Este manuscrito describe un modelo de roedor para estudiar el dolor neuropático del trigémino. Los métodos descritos incluyen procedimientos quirúrgicos para realizar una lesión crónica por constricción del nervio infraorbitario de la rata y las pruebas conductuales postquirúrgicas para medir los cambios en el comportamiento espontáneo y evocado que son indicativos de dolor persistente y alodinia.
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Artículo de método
Lesión crónica constricción del nervio infraorbitario de la Rata (Ion-CCI) para el Estudio del trigémino Dolor Neuropático
En este artículo
Resumen
Resumen
Los modelos animales son herramientas importantes para el estudio de la fisiopatología y farmacología del dolor neuropático. Este manuscrito describe los procedimientos quirúrgicos y de comportamiento para estudiar el dolor neuropático trigeminal en ratas. Para satisfacer la especificidad del trigémino síndromes de dolor neuropático, el nervio infraorbital (ION) se somete a una lesión de constricción crónica (CCI) sin apretar por ligación del nervio. Un enfoque intra-orbital se presenta aquí para exponer y ligar el ION en la cavidad orbital. Después de la ligadura de iones, las ratas presentan cambios en el comportamiento espontáneo y en respuesta a la estimulación von Frey pelo que son indicativos de dolor persistente y la alodinia mecánica. Dos fases se pueden definir en el desarrollo de los cambios de comportamiento. Durante la primera semana después de Ion-CCI (fase 1), las ratas muestran un aumento de la actividad y asimétrica aseo cara, es decir, con lavado de cara trazos dirigida principalmente al territorio de iones nervio lesionado. Se hace una distinción entre la cara grooming comportamiento que es parte de un comportamiento corporal aseo más general, que sigue siendo en gran parte no afectada por Ion-CCI, y la cara de aseo que ni está precedido ni seguido por el aseo corporal, que se incrementó significativamente después de Ion-CCI. Durante este período, se reduce la capacidad de respuesta a la estimulación mecánica del territorio de iones. Esta respuesta menor es reemplazado abruptamente por una hiperreactividad extrema cual intensidades de estímulo aún muy débiles provocan el comportamiento nocifensive (fase 2). Las similitudes fenomenológicas entre estas alteraciones del comportamiento y informado de signos de dolor facial (es decir, las respuestas a la estimulación nociva de la cara) sugieren la presencia de disestesia / parestesia y la alodinia mecánica en el territorio de iones se ligó.
Introducción
El daño a los nervios somatosensoriales más a menudo conduce a la pérdida de la sensibilidad. No se entiende muy bien por qué y cómo, en algunos casos, el daño del nervio periférico conduce a dolor crónico. Como resultado, las neuropatías dolorosas siguen siendo una condición difícil de tratar 1 y dar lugar a reducciones sustanciales de la calidad de vida de los pacientes 2-3. Los modelos animales son una herramienta importante para examinar la eficacia de los fármacos existentes y de nuevo desarrollo e identificar los mecanismos fisiopatológicos involucrados en el desarrollo y mantenimiento del dolor neuropático. Entre los principales retos para la investigación del dolor de traslación es identificar y medir el dolor espontáneo en los animales (es decir, fisiológicos, manifestaciones conductuales u otros que indican la presencia de dolor en los animales que no están siendo desafiados con sondaje estímulos que están agudamente superponen con la condición basal del sujeto ). El objetivo general de este procedimiento es inducir quirúrgicamente unlesión del nervio infraorbital en una rata que conduce al desarrollo de tanto espontánea y evocada comportamiento nocifensive que pueden utilizarse para estudiar los mecanismos implicados en el dolor neuropático trigeminal y su tratamiento.
Dirigida, cara aislado aseo personal es una medida única de dolor neuropático espontáneo en ratas. Después de una lesión crónica constricción (CCI) del nervio infraorbitario (ION), las ratas muestran cambios en el comportamiento espontáneo y en respuesta a la estimulación táctil que son indicativos de dolor persistente y la alodinia mecánica 4. Después de Ion-CCI, las ratas muestran un aumento de la actividad y asimétrica aseo cara, es decir, con lavado de cara trazos dirigida principalmente al territorio de iones nervio lesionado. En contraste con la estimulación nociva de la cara (por ejemplo, la inyección de formalina) 5, no dolorosa alteraciones sensoriales (es decir, recorte vibrisas unilateral, bloqueo del nervio infraorbital anestésico, la aplicación de aceite mineral en vibriSSAE) no o sólo muy brevemente (es decir, los primeros minutos después del inicio) inducen un cambio significativo en la cara comportamiento de acicalamiento 6. Se concluyó que este acicalamiento anormal después de Ion-CCI es una manifestación conductual de sensaciones espontáneas, fuertemente aversivas en el territorio del nervio lesionado. Este comportamiento en ratas Ion-CCI tiene gran parecido con dolor espontáneo observado en los pacientes. Otros estudios han identificado una diferencia importante entre la cara comportamiento arreglo personal que forma parte de un comportamiento de aseo corporal más general (es decir, "cara de aseo durante cuerpo grooming"), que sigue siendo en gran parte no afectada por Ion-CCI, y la cara nocifensive aseo que no es ni precedido ni seguido de aseo corporal (es decir, "aislado cara grooming"), que se incrementó significativamente después de Ion-CCI 7-9. Farmacológicamente, cara aseo durante el aseo corporal constituye una medida de control excelente para efectos no específicos de drogas ( por ejemplo, sedación) que pueden afectar la función motora. Los movimientos de las extremidades anteriores durante los dos tipos de cara aseo son exactamente los mismos.
Después de Ion-CCI, las ratas también muestran cambios en respuesta a la estimulación táctil que son indicativos de la alodinia mecánica 4, 10. Durante la primera semana (s) después de Ion-CCI, las ratas ya no responden al tacto leve o moderada (es decir, von Frey ) estímulos. Esta respuesta menor es entonces bruscamente reemplazada por una hiperreactividad extrema por lo que incluso las intensidades de estímulo muy débiles provocan el comportamiento nocifensive. El inicio de la hiperreactividad puede variar entre las ratas, pero la mayoría de las ratas se han convertido en hyperresponsive después de tres a cuatro semanas después de la operación.
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Protocolo
Declaración de Ética: Los animales son tratados y atendidos de acuerdo a las directrices del Comité para la Investigación y Cuestiones Éticas de la IASP 11. El protocolo ha sido aprobado por el Comité Ético institucional.
1. Los sujetos
- Usar ratas macho Sprague-Dawley (250-300 g a la llegada).
- Casa ratas en jaulas de fondo sólido en una habitación de colonias con una humedad del 40-60% y una temperatura ambiente de 21 ± 1 ° C.
- Hacer agua y comida disponible en libitum.
- Mantenga ratas bajo un ciclo inverso 12:12 h oscuridad / luz (luces a las 20 h).
2. Cirugía
- Por rata, preparar dos piezas de ligadura intestino crómico (5-0) de aproximadamente 6 cm de largo y colocarlos en una solución salina estéril para evitar la desecación y convertirse rígido y quebradizo.
- Anestesiar al animal con pentobarbital (60 mg / kg, ip) y tratar con atropina (0,1 mg / kg, ip). Vigilar el nivel de anestesia mediante la extensión de una pierna y Pinching la banda de piel entre los dedos de los pies con una uña para asegurar se aplica la presión adecuada. Asegúrese de que el animal no flexione su extremidad. Si es necesario, administrar pentobarbital adicional.
- Afeitar la cabeza de la rata para que una incisión en la línea media del cuero cabelludo puede ser de aproximadamente 25 mm con distancias iguales anterior y posterior al centro de los ojos.
- Fijar la cabeza de la rata en un marco estereotáxico o de otra manera fijar la cabeza de la rata. Coloque la rata en un cojín de calefacción para mantener la temperatura corporal.
- Aplicar pomada oftálmica en ambos ojos para evitar daños por secado.
- Frote el área de la cabeza rapada con alcohol, luego betadine.
- Hacer una incisión en la línea media del cuero cabelludo, dejando al descubierto el cráneo y el hueso nasal.
- Utilice un microscopio quirúrgico para realizar los pasos 02.09 a 02.16.
- Diseccionar el borde de la órbita libre, formado por el maxilar, frontal, lagrimal y los huesos cigomáticos, utilizando un hisopo con punta de algodón y un par de pinzas Dumont. Utilice el hisopo para loak con sangre de un posible sangrado.
- Para dar acceso a los iones, desviar suavemente el contenido orbitales con un hisopo de algodón precisión, teniendo cuidado de no estirar demasiado el nervio etmoidal anterior que cruza superior a la de iones. Diseccionar el ion libre del tejido conectivo circundante, utilizando un hisopo con punta de algodón precisión y un par de pinzas Dumont utilizando un movimiento propague. Utilice el hisopo para absorber la sangre de una posible hemorragia.
- Para realizar una ligadura, empujar un extremo de una sola pieza de intestino crómico a la baja a lo largo del hueso frontal, medial a la de iones y avanzar unos pocos milímetros paralelo e inferior a la de iones. La ligadura ahora se mantiene en su lugar entre los iones y el hueso frontal.
- Deslice la punta de unos 45 grados en ángulo pinzas Dumont en el marco del ION para colocarlo en las proximidades de la ligadura. Retraer con suavidad el ion lateralmente para revelar la ligadura y la punta de la pinza. Agarre la ligadura con las pinzas y retirar la pinza lateralmente por debajo de la de iones.
- Tire de la ligadura de la cavidad orbital hasta que ambos extremos de la ligadura son más o menos equidistante de ion.
- Haga un "nudo corredizo" de los dos extremos de la ligadura para permitir un control perfecto sobre el grado de constricción y deslice el nudo contra el ion. Deslizar el nudo más para constreñir el ion de modo que el diámetro del nervio se reduce en una cantidad apenas perceptible. Hacer un nudo normal, en la parte superior del nudo corredizo de modo que la cantidad de constricción permanece constante (es decir, para evitar que el nudo se deslice hendidura).
- Corte las ligaduras de dejar aproximadamente 2 mm de los extremos libres del nudo.
- Repita el mismo procedimiento (pasos 2,11-2,15) para hacer una segunda ligadura de 2 mm de distancia de la primera.
- Para cirugía simulada, realice los pasos 02.02 a 02.10.
- Cierre de la incisión del cuero cabelludo utilizando suturas de poliéster (4-0) y permita que la rata se recupere en una almohadilla caliente. No dejar al animal sin vigilancia hasta que se haya recuperado contras suficientesciousness mantener decúbito esternal y no devolver el animal a la compañía de otros animales hasta que esté totalmente recuperado.
- Para evitar efectos analgésicos preventivos contra el desarrollo del dolor neuropático, no administrar la analgesia para el dolor post-quirúrgico.
3. Procedimiento de la Prueba de Comportamiento
- Permitir que las ratas se aclimaten durante al menos 8 días a las condiciones de la vivienda antes de la prueba pre-operatorio.
- Habituarse ratas en el procedimiento de la prueba al menos una vez al día durante tres días antes de la prueba pre-operatorio.
- Pruebas de Conducta en una habitación oscura con luz proporcionada por una W bombilla roja 60 suspendió 1 m por encima del centro de la zona de pruebas iluminando el centro, pero dejando la circunferencia tenue y el resto de la habitación oscura.
- Asegúrese de que hay suficiente ruido de fondo para disminuir la interferencia de estimulación auditiva repentina. Si es necesario, proporcionar ruido blanco.
- Observación de la cara comportamiento aseo
- TRANSPORTE una sola rata de la colonia a la sala de ensayo en una jaula de plástico cubierta sin ropa de cama. Nota: Idealmente, esto debería ser un viaje corto con estímulos externos mínimos.
- Coloque la rata en una jaula de plástico transparente cubierta sin ropa de cama (LxAnxAl: 24 cm x 14 cm x 17 cm) con un espejo de nuevo frente a una cámara de vídeo.
- Realice una grabación de 10 min de la conducta del animal. Durante la grabación, asegúrese de que el experimentador no está presente en la sala de ensayo.
- Limpie la jaula de observación antes de colocar el siguiente animal.
- Asegúrese de que el comportamiento registrado es analizada por un experimentador que es ciego a la condición experimental de la rata.
- Haga un registro de cada episodio cara aseo durante la grabación de 10 minutos. Nota: el aseo de la cara se define como patrones de movimiento en el que las patas delanteras se ponen en contacto con las áreas faciales.
- Hacer una distinción entre dos tipos de comportamiento ante el aseo. Si una secuencia es ni precedida ni seguida porcuerpo de aseo (es decir, la preparación de un área del cuerpo que no sea la cara), categorizar el episodio como aislado cara aseo. Si el aseo corporal se realiza inmediatamente antes o después de la cara aseo, clasificar el episodio como la cara de aseo durante el aseo corporal.
- Determinar el número de episodios de la cara de aseo.
- Clasificar un período de tiempo entre las acciones de cara aseo que no exceda de 4 segundos como un espacio intra-episodio (es decir, una pausa entre las acciones de cara aseo dentro de un solo episodio).
- Clasificar un período de tiempo entre la cara acciones de aseo que supera 4 seg como un espacio interinstitucional episodio (es decir, una interrupción total de las acciones de cara aseo entre dos episodios).
- La estimulación mecánica de pruebas
- Ratas de transporte en grupos de hasta 6 animales de la colonia a la sala de ensayo en una jaula cubierta con ropa de cama. Asegúrese de que este es un viaje corto con estímulos externos mínimos.
- Coloca elratas individualmente en jaulas de plástico transparentes con ropa de cama (LxAnxAl: 24 cm x 14 cm x 17 cm) con una tapa con bisagras de manera que se pueden abrir y cerrar fácilmente.
- Utilice una serie graduada de cinco pelos de von Frey. Nota: La fuerza requerida para doblar los pelos es 0,015 g, 0,127 g, 0,217 g, 0,745 g y 2,150 g.
- Habituarse a las ratas a la jaula de observación y movimientos que alcanzan para 10 min. Cada 30 segundos, abra la tapa y toque suavemente la pared de la jaula con una varilla de plástico.
- Cuando el animal se encuentra en un no / estado locomoción sniffing (es decir, con cuatro patas colocadas en el suelo, sin moverse ni la congelación, pero exhibiendo olfateando comportamiento), aplicar la primera pelo von Frey en el territorio de iones cerca del centro de la almohadilla vibrissal , en la piel que rodea el hairy vibrisas mystacial.
- Puntuación de la respuesta del animal a la estimulación de pertenecer a una de las siguientes categorías de respuesta 4.
- Clasificar una completa falta de respuestamarcó el 0.
- Clasificar una detección estímulo (es decir, la rata se vuelve la cabeza hacia el objeto estimulante y el objeto de estímulo se explora a continuación) como marcador 1.
- Categorizar una reacción de abstinencia (es decir., La rata gira la cabeza lentamente o tira de él hacia atrás rápidamente cuando se aplica la estimulación, a veces una sola cara limpie ipsilateral a la zona estimulada se produce) como puntuación de 2.
- Clasificar un / respuesta de ataque de escape (es decir., La rata evita el contacto adicional con el objeto de estímulo, ya sea de forma pasiva al mover su cuerpo lejos del objeto estimular a asumir una posición en cuclillas contra la pared de la jaula, o activamente atacando el objeto de estímulo, lo que hace morder y agarrar movimientos) como marcador 3.
- Clasificar cara asimétrica aseo (es decir, la rata muestra una serie ininterrumpida de al menos tres golpes cara lavado dirigidos hacia el área facial estimulado) como marcador 4.
- Dentro de cada animal, aplique Stimuli en un orden ascendente de intensidad. Después de una intensidad del estímulo se ha aplicado a un lado, que se aplican al otro lado antes de pasar a la siguiente intensidad del estímulo. Aleatorizar el orden en que se estimulan los lados ipsilateral y contralateral. Tenga en cuenta que el animal debe estar en un no / estado locomoción oler antes de cada estímulo.
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Resultados
Ratas Ion-CCI muestran un fuerte aumento postoperatorio en la cantidad de tiempo dedicado a la cara aislada aseo (Figura 1). Los picos de aumento al final de la primera semana después de la operación y luego disminuye durante las siguientes semanas. La mayoría de los estudios recientes han encontrado cara aseo que incrementarse significativamente durante un máximo de tres semanas. Cara comportamiento de aseo en ratas con operación simulada es más o menos afectada.
Ratas Ion-...
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Discusión
El aspecto más interesante del modelo de Ion-CCI es que proporciona una medida única de (neuropático) dolor espontáneo, no provocado. La mayoría de los estudios en animales de dolor neuropático, utilizando modelos de los nervios espinales, abordan exclusivamente comportamientos nocifensive (ej., Vocalización y respuestas de abstinencia), lo que refleja la hipersensibilidad a estímulos mecánicos o térmicos 12. Sin embargo, la queja clínica principal en los pacientes es el dolor continuo, no hiperalges...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores reconocen el trabajo realizado por el primer autor del modelo IoN-CCI, Bart Vos†.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Tripa de gato crómica | Dynek | CG504 | |
| Nembutal (pentobarbital) | Farmacia | ||
| Atropina | Cortafuegos de farmacia | ||
| para pequeños animales - Favorita II | Aesculap | GT104 | |
| Instrumento estereotáxico | Stoelting | 51600 | |
| Pomada oftálmica (liposica) | Farmacia | ||
| Sistema de monitor homeotérmico | Harvard Apparatus | PY8 50-7221-F | |
| Aplicador de algodón | Farmacia | ||
| Hisopo de algodón de precisión | Qosina | 10225 | |
| Microscopio de operación | Kaps | SOM 62 | |
| Pinzas Dumont #5 | Pinzas | 11251-10 | |
| Pinzas Dumont - Puntas micro-desafiladas (#5/45) | Tijeras Fine Science Tools | 11253-25 | |
| - puntas | romasFine Science Tools | 14574-09 | |
| Suturas de poliéster - Mersilene (4-0) | Ethicon | R871H Cámara | |
| de vídeo digital | Sony | HDR-CX330E | |
| Semmes-Weinstein Von Frey Kit de estesiómetro | Stoelting | 58011 |
Referencias
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Reimpresiones y permisos
