagen de proceso

1. Obtener imágenes digitales con una cámara digital monocromo. Calibrar las imágenes a un objeto de tamaño conocido por tomar una foto de un objeto de longitud conocida como una regla con la cámara. Este proceso permite que el programa informático para medir y contar capilares con precisión después del procesamiento. Lo ideal para la más alta precisión, se debe utilizar una retícula (pieza científicamente fabricado de vidrio con una regla grabada en ella). Medir el número de píxeles en un cuadrado de 1 mmcaja usando un programa informático.
   Nota: La clave para la reproducibilidad y la normalización de este protocolo depende en gran medida de la correcta colocación de la caja 1 mm ² que se cuenta.
2. Utilice herramientas de mejora de contraste para oscurecer los capilares y aclarar el fondo, lo que maximizará la visualización de los capilares. La diferenciación inicial de los capilares de fondo es importante para el cultivo adecuado de la imagen en pasos posteriores. Para ello, el ajuste de la imagen mediante un Para ello haga clic en "mejor histograma en forma.": La captura, la intensidad, la imagen de histograma, mejor ajuste.
3. Recortar una región de interés (ROI) para el recuento capilar como una nueva imagen (seleccionar, regiones de interés). Utilice una caja de 1 mm ^2, que se determinó mediante la calibración de las imágenes a 530 píxeles igualando 1 mm. compruebe que la imagen recortada coloca el ápice de las asas capilares en la parte superior de la imagen.
4. Aplanar la imagen para que todos los ajustes de imagen futuras se aplicarán uniformemente ala imagen. Para ello, haga clic en: Ficha proceso, filtros 2D, aplanar, intensidad BG de "brillante" object width a "75", se aplica.
5. El contraste de la imagen para los capilares se visualizan al máximo. Para ello, haga clic en: ficha, pantalla ajustar, aumentar contraste con 75.
6. Eliminar manchas en la imagen para suavizar los bordes de los capilares haciendo clic en la pestaña de procesos, filtros 2D, despeckle, el tamaño del núcleo 7 x 7, aplique.
7. Finalizar el contraste de la imagen de modo capilares son de color negro y el fondo es blanco. Realice este paso ajustando el histograma para el modelo de "mejor ajuste".
   Nota: Por favor consulte la Figura 2 en resultados representativos para un ejemplo de lo que la imagen procesada debe ser similar siguiendo estos pasos.

2. Realizar Condes capilares / cuantificar capilar Densidad

1. En cada imagen, seleccionar manualmente una parte de un capilar bien definida mediante el featur "objeto destino"e para ser reconocido como objetos a ser contados por el programa. A continuación, seleccione una pequeña parte del fondo, utilizando la función de "fondo", como referencia a las áreas que necesitan ser ignorado por el algoritmo de recuento.
   Nota: La combinación de estos destacados provoca todos los capilares a destacar sin tener en cuenta el ruido de fondo. El protocolo de cuantificación (contando) utiliza las funciones del ordenador para diferenciar partes de la imagen basada en el color y la morfología.
2. Utilice la función de recuento para contar al instante todos los capilares en la imagen con el equipo de imagen. Ajuste el diámetro mínimo de los objetos contados a 5 píxeles con el fin de evitar contar el ruido de fondo como capilares.
3. Para cada individuo, contar el promedio de 3 - 4 imágenes con el fin de obtener una evaluación más fiable.
   Nota: Por favor consulte la Figura 3 en resultados representativos para un ejemplo de lo que la imagen debe ser similar durante el procedimiento de recuento.

3. Creación y uso de macros para automatizar Procesamiento de Imágenes

Nota: Para ahorrar tiempo, las macros se pueden crear con el fin de realizar automáticamente una secuencia específica de los procesos en una o varias imágenes. Estas secuencias pueden ser personalizados con el fin de hacer las modificaciones de imagen más rápida. En esencia, estas macros recuerdan cómo se procesan las imágenes, y llevar a cabo todos los pasos de forma rápida y sin intervención del usuario. Realización de los recuentos en 12 imágenes capilares toma este laboratorio entre 20 a 30 min con las macros (2 a 3 min por imagen), en oposición a aproximadamente 8 min por imagen sin los macros. Por lo tanto el uso de las macros es de 3 a 5 veces más eficiente que el procesamiento manualmente cada imagen individual.

1. Con el fin de crear una macro, seleccione "Grabar macro" y en una imagen de realizar los pasos y procesos deseados, como se describe en los pasos 1 y 2 anteriores. Nombre de la macro a partir del cual la imagen pasos de procesamiento se realizaron para referencia futura. Cuando using la macro en futuras imágenes, simplemente haga clic en "macro run" y el programa se aplicará automáticamente las mejoras registradas a la imagen (s) deseada.
   Nota: Este laboratorio utiliza una macro para realizar todos menos uno de los pasos en la Sección 1 de los métodos en unos segundos. El único paso que requiere la entrada del usuario es la elección de dónde recortar la imagen, paso 1.2.

Results

El objetivo de este procedimiento de procesamiento de imágenes es diferenciar los capilares a partir de la imagen de fondo para que puedan ser cuantificados con precisión. Tanto el procesamiento de imágenes y procesamiento de imágenes incompleta excesiva son perjudiciales para la capacidad del programa para cuantificar los capilares. Como se ve en la Figura 3, el procesamiento de imágenes hace que los capilares incompleta difícil de distinguir del fondo. Es crítico que el usuario sea ca...

Discussion

Capilaroscopia periungueal se muestra prometedor como una herramienta clínicamente útil en el futuro para diversos oncología, cardiovascular, y las aplicaciones de enfermedades reumatológicas. El proceso de adquisición de imágenes es bastante consistente entre los investigadores, sin embargo, en la actualidad hay varios métodos para el procesamiento de imágenes y análisis. Métodos actualmente incluyen recuentos capilares computarizados y manuales. Conteos manuales son problemáticos, ya que son mucho tiempo, y sujeto a l...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Image-Pro Premier	Media Cybernetics, Inc	9.1	Software de procesamiento de imágenes