Artículo de método
Este protocolo describe un enfoque para interrogar las regiones VDJ de cadena pesada de inmunoglobulinas recombinadas de los linfomas mediante secuenciación profunda y recuperar el reordenamiento de VDJ y el estado de hipermutación somática para delinear la arquitectura clonal del tumor individual. La comparación de la arquitectura clonal entre el diagnóstico pareado y las muestras de recaída revela modos de evolución clonal de recaída y linfoma.
Clonalidad tumor comprensión es fundamental para la comprensión de los mecanismos implicados en la tumorigénesis y la progresión de la enfermedad. Además, la comprensión de los cambios en la composición clonal que se producen dentro de un tumor en respuesta a ciertos micro-entorno o tratamientos puede conducir al diseño de los enfoques más sofisticados y eficaces para erradicar las células tumorales. Sin embargo, el seguimiento de tumores clonales subpoblaciones ha sido difícil debido a la falta de marcadores distinguibles. Para abordar este problema, un protocolo VDJ-ss fue creado para rastrear los patrones de evolución clonal de linfoma de células grandes B (DLBCL) recaída difusa mediante la explotación de recombinación VDJ e hipermutación somática (SHM), dos características únicas de los linfomas de células B.
En este protocolo, la secuenciación de próxima generación (NGS) bibliotecas con potencial de indexación se construyeron a partir de la cadena pesada de inmunoglobulina amplificado reordenado (CIB) región VDJ de pares de diagnóstico primario y la recaída samp DLBCLles. En promedio se obtuvieron más de medio millón de secuencias VDJ por muestra después de la secuenciación, que contienen tanto VDJ reordenamiento e información SHM. Además, se desarrollaron tuberías bioinformática personalizadas para utilizar plenamente la información de secuencia para la caracterización de CIB-VDJ repertorio dentro de estas muestras. Además, la tubería permite la reconstrucción y la comparación de la arquitectura clonal de los tumores individuales, lo que permite el examen de la heterogeneidad clonal dentro de los tumores de diagnóstico y deducción de los patrones de evolución clonal entre diagnóstico y pares de recaída del tumor. Al aplicar este análisis a varios pares diagnóstico de recaída, descubrimos evidencia clave de que múltiples patrones evolutivos tumorales distintivo podrían llevar a DLBCL recaída. Además, este enfoque se puede ampliar a otros aspectos clínicos, como la identificación de la enfermedad residual mínima, seguimiento de los avances recaída y la respuesta al tratamiento y la investigación de repertorio inmunológicoes en contextos no-Hodgkin.
El cáncer es una enfermedad clonal. Desde hace treinta años, cuando Peter C. Nowell propuso el modelo de evolución clonal del cáncer 1, muchos estudios han tratado de diseccionar poblaciones clonales dentro de las muestras tumorales y reconstruir los patrones de expansión y evolución clonal que subyacen en el proceso de tumorigénesis 2. Recientemente, la secuenciación del genoma ha permitido a los investigadores a tener una mirada profunda a la heterogeneidad clonal y evolución 3,4. Sin embargo, debido a la falta de marcadores tratables en muchos tipos de células, es difícil para inferir la arquitectura clonal precisa y la ruta evolut....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
1. VDJ amplificación
1.1) La extracción de ADN a partir de muestras de tumores
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
El procedimiento general de secuenciación VDJ (VDJ-SEC), incluyendo la extracción de ADN, recombina VDJ región de amplificación y purificación, la construcción de bibliotecas de secuenciación, se lee en el procesamiento y el análisis filogenético, está representado en la Figura 1. Rutinariamente de 5-200 g de ADN puede ser recuperada a partir de secciones de tejido sólido congelado o 0,5 a 20 g de ADN a partir de secciones de tejidos embebidos en parafina fijado en formol. Dependiendo d.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Debido al número casi ilimitado de iteraciones de información de la secuencia codificada por VDJ reordenamiento y SHM en el locus IGH de células B humanas, el examen de todo el repertorio IGH por alto rendimiento en alta secuenciación demostró ser una forma eficaz y completa para delinear clonal y las poblaciones de células B sub-clónicas. Además, esta estrategia se puede utilizar para estudiar la ruta de evolución clonal de desarrollo de células B tumor, remisión y recaída mediante la comparación de las arquitecturas c.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Los autores no tienen conflictos de intereses que divulgar.
Los autores desean agradecer a la Dra. Rita Shaknovich y a los miembros de Elemento lab, Melnick lab y Tam lab por sus reflexivas discusiones. También nos gustaría agradecer al Centro Central de Recursos Genómicos de Weill Cornell Medical College por realizar la secuenciación de VDJ. YJ contó con el apoyo de ASH Scholar Award. WT y OE cuentan con el apoyo de la subvención piloto del Weill Cornell Cancer Center. OE cuenta con el apoyo del premio NSF CAREER, el Starr Cancer Consortium y el Hirschl Trust. También nos gustaría agradecer a Katherine Benesch, JD, MPH por su generoso apoyo a este proyecto.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Etanol | VWR | 89125-170 | 200 proof, para biología molecular |
| tampón TE | Life Technologies | 12090-015 | 10 mM Tris· Cl, pH 8,0; 10 mM EDTA |
| Xilenos | VWR | EM-XX0055-6 | 500 ml |
| Proteinasa K | Life Technonogies | 25530-015 | 100 mg |
| Trifosfato de desoxinucleótido (dNTP) Mezcla de soluciones | Promega | U1515 | 10 mM cada nucleótido |
| 10x Tampón de PCR | Roche | 11699105001 | sin MgCl2 |
| AmpliTaq ADN polimerasa con tampón de oro y MgCl2 | Life Technonogies | 4311806 | 50 µ l a 5 U/µ l |
| Escalera de tamaño de control de muestras | Invivoscribe Technologies | 2-096-0020 | 33 reacciones |
| IGH Somatic Hypermutation Assay v2.0 - Detección de gel | Invivoscribe Technologies | 5-101-0030 | 33 reacciones, Mix 2 para la detección de IGVHFR1 |
| Ensayo de clonalidad del gen IGH - Detección en gel | Invivoscribe Technologies | 1-101-0020 | 33 reacciones, Tubo B para detección de IGVHFR2 |
| GoTaq Flexi ADN Polimerasa | Promega | M8291 | 20 µ l a 5 U/µ l |
| 10X Tampón Tris-Borato-EDTA (TBE) | Corning (cellgro) | 46-011-CM | 6x1 L |
| 50x TAMPÓN TAE | VWR | 101414-298 | 1 L |
| Solución de bromuro de etidio | Sigma-Aldrich | E1510 | 10 mg/ml |
| 25 pb DNA Ladder | Life Technologies | 10597011 | 1 µ g/µ l |
| 100 bp DNA Ladder | Life Technologies | 15628-019 | 1 µ g/µ l |
| UltraPure Agarose | Life Technologies | 16500-500 | 500 g |
| 40% Solución de Acrilamida/Bis | Bio-Rad Laboratories | 1610144 | 500 ml |
| QIAquick Kit de extracción de gel | Qiagen | 28704 | 50 columnas |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | |
| Qubit dsDNA Kit de ensayo de alta sensibilidad | Life Technologies | Q32854 | |
| Kit de ADN de alta sensibilidad | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| 2100 Bioanalizador | Agilent Technologies | ||
| PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 | |
| MiSeq | Illumina | ||
| Qubit 2.0 Fluorímetro | Life Technologies | Q32872 | |
| Tampón de resuspensión (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| Mezcla de reparación final (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| A-tailing mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| Mezcla de ligadura (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| Índice adaptador de ADN (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| Stop ligation buffer (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)Illumina | FC-121-2001 | ||
| PCR cebador cocktail (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| PCR master mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| Soporte magnético | Life Technologies | 4457858 | |
| Sistema de imagen en gel | Bio-Rad Laboratories | 170-8370 |
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este artículo de JoVE
Solicitar permiso