Bilayers Individual Molécula microscopía de fluorescencia en planar compatibles

Resumen

Aquí se muestra la preparación de bicapas lipídicas planas funcionalizadas con proteínas, la determinación de la movilidad de las proteínas en su interior y la medición de las densidades de las proteínas. Se esboza una hoja de ruta para la construcción de un microscopio de reflexión interna total con reducción de ruido, que permite visualizar fluorocromos residentes de una sola capa con alta resolución espacio-temporal.

Resumen

En el transcurso de una sola década, la microscopía de una sola molécula ha pasado de ser un dominio aislado compartido únicamente por físicos con una sólida formación en óptica y física láser a una disciplina que ahora está disfrutando de una vívida atención por parte de los científicos de la vida de todos los lugares ¹. Esto se debe a que las imágenes de una sola molécula tienen el potencial único de revelar el comportamiento de las proteínas in situ en células vivas y descubrir la organización celular con una resolución sin precedentes por debajo del límite de difracción de la luz visible ². Las bicapas lipídicas planas (SLB) soportadas por vidrio son una herramienta poderosa para acercar las células que de otro modo crecerían en suspensión lo suficientemente cerca del portaobjetos de vidrio para que puedan obtenerse fácilmente en el modo de iluminación de reflexión interna total con reducción de ruido ^3,4. Son muy útiles para estudiar la dinámica de las proteínas en eventos asociados a la membrana plasmática tan diversos como la formación de contacto célula-célula, la endocitosis, la exocitosis y el reconocimiento inmune. Se presentan procedimientos sencillos sobre cómo generar SLBs funcionalizados a proteínas altamente móviles de manera reproducible, cómo determinar la movilidad de las proteínas dentro de ellas y cómo medir las densidades de las proteínas con el uso de la detección de una sola molécula. Se muestra cómo construir un sistema de microscopía de molécula única rentable con capacidades de iluminación TIRF y cómo operarlo en el experimento.

Introducción

La comprensión de los mecanismos por los que las proteínas de membrana cumplen su función celular a menudo puede ser una tarea difícil, porque sus modos de acción se definen a menudo por las interacciones de afinidad baja, que son difíciles de detectar y evaluar mediante metodologías bioquímicas convencionales. Las proteínas de membrana pueden además ser altamente enriquecido en dominios específicos de membrana ^5,6 o formar estructuras de orden superior dinámicos, que pueden, en principio, alterar su actividad biológica ^7.

Tanto sola molécula de microscopía de fluorescencia láser asistida no invasiva se ha convertido en la metodología de elección para estudiar el comportamiento de proteínas en entornos celulares complejos. Esto es especialmente cierto para los procesos bioquímicos que tienen lugar en la membrana plasmática, ya que pueden, en principio, ser controlados en el modo de reducción de ruido reflexión interna total (TIRF). Aquí iluminación de la muestra se restringe a una rebanada de hasta 200 nm-delgada en las proximidades de un vaso surface, lo que resulta en una pérdida significativa en el fondo celular y, debido a las características de la luz de excitación evanescente, también en un aumento sustancial en la intensidad de señal de fluorescencia ^8,9. Ambos aspectos son importantes cuando se pretende para alta resolución posicional y temporal en la detección de moléculas individuales.

Planar SLBS no sólo son compatibles con la microscopía TIRF. Cuando funcionalizado con ligandos adecuados que también proporcionan acceso directo al estudio de la dinámica molecular de reconocimiento célula-célula a medida que ocurren en las células inmunes u otras células. También pueden ser simplemente utilizadas para posicionar células móviles y por lo demás no adherentes lo suficientemente cerca para el portaobjetos de vidrio de modo que tales células se pueden obtener imágenes en la iluminación TIRF, que es altamente deseable cuando los experimentos de conducción que implican seguimiento molécula simple o simple superresolución a base de molécula. Con este fin proteínas tienen que ser cargado en un SLB altamente móvil. Una ventaja inherente de la li utilizado Los PID son que no hay unión no específica de proteínas en absoluto. Por otra parte, SLBS pueden considerarse como líquidos de dos dimensiones con una capacidad inherente de curarse a sí mismos; irregularidades en el soporte de vidrio se compensan hasta un cierto grado. Un protocolo paso a paso se proporciona para generar bicapas altamente móviles encargadas de proteínas de interés. La formación de SLBS planas se describe, que contienen 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (POPC) como el ingrediente principal (de 90-99%) y el sintético y funcionalizado de lípidos de 1,2-dioleoyl- sn -glicero-3 - {[N (5-amino-1-carboxipentil) iminodiacético ácido] succinil} sal de níquel (DGS NTA-Ni) en baja abundancia (1-10%). POPC lleva un ácido graso saturado y un ácido graso monoinsaturado y forma bicapas lipídicas de alta fluidez incluso a RT. DGS NTA-Ni se une con su grupo de cabeza a las colas de poli-histidina y sirve como anclaje para proteínas etiquetadas-poli-histidina de elección (Figura 1).

"> Es importante destacar que el hardware microscopía debe incluir un número de periféricos que se describen a continuación. Con la información proporcionada y algunos conocimientos básicos de la óptica y la física láser, cualquier biólogo debe ser capaz de construir una sola configuración de imágenes molécula. Excitación de la muestra debe ser idealmente realizado en un microscopio invertido en el modo de reflexión interna total (TIRF) como este régimen reduce la luz espuria y el fondo excesivo resultante de otra forma de celular autofluorescencia ^9. Para ello, un objetivo especial TIRF capaz (ver más abajo) y se necesitan iluminación láser. Algunos experimentos requieren tiempos de iluminación dentro del rango de milisegundos y operado en una sucesión rápida. Para ahorrar tiempo de iluminación o para evitar el blanqueo innecesario causado por iluminación repetitivo a menudo es útil para dividir la luz emitida en dos o más canales espectrales. Esto permite una lectura simultánea de dos o más perfiles de emisión, que pueden convertirse en un factor significativo cuando CONDUCting experimentos que implican transferencia de energía de resonancia Förster (FRET). Aquí la emisión resultó de un impulso de luz de excitación solo se puede grabar tanto del donante FRET y FRET aceptora (como la emisión sensibilizada). La cámara debería capturar suficientes fotones con suficientemente bajo fondo para visualizar fluoróforos individuales durante el tiempo de iluminación. Aplicaciones informáticas tendrá que estar preparado para la tarea de sincronizar cierre de excitación y de adquisición de imágenes. Una visión global se da a continuación y en la Figura 2:

Objetivo a TIRF capaz: Para la iluminación TIRF basada en el objetivo de la apertura numérica (NA) del objetivo debe ser igual o mayor que 1,4 utilizando portaobjetos de vidrio estándar (n = 1,515) ^9. La ampliación puede oscilar entre 60x a 150x. El objetivo debe ser corregida cromáticamente para permitir confocalidad cuando la formación de imágenes diferentes fluoróforos.

Láseres: El número de lase disponiblesOpciones R ha aumentado significativamente en los últimos años. Modernos láseres de onda continua de diodos electrónicamente modulables son rentables y pueden funcionar con frecuencia y velocidad sin precedentes. Más caros láseres de iones de gas sobresalen en la calidad del haz láser, pero requieren de obturación externo (véase más adelante) y, a menudo extensa (agua) de refrigeración.

Persianas de Excitación: moduladores acústico-ópticos (OMA) permiten cierre rápido en rápida sucesión ^10. Para apretado cerrando la combinación de un AOM con los obturadores mecánicos se recomienda. De esta manera extensa calentamiento de la OMA debido a la exposición de luz continua se evita y la luz se escape de la OMA en el fuera de posición se anula.

Las lentes se utilizan para ampliar haces de láser y para enfocar ellos sobre el plano focal posterior del objetivo. De esta manera, la luz de excitación sale del objetivo como un haz paralelo (Figura 3), que se requiere para la iluminación de TIRFla muestra. Moviendo el punto focal dentro del plano focal posterior desde el centro a la periferia del objetivo va a cambiar el ángulo en el que el haz sale del objetivo, pero no la ubicación del punto de láser en la muestra (Figura 3), que es una función de la geometría de haz global. Iluminación TIRF sobreviene en un ángulo crítico, que se puede ajustar utilizando un conjunto de espejos que funcionan como un periscopio para traducir el punto focal del láser dentro del plano focal del objetivo. Las lentes deben ser corregidas cromáticamente y se pueden utilizar en un conjunto de dos o tres lentes. Un sistema de tres lente consiste en dos lentes que actúan como un telescopio para ensanchar el haz de láser (y por lo tanto el punto de iluminación en la muestra) y una tercera lente para enfocar el haz ensanchada en el plano focal posterior del objetivo (Figura 4). Ambas funciones (telescopio y de enfoque) también se puede lograr por una combinación de sólo dos lentes (véase la figura 4).

Espejos debe ser de al menos el 95% reflectante para evitar la pérdida de la luz láser. Para cada ajuste del haz de un conjunto de dos espejos se aplica normalmente como tal disposición es suficiente para ajustar con precisión cualquier ángulo y la posición de un rayo láser.

Superposiciones dicroicos reflejan y transmiten la luz de diferentes longitudes de onda específicas y se utilizan para superponer o dividir los haces de dos láseres.

Filtros Polychroic son más complejos que los filtros dicroicos y son necesarias para reflejar la luz de excitación de entrada y salida de transmitir luz de emisión de la muestra. Se colocan en el cubo de filtro entre el objetivo y la lente del tubo del microscopio.

Limpie los filtros: Dependiendo del tipo de employe láser d láser limpiar los filtros con un ancho de banda de transmisión estrecha debe ser colocado en el haz de láser justo después de que sale del láser.

Filtros Notchestán diseñados para absorber con eficacia la luz láser con un ancho de banda estrecha y transmitir toda otra luz. Se colocan dentro de la trayectoria de emisiones para filtrar cualquier luz de excitación láser espuria. Sin embargo, filtros de corte funcionan sólo a 0 ° de ángulo de entrada. Si la anchura de banda del filtro de corte es muy fuerte, los diferentes ángulos entrantes no pueden reflejarse más. El bloqueo de la luz láser láser colimado no se ve afectada, pero la luz retrodispersada no puede ser obstaculizada de manera eficiente de llegar a la cámara.

Ruedas de filtros motorizados equipados con ruedas de filtros adecuados se pueden colocar fácilmente en la vía de excitación y de emisión y permiten conmutación simple entre diferentes intensidades de luz (cuando está equipado con filtros ND) o canales fluorescentes (cuando se coloca delante de una lámpara de arco de xenón o de mercurio para radiométrica imágenes de calcio o delante de la cámara para seleccionar el fluoróforo emisor de luz).

50:50 cubo divisor de haz cun ser utilizado para dividir rayos láser en dos trayectorias de rayos de excitación separados y también para combinarlos en frente del periscopio.

Divisor de haz (camino de emisión): Para la adquisición rápida de imágenes sin necesidad de cambios de filtro físico, el haz de emisión se divide en un canal azul-cambiado y desplazada al rojo. En principio, divisores de haz pueden ser construidos mediante el empleo de una cuña dicroico o un conjunto de espejos y un espejo dicroico para separar el haz de emisión de una manera dependiente de la longitud de onda. Se necesitan dos filtros de emisión para limpiar los canales emitidos.

Filtro espacial: filtrado espacial del haz de excitación es a veces necesaria para eliminar los rayos de luz no paralelos emitidos por rayos láser de baja calidad. Un filtro espacial consiste en un telescopio de dos lentes con un pequeño agujero de alfiler colocado exactamente en el punto focal de ambas lentes. Esta luz espuria manera resultante de las porciones no paralelos del haz de láser se bloquea de manera eficiente. Such condiciones se deben cumplir al establecer la microscopía basada en TIRF. Aumentos filtrado espacial con poros más pequeños, que son más difíciles de colocar en el punto focal, y con distancias focales más pequeñas de la primera lente. Para reducir los efectos causados ​​por aberraciones de la lente es ventajoso emplear en lugar de simples lentes de alta calidad y objetivos de microscopio infinito-corregida con bajo aumento (10x o 20x).

Periscopio: Una configuración periscopio es necesario traducir el rayo láser enfocado en el plano focal del objetivo, un requisito previo para la imagen TIRF. Puede ser fácilmente construido a partir de dos espejos de dos pulgadas, una etapa de traslación para ajustar el primer espejo y un poste para posicionar el segundo espejo para reflejar la ensanchado y centrado haz de excitación en el microscopio (Figura 5).

Cámara: Back-iluminado Electron-Multiplicación de dispositivos de carga acoplada (EMCCD) se utilizan rutinariamente parala grabación de señales sola molécula. Esto es debido a su alta eficiencia cuántica (hasta 95%), alta velocidad de adquisición (hasta 30 MHz) y comparativamente bajo nivel de ruido. Enfriamiento hasta -80 ° C reduce el ruido térmico y con el apoyo de una serie de cámaras EMCCD actualmente disponibles. Una limitación de la tecnología es que EMCCD ruido de la cámara aumenta linealmente con la tanto la ganancia de la cámara y la señal que está siendo capturado. Este no es el caso con las cámaras científicas CMOS (sCMOS), que son significativamente menos caros y operan debido a la arquitectura especial del chip sCMOS también mucho más rápido que las cámaras EMCCD. Sin embargo, un problema asociado con la tecnología CMOS es que la adquisición de imágenes todavía carece de un cierto grado de una lectura cuantitativa en un solo nivel molécula, debido a que cada pixel cuenta con diferente sensibilidad de detección. En principio esto se puede compensar a través de la normalización pixel, pero este procedimiento no es en absoluto triviales ^11. Es por eso que todavía dudamos en volverfelicitar cámaras sCMOS para microscopía sola molécula, pero en vista de la rápida evolución de esta tecnología, cámaras sCMOS pronto podría convertirse en la cámara de elección. Slow cámaras cámaras CCD de escaneo de evitar el ruido y píxeles de varianza relacionados amplificación todos juntos y soportan velocidades de adquisición más rápidos si se pueden operar en un modo denominado 'cinético'. En este modo todo el chip de la cámara a excepción de una región de interés (ROI) está enmascarado, que hace que sea posible emplear el propio chip como un dispositivo de almacenamiento. Tras el retorno de la inversión se expone por primera vez, los cargos resultantes se desplazaron a la zona enmascarada de la línea de píxeles de chips por línea de píxeles, donde la imagen está protegida de mayor exposición a la luz. Una vez que el desplazamiento de todas las líneas de la ROI en la región enmascarada se ha completado (en el rango sub-milisegundos), el propio ROI está listo para la próxima exposición. Este ciclo se repite hasta que se cargan todas las líneas de píxeles del chip CCD. El chip se lee a continuación lentamente con marcadamente reduruido de lectura ced. Por ejemplo en un chip de 1000 x 1300 píxeles, 20 ROIs de 50x50 píxeles se pueden grabar en una sucesión rápida. Debido a que las imágenes permanecen en el chip durante un tiempo considerable antes de ser leído, es crítico para asegurar el enmascaramiento de alta calidad y para enfriar la cámara (por ejemplo, con nitrógeno líquido) como un medio para reducir el ruido térmico excesivo. Algunas cámaras EMCCD también soportan el modo de cinética.

Software: El tiempo de los láseres, persianas, AOMS y exposición de la cámara, así como el almacenamiento de imágenes adecuado son esenciales para cualquier experimento de imágenes exitosa. En principio muchas operaciones definidas se pueden programar con paquetes de software disponibles que vienen con la cámara. Paquetes de software comerciales soportan un gran número de periféricos de hardware, que pueden ser implementadas con poco conocimiento técnico.

Generador de impulsos, adquisición de datos (DAQ) (con canales analógicos y digitales de salida) y el osciloscopio: Un generador de pulso es unexcelente elección para convertir impulsos de disparo en impulsos de tiempo y tensión definida. De esta manera los láseres pueden ser controladas precisamente por la potencia de salida y sincronizados en el milisegundo de rango sub-milisegundo. Tarjetas DAQ con salidas analógicas lograr lo mismo y se integran fácilmente en la placa base del ordenador a través de las ranuras PCI. La duración del impulso, amplitud y frecuencia se verifican con un osciloscopio.

Recinto de toda la trayectoria del haz de excitación: Para evitar las fluctuaciones en el perfil de excitación debido a convecciones de aire la ruta completa haz de excitación debe ser encerrado de su entorno de laboratorio. Esta medida es especialmente importante cuando se realiza la microscopía TIRF. Componentes ópticos también están protegidos del polvo y el ojo humano de exposición a la luz láser. Recintos pueden construir fácilmente de cartón negro, que se puede comprar en las tiendas de artes.

Para determinar la fluidez de la recuperación SLB fluorescencia después Photobleaching (FRAP) medidas ¹² se llevan a cabo. Para FRAP la existencia de dos trayectorias de rayos de excitación es aconsejable (véase la Figura 3). La primera trayectoria de rayos está diseñado para la imagen de la fluorescencia de la bicapa. Esto se puede hacer en la configuración TIRF y con baja intensidad de luz. La segunda trayectoria del haz debe permitir una breve pero intensa pulso blanqueador y debe ser configurado en modo no TIRF, para que salga el objetivo a lo largo del eje óptico. Una abertura redonda se puede colocar en la trayectoria del haz de excitación (véase la figura 8) para proyectar un perfil blanqueador perfectamente redondo con bordes definidos. Con el fin de imagen de esta abertura sobre el plano de objeto, su posición óptima sería en el plano focal de la lente 3 (véase la Figura 3). Sin embargo, debido a la longitud focal larga de esta lente, una imagen de abertura de suficiente calidad puede también ser generado, cuando la abertura se coloca en posiciones ligeramente desplazadas.

Después de haber realizado tque la formación de imágenes experimento los datos en bruto deben ser analizados apropiadamente. Varios protocolos paso a paso se ofrecen, que cubre el ajuste de los parámetros principales (por ejemplo, potencia de iluminación y de tiempo, ángulo TIRF), adquisición y análisis de los datos.

Protocolo

1. Generación y funcionalización de planar SLBS

1. La mezcla de los lípidos
   1. Para llegar a una DGS NTA-Ni / 90% composición lipídica POPC 10% se disuelven 45 mg de POPC y 6,9 mg DGS NTA-Ni en cloroformo en un matraz de 250 ml de fondo redondo. Mantenga el volumen de baja cloroformo (sólo varios ml) se evapore en el siguiente paso. Para una DGS NTA-Ni / 99% composición de lípidos POPC 1% utilizar 49,5 mg y 0,69 mg POPC DGS NTA-Ni.
   2. Eliminar el cloroformo utilizando un evaporador rotatorio lentamente - un aumento por encima de la temperatura ambiente no es necesario. Alternativamente, soplar fuera dentro de una campana química en una corriente de gas inerte tal como nitrógeno o argón. Mientras se hace girar constantemente este matraz para permitir la igualdad de deposición del lípido secado en la mitad inferior del matraz de fondo redondo.
   3. Una vez que se evaporó la mayor parte del cloroformo, adjuntar el matraz para aspirar O / N para eliminar el cloroformo cuantitativamente.
      NOTA: Este paso es fundamental para evitar la contaminaciónde proteínas y células con cloroformo tóxico en las etapas posteriores y para asegurar la fluidez de la bicapa lipídica.
2. Generación de pequeñas vesículas unilaminares (SUV) de lípidos secos
   NOTA: pequeñas vesículas unilaminares (SUVs) son entre 20 nm y 100 nm de diámetro y se pueden producir fácilmente por tratamiento con ultrasonidos de baño. Extrusión de lípidos, un método alternativo, puede dar lugar a SUVs y, dependiendo del tamaño de poro del filtro aplicado para la extrusión, también vesículas unilamelares grandes (LUV), que son 100 nm a 1000 nm de tamaño. Sin embargo, todo terrenos son los más adecuados para la formación de SLBS.
   1. SUVs través de ultrasonidos de baño (que se muestran en el video):
      1. Desgasifique PBS. Suspender la mezcla de lípidos seca con los 250 ml matraz de fondo redondo de 10 ml desgasificado PBS.
      2. Llenar el matraz con gas inerte tal como nitrógeno o argón, cerrarlo con un tapón y sellar el matraz con cinta de autoclave.
      3. Coloque el frasco cerrado en un baño de ultrasonido y sonicar el lípido suspensión unt 120 a 170 W hasta que se ha vuelto clara. Esto toma entre 30 y 60 min.
      4. Monitorear el progreso de la vesícula formación espectro-fotometría: derivarse que la absorción de la emulsión sin diluir en comparación con PBS se mantiene constante a 234 nm (como un indicador aproximado de la concentración de lípidos) todavía debe bajar de manera significativa a 550 nm (debido a una menor dispersión de la luz a través de partículas más grandes).
      5. Para sedimentar las vesículas unilamelares no pesados, que interfieren con la formación de un SLB contigua, sedimentar la suspensión de vesículas por centrifugación, a 150.000 xg durante 1 hora a 25 ° C y luego durante 8 horas a 288.000 xg, 4 ° C.
      6. Filtrar el sobrenadante a través de un filtro de jeringa con un diámetro de poro de 0,2 micras.
      7. Medir la DO a 234 nm y 550 nm para controlar la claridad de la preparación de vesículas y la cantidad de lípidos izquierda.
      8. Guarde las vesículas a 4 ° C en atmósfera de argón o nitrógeno. Opcionalmente, utilice suspensión de vesículas bicapa para la preparación depor muchos meses.
   2. SUVs mediante extrusión de lípidos:
      1. En resumen, pasar la suspensión de lípidos varias veces a través de un filtro con un tamaño de poro de 0,1 micras. Independientemente del método de fabricación, centrifugar la suspensión de vesículas dos veces (1H, 150,000g, 25 ° C; a continuación, 8H, 4 ° C, 288.000 g) para sedimentar las vesículas no unilamelares que son más pesados.
         NOTA: Cuando se almacena a 4 ° C bajo gas inerte, las vesículas se pueden utilizar para la preparación bicapa durante varios meses.
3. Formación de un SLB y cargar con la proteína
   1. Tratar 24 x 50 mm # 1.5 portaobjetos de vidrio con una mezcla 3: 1 de ácido sulfúrico concentrado y peróxido de hidrógeno al 30% durante 30 min.
      NOTA: Debido a la naturaleza agresiva de la mezcla tome un cuidado especial, es decir, llevar una bata de laboratorio y gafas de seguridad como se muestra en el video!
   2. Enjuagar los portaobjetos de vidrio bajo una corriente de _ddH2O fuera de una botella con atomizador. Colóquelos en un soporte de teflón y déjelos secardurante 10 a 30 min.
   3. Retire la placa de vidrio inferior de 8 o 16 cámaras así, llenar el fondo con pegamento epoxi y coloque cuidadosamente un portaobjetos de vidrio limpio y seco en el fondo de la cámara de cola cubierta. Deje que el pegamento se endurezca durante aproximadamente 10 min. Retire el exceso de pegamento de la parte inferior.
      NOTA: un sello hermético entre el portaobjetos de vidrio y la cámara también se puede lograr fácilmente con el uso de un de dos componentes dental pasta de modelar de silicona, que se endurece dentro de 10 a 30 min. Este sello no es tan firme como el pegamento epoxi, pero resiste la tensión física regular. Después del experimento se puede retirar fácilmente de la cámara, que luego es reutilizable en futuros experimentos.
   4. Pipetear 120 l (60μl) de una suspensión de lípidos veces 10 diluida PBS-en cada pocillo de un niño de 8 (16) - así cámara (preparado como se ha descrito anteriormente) y dejar que la forma bicapa durante 20 min. Enjuagar cuidadosamente la bicapa dos veces con 15 ml de PBS. Una vez se ha formado la bicapa, siempre debe estar sumergida en tampón y nunca se expone al aire.
   5. Llene cada pocillo hasta el final con PBS, luego despegar 330μl (cámara de 8 pocillos) o 165μl (cámara de 16 pocillos). Hay 350μl (175μl) dejó en el pozo. Añadir 50 l (25 l) de cóctel que contiene proteínas etiquetadas-His diluido en PBS a cada pocillo (400 o 200 l final) y se incuba a TA durante 60 min en la oscuridad. La densidad de proteína de la superficie se puede ajustar mediante la variación de la concentración de proteína durante esta etapa de incubación.
   6. Enjuague cada pocillo dos veces con 15 ml de PBS.
      NOTA: Por lo general, SLBS se debe utilizar en los experimentos de no más de 6 horas después de su carga con la proteína. Durante este periodo, la recuperación después de photobleaching fluoróforo permanece hasta el 95% y sin pérdida de la proteína asociada a la bicapa se puede detectar. La densidad de la proteína debe ser determinado antes del experimento (véase a continuación).
   7. Paso opcional: Para probar la unión no específica de la proteína de la DGS NTA-Ni que contiene SLB, lavar el SLB una vez con PBS que contiene imidazol 300 mM. El PROproteína debe salir por completo.

2. Microscopio de instalación

1. Para la construcción de un sistema de microscopía capaz de detectar la fluorescencia de fluorocromos individuales consulte las recomendaciones indicadas en la introducción.

3. Mediciones Eléctricas

NOTA: Los fluoróforos pueden ser fácilmente saturados con el exceso de luz de excitación. Esto acelera fotoblanqueo sin mayor ganancia en emisión y debe evitarse tanto. Para optimizar la iluminación de la muestra la densidad de potencia de excitación debe ser medido directamente en el espécimen. Tales mediciones pueden también servir como una referencia para futuros experimentos. Además, conociendo la relación entre la potencia de entrada y de salida de láser es útil al evaluar donde la luz se pierde en el sistema de imágenes.

1. Mover el haz de excitación a la posición vertical para que salga el objetivo en un ángulo de 90 °.
2. Coloque la cabeza del medidor de potencia en la parte superior of la viga y medir la potencia del haz (= P). Documentar el resultado.
3. Utilizando el periscopio, gire el haz en la posición TIRF y la imagen de una bicapa fluorescente homogéneo intacta. Para evitar la decoloración y la saturación de la señal CCD lugar una densidad neutra (ND) del filtro con una densidad óptica (DO) de 2 a 3 en la trayectoria de la luz de excitación.
   1. Mida las cuentas integradas de todo el campo iluminado (= I _total). Además, medir el tamaño de la zona iluminada (= A _total). Medir las cuentas integradas (= I _Center) del punto central de máxima iluminación, así como el tamaño del punto (= a _centro).
4. Mida la señal de fondo por píxel (= B) o bien fuera de la zona iluminada o sin iluminación de la muestra.
5. Reste la señal de fondo a partir de los resultados medidos en 3.). Para ello, multiplicando el número de píxeles de la zona en cuestión (área entera iluminada o punto central) con el fondocuentas por píxel. (= I _{Total -} A .B _totales y yo _{Center - Un} centro .B).
6. Divida el integrado y corrección de fondo de la señal del punto central de la señal integrada y fondo con corrección de todo el campo de la iluminación.
   NOTA: El resultado indica la fracción de la potencia total situado dentro del punto central (= _(centro I - _Un centro .B) / (I _{Total -} A .B _total)). Multiplicación de este resultado con el P potencia medida en 2.) resultados en el poder de la luz que ilumina el punto central.
7. Determine el tamaño de la mancha _Un centro en μm². Por esta dividir el tamaño de píxel cámara en micras por el aumento del objetivo, toma la plaza del resultado como μm² por píxel.
   1. Alternativamente medir el tamaño de píxel dentro de la imagen con el uso de una diapositiva micrómetro colocado en el microscopio y tomar el cuadrado de la zona de resultado como por píxel. Multiply este valor por el número de píxeles situados dentro del punto central para llegar a la zona de punto iluminado.
8. Dividir la potencia P que ilumina el punto central por el tamaño del punto central _de un centro, _μm² para calcular la intensidad de iluminación por ² micras. Un ejemplo se da en la figura 6.
9. Valores de densidad de potencia medidos en la iluminación no TIRF suelen ser inferiores a los presentes en la iluminación TIRF ^13, que también depende del ángulo exacto en el que la luz láser está totalmente reflejada. Para llegar a densidades de potencia presentes bajo iluminación TIRF, imagen calibrada perlas fluorescentes de diámetro 0.1μm tanto en no TIRF y TIRF. La relación de intensidades de fluorescencia del grano medido en TIRF y el modo no TIRF asciende a el factor de conversión C, que permite la conversión de los valores de densidad de potencia medidos en los efectivos bajo iluminación TIRF (ecuación 1).
   Densidad de poder _TIRF = C • densidad de potencia _{no TIRF} (ecuación 1)
   con C = intensidad del grano _{T IRF} intensidad / perlas _{no TIRF}

4. Densidad Las mediciones

1. Determinar la señal media de los fluoróforos individuales situados en una bicapa. Moléculas MHC bicapa unida cargadas con péptidos fluorescentes son ideales para este propósito ya que la proteína: etiqueta estequiometría es exactamente una. Si lejía necesaria todas las etiquetas de la bicapa en el campo de visión y dejar que la fluorescencia se recuperan de visualizar fluoróforos individuales.
   1. Graba imágenes en rápida sucesión (por ejemplo, se aplican una adquisición de streaming de protocolo) y supervisar las moléculas individuales de movilidad en varios marcos. Para obtener más información consulte la Figura 7.
2. Marque el punto central de la iluminación dentro de la bicapa como retorno de la inversión. Medir el ROI, la variación en densidad de potencia de iluminación (que es proporcional a la intensidad de fluorescencia) debe ser idealmente menos de 15%.
   1. Determinar sola molécula y fluorescencia mayor sólo dentro de este retorno de la inversión. Integrar la señal de un retorno de la inversión, que es lo suficientemente grande como para capturar el 99% o más de la función de dispersión de punto del único emisor. Cuando se emplea una cámara con un tamaño de píxel de 16-20 de micras (indicado en las especificaciones de la cámara del fabricante), un objetivo con un aumento de 100 veces y una abertura numérica igual o mayor que 1,45, tome una región de 7 por 7 píxeles con el pico de intensidad situado en el centro de la plaza.
   2. Para determinar la señal de fondo, integrar los cargos de un cuadrado de 7 por 7 pixel vecino, que no contiene una señal de fluorescencia. Reste el fondo de la señal de moléculas individuales para determinar el valor corregido para una sola molécula de flúorescencia. Seleccionar sólo las señales, que son todavía visibles en el siguiente cuadro.
3. Repita el paso 4.2 cincuenta a varios cientos de veces. Un promedio de la señal de fondo con corrección. Si lo desea, trazar valores de intensidad de una sola molécula como un histograma. Opcional: tomar ventaja de un plugin adecuado de paquetes de software de código abierto (por ejemplo ImageJ) o procesar los datos utilizando un software comercial (por ejemplo Metamorph, Molecular Devices). Los usuarios experimentados pueden escribir su propio programa de análisis en Matlab o paquetes de software similares.
4. Coloque un filtro de densidad neutra de 2 o más alto en el camino de excitación y tomar imágenes de una bicapa fluorescente que contiene proteínas marcadas con el mismo fluoróforo. Anote la intensidad media de píxeles dentro de la misma ROI utilizado para mediciones de la intensidad de una sola molécula. Registre el tiempo de exposición de las medidas de fluorescencia a granel. Mida el mismo lugar sin iluminación para la sustracción de fondo.
5. Para determinar la densidad de proteína dentro de la bicapa, multiplicar la intensidad de píxel media de fluorescencia mayor fondo corregida determinada en la etapa 4 por el número de píxeles por cuadrado micras (por ejemplo, 41.5), por 100 (si se emplea un filtro ND con una DO de 2) o 1.000 (si un ND se utilizó filtro con un diámetro exterior de 3) y el tiempo de exposición utilizada en el paso 2 y se divide por la media de la señal única molécula determinada en el paso 3, el tiempo de exposición utilizada en el paso 2 y el número de fluoróforos por proteína.

5. Prueba de la integridad de la bicapa

1. Preparar una bicapa fluorescente y colocarlo en la platina del microscopio como se describe anteriormente.
2. Ajuste el enfoque y tome la imagen de la bicapa en modo TIRF. Aplicar un corto pero intenso pulso de blanqueador en modo no TIRF para la ablación de la fluorescencia en un pequeño retorno de la inversión en forma de disco.
3. Tome una imagen de la bicapa en el modo de baja intensidad TIRF inmediatamente después del blanqueo y luego cada cinco a diez segundos para controlar la velocidad de recuperación de fluorescencia.
4. Move a un área diferente de la bicapa y siga los pasos 2 y 3. Tome otra imagen en el modo de TIRF baja intensidad 5 min después del impulso de lejía. Determinar la intensidad _he puesto _blanqueador en el área de lejía y lo comparo con la intensidad antes de blanquear _I 0 al comienzo del experimento (sin blanqueo debería haber ocurrido) para calcular la fracción inmóvil (SI) de la siguiente manera:
   Fracción inmóvil IF (%) = (I ₀ - _Puedo publicar _lejía) / (I ₀ - fondo) x 100,
   con el fondo = intensidad medida en el retorno de la inversión sin luz de excitación aplicada
   El IF debe ser inferior a 10% (idealmente menos de 5%).

Resultados

La arquitectura del sistema de microscopía de fluorescencia de una sola molécula se describe en considerable detalle en la figura 2. Las piezas individuales tales como los componentes ópticos y otros componentes de hardware se explican en la introducción. Las trayectorias de los rayos ópticos de excitación, que dan lugar de una manera definida de TIRF y la iluminación no TIRF, se muestran y explican en las figuras 3 a 5. Nota la ubicación del divisor de haz 50:50 delante del espejo colocado en primera periscopio una etapa traducible micrómetro (Figura 5). Este divisor de haz superpone el haz TIRF utilizado para la formación de imágenes (indicado en verde) y la viga no TIRF (indicado en rojo) que se utiliza para el blanqueo o la activación de la muestra luz mediada por la abertura definida por el local (tal como se indica en la Figura 3). Los caminos combinados de luz (Figura 5, indicados en naranja) se reflejan a través del segundo espejo periscopio en el puerto posterior de la micr invertidaoscope. Como se explica en la Figura 4 y se indica en la Figura 2, la implementación de dos o tres lentes convexas ensancha los perfiles de rayo láser y se enfoca los rayos láser en el plano focal posterior del objetivo de dar lugar a dos haces colimados iluminando la muestra en TIRF y , respectivamente, en no TIRF.

Un ejemplo para los valores de intensidad medidos requeridos para el cálculo de la densidad de potencia sobre el espécimen se muestra en la Figura 6. La media de la señal de fondo que se sustrae de intensidades medidas en la zona iluminada y central (utilizado para la formación de imágenes), se determina en una región dentro de la campo de visión, que no está iluminada por el haz de láser (en este caso 7089 cuentas). Los antecedentes corregido intensidades medias de los recuentos de iluminación (1684) y el área central (4830 cuentas) se multiplican por los tamaños región correspondiente para dar lugar a intensidades integradas (1,471x 10 ⁸ conteos de la zona iluminada y 3.424 x 10 ⁷ recuentos de la zona central). La relación de las intensidades integradas dentro de las regiones central y sistema de iluminación produce la fracción de la potencia total que ilumina la zona central (0,23 o 23%). Como se muestra en la película, la potencia total tiene que ser determinada en el objetivo con el uso de un medidor de potencia en el modo de iluminación no TIRF. En nuestro ejemplo se ajusta a 5 mW, lo que daría lugar a una potencia de 5 mW x 0,23 = 1,15 mW dentro de la zona central. Desde 41,5 píxeles cantidad en nuestro ejemplo a 1 m ^2, el área central tiene un tamaño de 7089 pixeles /41.5 píxeles x ² micras = 170,8 m ^2. La división de la potencia de la luz que ilumina el área central (1,15 mW) por esta área (170,8 m ²⁾ se obtiene una potencia mediadensidad de 0,7 kW / cm ² dentro de la zona central.

Figura 7 muestra imágenes y resultados de intensidad correspondientes de fluoróforos individuales adquiridos en rápida sucesión (100 fotogramas por segundo, es decir, con un marco de tiempo de 10 ms). Para la cuantificación de intensidad de la señal media de una región rectangular de siete por siete (= 49) píxeles, que cubre la señal de fluorescencia, se determina. Además, la media de la señal del fondo se determina dentro de una región rectangular de siete por siete píxeles en las proximidades de la señal de una sola molécula. La señal de fondo media corregida se multiplica por el número de píxeles dentro de la región (= 49) para dar lugar a la señal de una sola molécula (marcada en negrita).

Un experimento FRAP representante diseñado para evaluar la movilidad de las proteínas marcadas con fluorescencia asociados-SLB se muestra en la Figura 8. Nota en la figura 8A la repetitiva uso de un haz de formación de imágenes de baja intensidad ensanchado y el uso individual de un segundo más estrecho y la abertura definida luz alta intensidad para la ablación fluorocromo rápida en el segundo punto de tiempo cero. Intensidades media de fondo-resta dentro del círculo amarillo, que han sido normalizado por el valor de intensidad media inicial antes del pulso lejía, se representan gráficamente en la Figura 8B contra el tiempo para registrar la velocidad y grado en el que la fluorescencia se ha recuperado. Como se muestra, más del 90% (indicado por la línea verde) de la intensidad inicial bicapa se ha recuperado dentro de 75 segundos después de la ablación fluorocromo. Como consecuencia de menos de 10% de las proteínas embebidas en el SLB mostrado son inmóviles.

Figura 1. Esquema Esquema de un sistema SLB. SLBS (A) están hechos de POPC (90-99%) y el lípido sintético DGS NTA-Ni (1-10%). Ellos forman espontáneamente cuando las superficies de vidrio limpias están acusados ​​de los SUV que consisten en los lípidos correspondientes. (B) Una vez formados, estos SLBS pueden ser fácilmente decoradas con proteínas solubles extendidas, ya sea con un solo C- o etiqueta N-terminal que contiene doce histidinas (12H, por ejemplo la molécula co-estimuladoras B7-1 y la molécula de adhesión ICAM-1 dímeros) o proteínas ampliar con dos etiquetas que contiene seis histidinas cada uno (2x6H, por ejemplo, un dímero αβMHC clase II). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.

Figura 2. Visión general de las trayectorias de excitación y de emisión. Haz láseres de iones gas (por ejemplo Ar ⁺ o Kr ⁺⁾ puede ser operado para cerrar rápido con el uso de mo óptico acústico dulators. Láseres diodos son hoy en día disponibles en muchas longitudes de onda y representan una excelente alternativa, ya que pueden ser moduladas por vía electrónica en el microsegundo-rabia. Tenga en cuenta que los rayos láser se pueden ajustar fácilmente con dos (dicroicas) espejos y dividir y combinar con el uso de divisores de haz simples para dar lugar a dos o más trayectorias de rayos. En este ejemplo un haz de formación de imágenes TIRF (a supervisar los eventos) y un haz de blanqueo (a uno o fluoróforos de blanqueo foto-activar las moléculas enjaulado en una manera definida por la abertura) se utilizan. Ambos caminos de excitación pueden ser operados independientemente uno de otro mediante el uso de obturadores adicionales. El periscopio permite la traducción de los rayos láser enfocados en el plano focal posterior del objetivo para generar iluminación TIRF de la muestra. La imagen fluorescente se puede dividir espectralmente con el uso de un divisor de haz de emisión antes de la adquisición con el uso de una cámara ultra-sensibles (por ejemplo EM-CCD o una cámara CMOS científica)..com / files / ftp_upload / 53158 / 53158fig2large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3. Ajuste de iluminación TIRF traduciendo el haz enfocado dentro del plano focal posterior del objetivo. Como se muestra en el punto focal del haz de láser se desplaza dentro del plano focal posterior del objetivo desde el centro hacia la periferia a través de la translocación de la viga (usando una disposición de espejos periscopio). Como resultado, un haz paralelo sale del objetivo en una iluminación inclinada hasta que se alcanza un ángulo crítico en el cual ocurre la reflexión interna total. El campo evanescente se genera en la interfase vidrio-media, donde se produce la reflexión total. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta fi gura.

Figura 4. sistemas ópticos sencillos para enfocar el haz láser en el plano focal posterior del objetivo. Cualquiera de tres o dos lentes son necesarios para ensanchar el haz de láser y para enfocar en el plano focal posterior del objetivo TIRF. Dos sistemas de lentes contienen menos errores de lente asociado que los sistemas de tres lentes y podrían ser más adecuados para generar el haz de formación de imágenes TIRF. Tres lentes podrían ser preferible cuando el objetivo de la ampliación del haz definido y un punto de iluminación con bordes afilados, como sería necesario para los estudios que emplean la foto-activación o -bleaching. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 5. anotado fotografía de la trayectoria del haz en la parte posterior del microscopio de fluorescencia. Como ya se indica en la Figura 2 una caña de una implementar fácilmente dos haces de excitación, uno en TIRF (indicado en verde) la otra en modo no TIRF (indicado en rojo). Estos se convierten en superpuesta con el uso de un divisor de haz de 50:50 (BS). Las lentes convexas (L1 y L2) están situadas en los respectivos haces de ellos para centrarse en el plano focal posterior del objetivo (no mostrados). Un periscopio que consiste en dos espejos (M1 y M2) guía ambos haces a través del puerto de entrada en el microscopio. El primer espejo (M1) puede ser movido con el uso de una etapa de traducción (TS) (girando un tornillo micrométrico como se indica) para mover una de las vigas en su posición TIRF. Una vez TIRF se ha establecido, el segundo haz (utilizado para la foto-blanqueo o-activación, aquí se indica en rojo) se puede ajustar independientemente de la viga TIRF que salir del objetivo en la no-TIRFde modo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6. Medir el poder dentro de la zona central del punto de iluminación. Como se indica eligió regiones apropiadas de interés, que reflejan el fondo, toda la zona iluminada (IA) y la zona central (CA), donde más tarde se registraron eventos. Restar los valores de fondo de los registrados para IA y CA e integrar las intensidades multiplicando intensidades medias corregidas con el número de píxeles presentes dentro de cada área (= intensidades integradas). Divida la intensidad integrada de CA por el de IA para llegar a la proporción de la potencia del haz de iluminación de la CA (en este ejemplo: 23%). Determine la potencia de la luz que ilumina el CA multiplicando la potencia del haz global (en este caso: 5 mW) con la proporción iluminando el CA (aquí: 0,23). Para determinar el tamaño de la zona central multiplicar el área (aquí: 7.089 pixel) con un factor de píxel a la zona de conversión del tamaño (aquí: 1 / 41,5 m ^{2 -1} pixel). Para llegar a la densidad de potencia media de la luz de excitación que ilumina la CA, divida el poder (en este caso: 1,15 mW) por el tamaño de la entidad emisora. (Aquí: 170,8 m ²⁾ Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7. La cuantificación de las señales de una sola molécula. (A) Evolución temporal de fluoróforos individuales en una SLB. Una región de tamaño 7 x 7 píxel de interés (ROI, amarillo) se coloca alrededor de la señal para la cuantificación. Antecedentes se determina a partir del píxel vecino un 7 x 7roi (verde). (B) cuantificado intensidades promedio de píxeles se enumeran. Para determinar la señal de una sola molécula, los valores de fondo (ROI verde) se restan de los valores de señal (ROI amarillo) y se multiplicaron por 49. (C) intensidades de moléculas individuales de un fluoróforo se representan gráficamente contra el tiempo. Tenga en cuenta, que el punto de tiempo de 90 ms se omite como el fluoróforo está en el proceso de blanqueo. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 8. La recuperación de fluorescencia Después de Photobleaching (FRAP) análisis para determinar la integridad de la SLB. (A) FRAP se realizó en una bicapa llevar a CEA / MCC-Alexa Fluor 647. Cada imagen de la décimo experimento se muestra. (B) la cuantificación FRAP del experimento se muestra en (A). Los valores indican las intensidades promedio (i) dentro de la ROI amarilla se muestra en (A) dividida por la intensidad inicial (I) _o antes del blanqueo. Puntos de datos rojas se muestran en (A), la línea verde denota 0,9 recuperación de intensidades originales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Microscopía sola molécula ofrece la oportunidad única de estudiar el comportamiento de las proteínas dentro de su entorno celular nativo. La imagen molecular se convierte, por tanto, cada vez más atractivo a una amplia comunidad científica, sin embargo, muchos científicos de la vida todavía se esconden de la inversión inicial en tecnología y experiencia. El principal beneficio que surge de montaje de la propia sistema de imágenes es que se puede ajustar fácilmente a las necesidades específicas de cualquier persona.

Como se sugiere en este documento una TIRF no haz de excitación se puede implementar fácilmente, además de una trayectoria de la luz TIRF existente, si se desea la foto-blanqueamiento rápido y definido (o-activación) de fluoróforos y ligandos, por ejemplo, cuando se realiza FRAP o ligando experimentos uncaging ¹⁴ . La introducción de un divisor de haz de emisión permite la grabación simultánea de al menos dos y en algunos casos hasta cuatro canales fluorescentes. La lista de extensiones es, en esencia, sólo limitado porla propia imaginación.

Por ejemplo, la implementación de una rueda de filtros de emisión motorizado en la vía de emisión permite el cambio rápido entre hasta diez canales fluorescentes diferentes. Cuando se combinan dos motorizados ruedas de filtros de emisión (cada una equipada con ranuras 10 de filtro) en la serie, hasta 18 canales fluorescentes puede ser leída. Formación de imágenes basada en TIRF se puede complementar con mediciones de la movilización del calcio y la interferencia Reflexión Microscopy (IRM) después de la integración de un camino de excitación de la lámpara de Xenón o Mercurio. IRM es el método de elección para visualizar el grado en el cual las células se unen a la superficie de cristal o un SLB y por lo tanto pueden proporcionar información crítica al interpretar los datos de imagen basados ​​en TIRF. El establecimiento de un haz de excitación se abrieron con el uso de un sencillo espejo dicroico y un láser de 405 nm adicional de la realización de la microscopía permite la localización de fotoactivación (PALM) o estocástico microscopía óptica de reconstrucción (STORM), es decir, dos superresolutmetodologías de iones con una precisión de posición por debajo del límite de difracción de la luz visible ^15,16.

Sin embargo, el éxito experimental no sólo es una cuestión de hardware adecuado. Para sacar el máximo provecho de las imágenes basadas en TIRF de ruido reducido, las células deben hacer contacto a una superficie de una manera que no impone restricciones sobre la superficie de la célula o que interfiera con la fisiología de la membrana plasmática. SLBS funcionalizado con proteínas adecuadas para la adhesión celular están excediendo muy adecuado para este propósito porque todos los ligandos incrustados-SLB son lateralmente móvil y ajustar su posición lateral dentro de la bicapa en respuesta al receptor de la dinámica de unión y la segregación.

Para fabricar SLBS de una manera reproducible, lo mejor es comenzar con los SUV de gran pureza. Como se describe aquí, es por lo tanto crítico para eliminar vesículas multilamelares, que también se producen durante la sonicación, en dos etapas de ultracentrifugación como éstos interfere con la formación de SLBS contiguas que ofrecen alta fluidez. SLBS de forma de alta calidad sólo en superficies de vidrio limpio. Una vez portaobjetos de vidrio limpio se debe utilizar inmediatamente o almacenar en vacío. Es importante destacar que SLBS nunca deben ser expuestos al aire ya que esto daría lugar a su interrupción. Lavado SLB implica, como se muestra, tampón de enjuague con el uso de una pipeta serológica, ya que esto no es sólo un procedimiento de salvar pero también de ahorro de tiempo.

Durante la cosecha y purificación de proteínas SLB-residentes el uso de detergentes debe ser evitado. Esto es porque detergente reducirá significativamente la movilidad de proteínas incluso cuando están presentes en cantidades traza. Para evitar la necesidad de detergente todos juntos, se recomienda la expresión soluble de ligandos etiqueta equipado polihistidina secretada en células de mamíferos o insectos. Si se requiere el replegamiento de cuerpos de inclusión de E. coli, la precaución debe aplicarse para eliminar detergentes efectivamente de los cuerpos de inclusión antes de su desempleo y replegamiento.

Una importante ventaja de emplear SLBS resultados de su naturaleza modular y reconstituyente, que permite diseccionar específicamente el papel de una interacción receptor-ligando dado para la activación celular y la adhesión celular. En este sentido, es importante mencionar que DGS NTA-Ni debe estar presente en 10% dentro de la SLB con el fin de evitar que las proteínas que compiten por los sitios de unión NTA-NI. Cuando se emplea SLBS que albergan sólo el 1% o 2% DGS NTA-Ni, una reducción en la asociación de las especies proteicas un determinado marcada con polihistidina se puede notar, especialmente cuando se co-incubación de cantidades crecientes de una segunda especie de proteína-polihistidina etiquetado (inédito observación). Este fenómeno no se observa cuando se trabaja con SLBS ofrecen el 10% DGS NTA-Ni.

Aunque nunca hemos observado la unión no específica de cualquier proteína-polihistidina etiquetado probado para SLBS contienen DGS NTA-Ni, esta posibilidad debe ser probado en la introducción de una proteína, por primera vez,Para ello se recomienda el uso de SLBS carentes de DGS NTA-Ni (la proteína no debe obligar). En segundo lugar, cuando se utiliza un SLB contiene DGS NTA-Ni, la proteína debe salir por completo después de lavar la SLB con PBS que contenía imidazol 300 mM.

Otra ventaja significativa de emplear SLBS es que las interacciones transitorias y eventos de señalización pueden ser monitoreados con resolución mejorada ^{17-19 de} espacio-temporal. Esto es al menos en parte debido a un proceso de unión tridimensional se reduce esencialmente a dos dimensiones de imagen, especialmente cuando se graba en el modo de TIRF ruido atenuado. El uso de SLBS es compatible con la detección de señales sola molécula, un requisito previo para la microscopía foto activadas localización (PALM) o estocástico microscopía óptica de reconstrucción (STORM), es decir, la microscopía de super-resolución con una resolución por debajo del límite de difracción ^15,16. Estas modalidades especiales de imagen permiten sola molécula Förster Resonancia Energía Traexperimentos nsfer diseñados para visualizar las interacciones individuales proteína-proteína en un entorno sináptica ^20. Este enfoque se explica en considerable detalle en una publicación JoVe denominado ²¹ "Medición de la unión usando un ensayo de FRET a base de microscopía de TCR-pMHC".

Al interpretar los experimentos basados ​​en SLB uno siempre debe tener en cuenta que no todas las propiedades de una membrana plasmática de una célula viva se caracterizan por SLBS, y que algunas de las cualidades que faltan pueden afectar la fisiología bajo investigación. Después de todo, las proteínas incrustadas-SLB están difundiendo libremente y no organizados en microdominios de membrana como la mayoría de sus homólogos celulares son ^5,6,22. Hojas de membrana de plasma inmovilizada derivadas de células adherentes, que conservan la arquitectura membrana plasmática de las células vivas en cierto grado, se han empleado con éxito para estudiar la captación de antígenos de membrana embebido por los linfocitos B ^23. Sin embargo, incluso talesmembranas no interactúan con un citoesqueleto muy dinámico y cuentan con ninguna flexibilidad, ya que se apoyan en una superficie de vidrio rígido. En vista de estas discrepancias existe una clara necesidad de SLBS ingeniería, que ofrecen medios para compartimentar las proteínas de una manera definida y que se apoyan en superficies de flexibilidad ajustable o por superficies que cambian su rigidez en respuesta a pulsos de luz aplicados localmente.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
#1.5 portaobjetos de vidrio	VWR	631-0853
Matraz de fondo redondo de 250 ml	VWR	201-1357
Cubos divisores de haz 50:50	Thorlabs	BS013
Modulador acústico-óptico C1205-2	Solo es necesario isomet		si se utilizan láseres CW, que no se pueden modular,
Alexa Fluor 488-NHS	Life technologies	A-20000
Alexa Fluor 555-NHS	Life technologies	A-20009
Alexa Fluor 647-NHS	Life technologies	A-20006
cinta de autoclave	VWR	489-1312	o cualquier otra cinta adhesiva termoestable
Avanti Mini-Extruder Avanti	Lipids	610000	alternativa al sonicador de baño sonicador
de baño QSONICA Q700	QSONICA	Q700
	Cairn	P280/210/MLS
Bü evaporador rotativo chi	VWR	531-0837
cámara	Andor	iXon Ultra 897	ver texto manuscrito para alternativas
de peróxido de hidrógeno concentrado	Roth	9683.1
ácido sulfúrico concentrado	Roth	X944.2
pegamento epoxi	Uhu	45705	Uhu plus sofortfest 2min
rueda de filtros	Sutter instrumentos	Lambda 10-2
LabTek cámaras VWR		734-2062
láser	Toptica-diferentes		variantes (longitudes de onda 375 - 785 nm) están disponibles
lente	Thorlabs, Newport-DGS
NTA-Ni (lípido)	Avanti Lipids	790404C	ya está en Choroform-solved se recomienda la versión entregada de la variante de sal nicekl
POPC (lípido)	Avanti Lipids	850457C	ya en Choroform-se recomienda
la versión entregadamicroscopio Zeiss Axiovert 200	Zeiss-espejos
	Thorlabs	BB1-E02
filtros ópticos	AHF, Chroma, Semrock-juegos		de filtros están disponibles para muchas combinaciones diferentes de colorantes
osciloscopio	BK Precision	2120C
salina tamponada con fosfato (PBS)	Life technologies	14190-136	desgasificación antes del uso
periscopio	Thorlabs	RS99/M
picodent twinsil 22	Picodent	13001000	alternativa al medidor de potencia de pegamento epoxi
Lasermate-Q	Coherent	:	cualquier medidor de potencia sensible en el rango espectral utilizado servirá
generador de impulsos	Stanford Research Systems	SRS DG535
filtro espacial	Thorlabs	KT310/M
filtro de jeringa 0.2µ m	Millipore	GVWP04700
objetivo apocromático compatible con TIRF 100x, NA 1.46	Zeiss	440782-9800-000
tubos de triclorometano/cloroformo	Roth	3313.1
para policarbonato por ultracentrifugación 1,00 mm, 11 mm x 32 mm	Ultracentrífuga Thermo Fisher	45237
Sorvall	Rotor	Fisher RC M150GX
	Thermo Fisher	S120-AT2
Nanodrop 2000c	de		Thermo Fisher
	VWR	181-0248