Artículo de método

Etiquetado Celular y Orientación con superparamagnético nanopartículas de óxido de hierro

DOI:

10.3791/53099

⸱

19 de octubre de 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Cardiovascular Diseases, Mayo Clinic, 2Division of Engineering, Mayo Clinic, 3School of Medicine, Pharmacy and Health, Durham University, 4Regional Center for Applied Molecular Oncology, Masaryk Memorial Cancer Institute, 5Mayo Clinic College of Medicine, Mayo Clinic

En este artículo

Resumen

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La administración celular dirigida es útil en una variedad de aplicaciones biomédicas. El objetivo de este protocolo es utilizar nanopartículas superparamagnéticas de óxido de hierro (SPION) para marcar células y, por lo tanto, permitir enfoques de orientación de células magnéticas para un alto grado de control sobre la entrega y localización de células.

Resumen

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La administración dirigida de las células y agentes terapéuticos se beneficiaría de una amplia gama de aplicaciones biomédicas concentrando el efecto terapéutico en el sitio diana, mientras que se minimizan los efectos deletéreos a sitios desviado. Focalización celular magnética es una técnica de suministro eficiente, seguro y sencillo. Nanopartículas de óxido de hierro superparamagnético (SPION) son biodegradables, biocompatibles, y pueden ser endocitosis en células para hacerlos sensibles a los campos magnéticos. El proceso de síntesis implica la creación de magnetita (Fe 3 O 4) Nanopartículas seguido por emulsificación de alta velocidad para formar un poli (ácido láctico-co-glicólico) revestimiento (PLGA). Los SPIONs PLGA-magnetita son de aproximadamente 120 nm de diámetro incluyendo el núcleo de magnetita diámetro aproximadamente 10 nm. Cuando se coloca en medio de cultivo, SPIONs son naturalmente endocitosis por las células y se almacenan como pequeños grupos dentro de endosomas citoplasmáticos. Estas partículas imparten masa magnética suficiente para las célulaspara permitir la orientación dentro de los campos magnéticos. Numerosos clasificación de células y aplicaciones dirigidas están habilitadas por la prestación de diversos tipos de células sensibles a los campos magnéticos. SPIONs tienen una variedad de otras aplicaciones biomédicas, así como el uso como agente de contraste de imagen médica, la administración de fármacos o gen diana, ensayos de diagnóstico, y la generación de la hipertermia local para la terapia de tumores o de soldadura de tejidos.

Introducción

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La entrega y captura dirigida de células a sitios específicos dentro del cuerpo es deseable para una variedad de aplicaciones biomédicas. La administración de células madre neurales al cerebro mediante ultrasonido focalizado guiado por resonancia magnética se ha propuesto como una posible opción de tratamiento para la enfermedad neurodegenerativa, la lesión cerebral traumática y el accidente cerebrovascular1. Las células madre mesenquimales están siendo estudiadas por su capacidad para administrar fármacos anticancerígenos a los tumores debido a sus propiedades tumorales naturales2,3. Las células madre cardíacas han sido suministradas al corazón como un posible tratamiento para el infarto de miocardio4,5. Se han desarrollado stents vasculares con anticuerpos CD34 para capturar células progenitoras circulantes6. Aunque prometedores, estos enfoques de segmentación celular presentan inconvenientes, como la falta de especificidad celular, la retención celular inconsistente y la administración de células fuera del objetivo.

El objetivo general del método actual es permitir la orientación dirigida magnéticamente de las células para una variedad de aplicaciones de entrega y clasificación de células. La focalización magnética permite la entrega controlada de células específicas a un sitio objetivo específico con efectos mínimos fuera del objetivo7. Los campos magnéticos pueden ser generados por dispositivos implantados o externos para dirigir de manera segura el movimiento de las células marcadas magnéticamente dentro del cuerpo8. Numerosos esfuerzos de investigación se han centrado en la dirección magnética de las células madre a los tejidos lesionados, como el corazón9-14, la retina15, el pulmón16, la piel17, la médula espinal18,19, el hueso20, el hígado21 y el músculo22,23 con el fin de mejorar los resultados de la regeneración.

La orientación magnética de las células también se ha estudiado ampliamente como un medio para endotelizar dispositivos cardiovasculares implantables. Un endotelio uniforme y completo proporciona una barrera entre el dispositivo y los elementos sanguíneos circulantes para mitigar la trombosis y la inflamación. Las células endoteliales pueden ser entregadas al dispositivo ya sea antes de la implantación o a través del sistema vascular después de la implantación. En ambos casos, los campos magnéticos se utilizan para capturar células en la superficie del dispositivo y retener las células cuando se someten a la tensión de cizallamiento generada por la sangre circulante. Los stents vasculares magnéticos24-27 y los injertos vasculares28 han sido fabricados y probados para este propósito.

La focalización de células magnéticas requiere una estrategia para etiquetar las células con partículas portadoras magnéticas. Estas partículas pueden unirse a la superficie de las células a través de anticuerpos o pares de ligandos/receptores, o pueden ser endocitadas en las células. Las nanopartículas superparamagnéticas de óxido de hierro (SPION) son biodegradables, biocompatibles y fácilmente endocitosas por una variedad de tipos de células29. Estas partículas hacen que una célula responda eficazmente a los campos magnéticos y se degradan naturalmente con el tiempo. Los SPION proporcionan un medio sencillo y seguro de marcar magnéticamente células en cultivo para una variedad de aplicaciones de clasificación y orientación magnética. Se proporciona un método para sintetizar SPIONs con un núcleo de magnetita (Fe3O4) y una capa de ácido poli(láctico-co-glicólico) (PLGA). Además, se proporciona un método para etiquetar células en cultivo con SPIONs.

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Protocolo

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1. Síntesis de la magnetita de Gel

  1. Lave toda la cristalería usando ácido clorhídrico concentrado seguido de agua desionizada seguido por el alcohol etílico. Deje secar O / N, preferiblemente en un horno de secado.
    ¡CUIDADO! ácido clorhídrico es perjudicial - llevar equipo de protección personal y el trabajo en una campana de humos; alcohol etílico es perjudicial -, usar equipo de protección personal.
  2. Utilice una botella Dreschel para de-gas 500 ml de H2O desionizada burbujeando suavemente gas N2 durante 30 minutos.
  3. Puesta en marcha del aparato de síntesis de magnetita dentro de una campana de humos química.
    1. Coloque un frasco ml de tres bocas de fondo redondo de 500 dentro de un calentador isomantle y asegure la boca central utilizando una pinza y el soporte.
    2. Instalar un septum de goma en uno de los cuellos laterales del matraz de fondo redondo y un condensador de reflujo con un septo de caucho en el cuello lado restante. Continuamente correr agua fría a través del condensador de reflujo.
    3. Punción ªe septo de caucho del matraz de fondo redondo con una aguja conectada a una línea de gas N 2 y perforar tabique de caucho del condensador de reflujo con una aguja conectada a una línea de gas corriendo a un burbujeador (es decir, matraz con agua) para visualizar de salida de gas.
    4. Instale una paleta de hoja en el cuello central del matraz de fondo redondo a través de un adaptador de paddle. Coloque el eje de la paleta de cuchilla para un agitador de cabeza montado en un soporte.
  4. Purgar el matraz de fondo redondo con gas N2 y dejar N2 gas que fluye a una velocidad baja, pero detectable.
  5. Retire el condensador de reflujo desde el matraz de fondo redondo y añadir 1,000 g de hierro (III) cloruro, 0,6125 g de hierro (II) tetrahidrato de cloruro, y 50 ml de de-gaseados H 2 O.
    ¡CUIDADO! hierro (III) y cloruro de hierro (II) tetrahidrato de cloruro son perjudiciales -, usar equipo de protección personal.
  6. Vuelva a colocar el condensador de reflujo y se agita a 1000 rpm mientras se calienta a 50° C. La agitación en estas condiciones produce 10 nanopartículas de magnetita nm de diámetro.
  7. Una vez en 50 ° C, añadir 10 ml de solución de hidróxido de amonio al 28% mediante la inyección a través del septo de caucho en el matraz de fondo redondo mientras que todavía se agitaba.
    ¡CUIDADO! hidróxido de amonio es perjudicial -, usar equipo de protección personal.
    NOTA: La solución de hidróxido de amonio se utiliza para precipitar la magnetita y la solución debe volverse negro.
  8. Quitar el tapón de caucho y N 2 línea de gas desde el matraz de fondo redondo y se calienta a 90 ° C a hervir el gas amoniaco mientras que todavía se agitaba.
    NOTA: Es opcional para mantener el flujo de N 2 en el matraz de fondo redondo por punción de tabique de caucho del condensador de reflujo, sin embargo, la oxidación de la magnetita a maghemita es insignificante durante este paso.
  9. Una vez en 90 ° C, añadir 1 ml de ácido oleico a la matraz de fondo redondo mientras que todavía se agitaba. El ácido oleico se utiliza para recubrir la magnetita nanoparticles para formar gel de magnetita.
    ¡CUIDADO! ácido oleico es perjudicial -, usar equipo de protección personal.
  10. Vuelva a colocar el tapón de goma y N 2 línea de gas en el matraz de fondo redondo y retire el condensador de reflujo.
  11. Apagar el fuego y revuelva a 500 rpm durante 2 horas.
  12. Retire el matraz de fondo redondo desde el calentador isomantle y decantar el líquido sobrante durante el uso de un imán fuerte sostenido contra la parte inferior del matraz para retener el gel de magnetita.
    ¡CUIDADO! manejar el imán fuerte con extremo cuidado para evitar daños o lesiones.
  13. Permita gel de magnetita a O-aire seco / N (opcional).

2. Purificación de la magnetita de Gel

  1. Añadir 40 ml de hexano en el matraz de fondo redondo para disolver el gel de magnetita
    ¡CUIDADO! hexano es perjudicial -, usar equipo de protección personal y el trabajo en una campana de humos.
  2. Use un embudo de separación con 40 ml de de-gaseados H2O para eliminar H 2 O residual frosoy la solución magnetita.
    1. Vierta lentamente la solución de magnetita en el H 2 O en el embudo de decantación y agitar suavemente el líquido de dos fases durante 5 minutos.
    2. Escurra y deseche la fracción acuosa inferior.
    3. Poco a poco agregue 40 ml de de-gaseados H2O para el embudo de separación de tal manera que se instala debajo de la solución de magnetita y agitar suavemente y drene como antes.
    4. Repetir para lavar por tercera vez.
  3. Transfiera la solución de magnetita a un matraz Erlenmeyer, añadir unas espátulas valor de sulfato de sodio anhidro, y agitar para eliminar cualquier H 2 O residual que queda de la solución de magnetita.
  4. Filtrar la solución a través de papel de filtro de magnetita 1 m en un embudo de filtro para eliminar el sulfato de sodio y H 2 O. residual
    NOTA: Se recomienda la asistencia de vacío.
  5. Transferir la solución de magnetita a un matraz de evaporación de 50 ml y el uso de un evaporador rotatorio para evaporar el hexano durante2 h con las siguientes condiciones: Velocidad de rotación moderada, el vacío aplicado, evaporando matraz en un baño de agua 50 ° C, y 24 ° C de circulación de agua a través del condensador.
    NOTA: De forma opcional, almacenar el gel magnetita antes de recubrir con PLGA.

3. Recubrimiento de nanopartículas de magnetita con PLGA Shell

  1. Disolver 3,60 g de PLGA (75/25 mezcla) en 240 ml de acetato de etilo para crear un (m / v) solución de 1,5%. PRECAUCIÓN: acetato de etilo es perjudicial -, usar equipo de protección personal y el trabajo en una campana de humos.
  2. Disolver 25,00 g de Pluronic F-127 en 500 ml de de-gaseados H 2 O usando un agitador magnético para crear un (m / v) solución de 5,0%.
    NOTA: Pluronic F-127 es un copolímero de bloques anfifílico no iónico que actúa como un agente tensioactivo biocompatible. Esto ayuda a estabilizar la emulsión aceite-en-agua en la etapa 3.3.2.
  3. Utilizando una microespátula, recoger el gel de magnetita en seis alícuotas 0,040 g dentro de viales de vidrio ponderados. Perform el siguiente proceso de recubrimiento y lavado para cada alícuota.
    NOTA: Las alícuotas son necesarias para asegurar una manipulación eficiente y decantación magnética, que maximizará pureza y el rendimiento y reducir al mínimo la degradación antes de la liofilización en el paso 4.
    1. Añadir un 0,040 g alícuota de gel de magnetita y 40 ml de la solución de PLGA a un vaso de precipitados de plástico y se somete a ultrasonidos en un limpiador ultrasónico durante 10 minutos.
    2. Añadir 80 ml de la solución de Pluronic al vaso de precipitados de plástico y emulsionar inmediatamente con un mezclador de laboratorio en la posición más alta durante 7 minutos para formar el revestimiento de PLGA en las nanopartículas de magnetita como una emulsión de aceite-en-agua.
    3. Inmediatamente diluir la solución SPION en 1 litro de H2O desionizada y sonicar durante 1 h en una campana de extracción química para evaporar el acetato de etilo.
    4. Coloque un imán fuerte junto a la solución SPION y revuelva suavemente para recoger SPIONs parduscos en el imán.
      NOTA: Puede ser necesario agitar de forma intermitente durante varias horass antes de que la solución se vuelve blanquecina que indica que la mayoría de los SPIONs se han recogido.
    5. Decantar la solución acuosa al tiempo que conserva los SPIONs en el vaso de precipitados con el imán.
    6. Lavar las SPIONs tres veces como sigue.
      1. Suspender los SPIONs en 1 litro de H2O desionizada
      2. Sonicar la solución SPION durante 20 minutos.
      3. Coloque un imán fuerte junto a la solución SPION y revuelva suavemente para recoger SPIONs parduscos en el imán. Puede ser necesario agitar intermitentemente durante varias horas antes de que la solución se vuelve clara que indica que la mayoría de los SPIONs han sido recogidos.
      4. Decantar la solución acuosa al tiempo que conserva los SPIONs en el vaso de precipitados con el imán.
  4. Recoge los SPIONs sintetizados a partir de cada una de las seis partes alícuotas de gel de magnetita en un único vial de vidrio ponderada como una suspensión acuosa. Opcionalmente decantar el exceso de agua magnéticamente según sea necesario.

4. CongelaciónSECADO de SPIONs

  1. Congelar la solución SPION.
  2. Liofilizar la solución SPION O / N en un liofilizador.
  3. Pesar los SPIONs liofilizados. SPIONs liofilizados pueden almacenarse a -20 ° C hasta su uso para el marcaje celular.
    NOTA: El almacenamiento a -20 ° C dramáticamente reduce la cinética de degradación y aumenta la vida útil.

5. Etiquetado de células con SPIONs

  1. Suspender una alícuota de SPIONs en solución salina tamponada con fosfato (PBS) a una concentración de 40 mg / ml y sonicar durante 30 minutos.
  2. Añadir la solución a un matraz SPION casi confluente de células a una concentración de 5 l / ml de medio de cultivo celular. Asegurar una distribución uniforme moviendo suavemente el matraz.
  3. Se incuban las células durante 16 horas a 37 ° C.
  4. Aspirar suavemente el medio de cultivo y lavar las células dos veces con PBS.
  5. Recoger las células marcadas magnéticamente y usar para los experimentos.
  6. Solución SPION no utilizado se puede almacenar a 4 ° C y debe ser nosotrosed dentro de unos meses. Sonicar durante 30 minutos antes de cada uso.

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Resultados

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Nanopartículas de magnetita son de aproximadamente 10 nm de diámetro, como resultado de agitación una solución acuosa de hierro (III) y cloruro de hierro (II) cloruro tetrahidrato a 50 ° C y 1000 rpm (Figura 1). Estos resultados demuestran la síntesis exitosa de nanopartículas de magnetita. Es importante para verificar el tamaño y la forma de nanopartículas de magnetita tomadas de una pequeña muestra del lote cuando se intenta la síntesis por primera vez. Microscopía electrónica de transmisión (TEM) es ...

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Discusión

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Como con cualquier protocolo de síntesis de nanopartículas, la pureza de los productos químicos reactivos es crítico para la consecución de SPIONs de alta calidad que tendrán efectos citotóxicos mínimos. Por tanto, es importante adquirir reactivos muy puros incluyendo el ácido oleico (≥99%), hierro (II) tetrahidrato de cloruro de (≥99.99%), (III) cloruro de hierro (≥99.99%), acetato de etilo (grado HPLC, ≥99.9% ), hexano (grado HPLC, ≥97.0%), hidróxido de amonio (≥99.99%), y sulfato de sodio (≥99.0%). Es de particular i...

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Divulgaciones

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

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Los autores desean agradecer la financiación del Fondo Europeo de Desarrollo Regional – FNUSA-CICR (no. CZ.1.05/ 1.1.00/ 02.0123), la Subvención para el Desarrollo Científico de la Asociación Americana del Corazón (AHA #06-35185N) y los Institutos Nacionales de Salud (NIH #T32HL007111).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Solución de hidróxido de amonio, 28% NH3 en H2O, ≥ Base de metal traza al 99,99%Sigma-Aldrich338818-100ML Reactivo nocivo: use equipo de protección personal
Frasco Dreschel, 500 mlAce Glass5516-16
Acetato de etilo, CHROMASOLVR Plus, para HPLC, 99,9% Sigma-Aldrich650528-1LReactivo nocivo: use equipo de protección personal y trabaje en una campana
Alcohol etílicoSigma-AldrichE7023Reactivo nocivo: use equipo de protección personal
Matraz evaporador, 50 ml, junta 24/40Sigma-AldrichZ515558Para uso con rotoevaporador
Papel de filtro, 3 cm de diámetro, grado 1Fisher09-805PPara usar con embudo de filtro de vidrio
Vasos de precipitados de vidrio, 1 LFisherFB-101-1000Para lavar SPIONs
Embudo de filtro de vidrio, adaptador de manguera de vacío, para 24/40, 30 mLFisherK954100-0344 
Tapones de vidrio para vialesFisher03-391-46Para usar con viales de vidrio Viales de
vidrio, 2 mlFisher03-391-44Para recolectar gel de magnetita & SPIONs
Hexano, CHROMASOLVR, para HPLC, ≥ 97.0% (GC)Sigma-Aldrich34859-1L Reactivo dañino: use equipo de protección personal y trabaje en la campana extractora
Ácido clorhídricoSigma-AldrichH1758Reactivo nocivo: use equipo de protección personal y trabaje en la campana extractora
Cloruro de hierro (II) tetrahidratado, ≥ 99.99% base de metales traza Sigma-Aldrich380024-5GReactivo nocivo: use equipo de protección personal
Cloruro de hierro (III) anhidro, polvo, ≥ Base de metales traza al 99,99%Sigma-Aldrich451649-1GReactivo nocivo: use equipo de protección personal
Calentador Isomantle, 500 mLVoight GlobalEM0500/CEX1
Mezclador de laboratorioSilversonL5M-A
LiofilizadorLabconco7670520
MicroespátulasFisher21-401-25APara la transferencia de magnetita gel
Imán de NdFeB, 1 pulgada x 1 pulgada x 1pulgada Imanes asombrososC1000H-MImán muy fuerte, maneje con cuidado
Ácido oleico, ≥ 99% (GC)Sigma-AldrichO1008-5G Almacenar en el congelador; Reactivo nocivo: use equipo de protección personal
Agitador aéreoIKA2572201
Pinza para agitador aéreoIKA2664000Para uso con agitador aéreo
Agitador aéreo Soporte en H IKA1412000Para uso con agitador
Salina tamponada con fosfatoLife Technologies10010-023
Vasos de precipitados de plástico, 250 mlFisher02-591-28
PLGA PURASORB PDLG (mezcla 75/25)PuracPDLG 7502PDLG 7502A; Almacenar en el congelador
Pluronic F-127 polvo, BioReactivo, apto para cultivo celularSigma-AldrichP2443-250G 
Paleta de cuchilla expandible de PTFE, 8 mm de diámetroSciQuipSP4018
Adaptador de recipiente de PTFE, para paletas 24/40, 8 mm de diámetroAdaptador de recipiente de PTFE Monmouth Scientific A480Para usar con paleta de cuchilla expandible de PTFE
Enfriador de recirculaciónClarkson696613Para usar con rotoevaporador
Condensador de reflujo, para 24/40, 250 mmAce Glass5997-133
RotoevaporadorClarkson 216949
Tabiques de goma, se adapta a 24/40Ace Glass9096-56
Embudo separador con tapón, 250 mlFisher10-438E
Sulfato de sodio ACS reactivo, ≥ 99.0%, anhidro, granularSigma-Aldrich239313-500G 
Matraz de fondo redondo de tres cuellos, acodado, 24/40 juntas, 500 mlAce Glass6948-16
Limpiador ultrasónico bandeja perforadaFisher15-335-20APara usar con limpiador ultrasónico
Limpiador ultrasónico, 2,8 LFisher15-335-20
Controlador de vacíoClarkson216639Para uso con rotoevaporador (opcional)
Vacío bombaClarkson 219959Para uso con rotoevaporador
extractora aéreo También se puede utilizar

Referencias

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