Este protocolo describe el uso de preparaciones de tejido intestinal extirpado o "sacos intestinales" como modelo ex vivo de la función de barrera intestinal. Este modelo se puede utilizar para evaluar la integridad tanto de la barrera epitelial como de la capa de gel mucoso en sitios intestinales específicos en modelos animales de enfermedad digestiva.
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Artículo de método
Ex Vivo intestinal Sacs para evaluar la permeabilidad de la mucosa en modelos de enfermedad gastrointestinal
En este artículo
Resumen
Resumen
La barrera epitelial es la primera defensa innata del tracto gastrointestinal y regula selectivamente el transporte desde el lumen a los compartimentos de tejido subyacente, lo que restringe el transporte de moléculas más pequeñas a través del epitelio y casi prohíbe completamente el transporte macromolecular epitelial. Esta selectividad se determina por la capa de gel mucoso, lo que limita el transporte de moléculas lipófilas y tanto los receptores apicales y apretado complejos de proteínas de unión del epitelio. Modelos in vitro de cultivo de células del epitelio son convenientes, pero como modelo, que carecen de la complejidad de las interacciones entre la microbiota, mucosa-gel, el epitelio y el sistema inmunológico. Por otra parte, la evaluación in vivo de la absorción intestinal o la permeabilidad se puede realizar, pero estos ensayos miden la absorción gastrointestinal en general, sin ninguna indicación de especificidad de sitio. Ex vivo usando ensayos de paso de "sacos intestinales"; son un método rápido y sensible de la medición de ya sea la integridad intestinal en general o el transporte comparativo de una molécula específica, con la ventaja adicional de especificidad de sitio intestinal. Aquí se describe la preparación de sacos intestinales para estudios de permeabilidad y el cálculo de la aparente permeabilidad (app P) de una molécula a través de la barrera intestinal. Esta técnica se puede utilizar como un método de evaluación de la absorción del fármaco, o para el examen disfunción de la barrera epitelial regional en modelos animales de la enfermedad gastrointestinal.
Introducción
La barrera epitelial intestinal del tracto gastrointestinal es un área de superficie de la mucosa se estima en 400 m 2 en el adulto humano. En consecuencia, se expone constantemente a desafiar a partir de microbios, fármacos ingeridos, nutrientes y toxinas bacterianas. El anfitrión no sólo debe distinguir entre las bacterias comensales tolerables y patógenos potenciales, pero debe evitar que estas especies y sus moléculas secretadas de atravesar la barrera epitelial, mientras que al mismo tiempo que permite la absorción de nutrientes. Por lo tanto, el papel del epitelio intestinal es actuar como una barrera selectiva a los contenidos luminales 1. Esto se consigue, en parte, por el sistema de defensa innata epitelial en la mucosa, que actúa a través de un sistema biológico sensible que consiste en mecanismos constitutivos e inducibles 2.
La pérdida de la función de la barrera epitelial es una patología que es característica de un número de enfermedades gastrointestinales. In vivoexamen de la función de barrera epitelial puede ser evaluada a través de una sonda nasogástrica de una molécula del marcador, y su posterior análisis del suero 3. Sin embargo, esta técnica no ofrece ninguna indicación en cuanto al sitio de la disfunción de la barrera. In vitro y ex vivo evaluación de la resistencia transepitelial utilizando sistemas Transwell 3 y cámaras Ussing 4,5 respectivamente, se emplean comúnmente como marcadores indirectos de la función de la barrera epitelial, pero carecen de la fisiología de la enfermedad contribuyendo de modelos animales 6. En este protocolo se describe un modelo de preparación de tejido ex vivo que permite la evaluación directa y localizada de la integridad intestinal y que puede utilizarse para evaluar la función barrera de la mucosa en un número de niveles. Es importante destacar que esta técnica puede aplicarse a modelos animales de enfermedad, o puede ser manipulado para permitir farmacológicamente en interrogatorio profundidad de disfunción de la barrera de la mucosa.
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Protocolo
Todo el trabajo con animales en este protocolo se realiza con estricto apego a la Universidad de Newcastle Comité de Ética Animal procedimientos aprobados.
1. Preparación de los instrumentos, medios de cultivo y Platos
- Pre-caliente de medios 199 (TC199) o de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) medios de comunicación a 37 DO. Pre-oxigenar el medio por burbujeo con 95% de O2 / 5% de CO 2. Comprobar que el medio tiene un pH final de 7,3.
- Prepara sutura cortando dos secciones 5 cm para cada salida. Bucle de las suturas en un nudo sin cerrar.
2. La disección y preparación del Tracto Gastrointestinal
- Retirar el alimento sólido de 12 horas antes de la eutanasia. Si se desea, colocar los animales sobre los suplementos de gel de nutrientes durante este tiempo.
- La eutanasia a los ratones mediante una sobredosis de pentobarbital sódico ([200 mg / Kg], inyección intraperitoneal), seguido por dislocación cervical de acuerdo con la ética proto institucionalcols y rocían 70% de etanol en el abdomen y el tórax.
- Usando unas tijeras, hacer una incisión horizontal en el centro del abdomen y exponer el peritoneo.
- Proceder para separar y eliminar el tracto gastrointestinal por el corte de la parte superior del intestino desde el estómago en el esfínter pilórico y cortar el intestino grueso en el margen anal. Utilice unas pinzas para eliminar cuidadosamente el mesenterio. Coloque el tracto intestinal en pre-calentado, medio oxigenado.
- Identificar la sección del intestino que deben evaluarse para la permeabilidad (Figura 1) y se corta esta sección libre del resto del tracto intestinal.
- Con el fin de mantener la coherencia entre los animales, medir secciones de duodeno y el yeyuno en relación con el estómago, y medir secciones del colon y el íleon en relación con el ciego.
- Al seleccionar segmentos de tejido, tenga en cuenta la presencia de los tejidos linfoides asociados a mucosas, tales como placas de Peyer. Estos pueden ser identificados como pequeño guiñoEGLAS en el lado serosal de la luz.
- Usando una jeringa de 1 ml, lavar suavemente el contenido luminal del segmento intestinal en una placa Petri con PBS pre-calentado (37 ° C). Estos contenidos fecales pueden ser descartados o se almacenaron a -80 ° C para el análisis futuro si lo deseas.
3. Preparación de Intestinal Sacs
- Preparar una jeringa de 1 ml con un volumen de 300 l de compuesto de ensayo o molécula. Por integridad de la mucosa, una solución de 1 mg / ml de FITC-dextrano M.Wt. 4400 puede ser utilizado. Las sondas que van de 4,400-70,000 Da de tamaño se pueden usar para una mayor sensibilidad. encajar de forma segura un pequeño catéter vascular de los animales en la jeringa.
- Medida 5 cm de la apertura del segmento intestinal y atar el segmento de seguridad cierran con una sutura de lazo en este punto. Con cuidado, coloque un pre-atado de sutura de lazo alrededor de la abertura del intestino e inserta el catéter despuntada. Tirar de la soga cerrado, así como para asegurar el segmento intestinaly liberar el volumen de 300 l de la jeringa en el intestino, asegurando que se inyecta toda la solución.
- Retire con cuidado el catéter accionando al mismo tiempo el lazo de sutura para asegurar el cierre del saco intestinal. Cortar el saco intestinal suelto en el intestino y colocar en un tubo cónico de 50 ml lleno con 20 ml de medio oxigenado, precalentado a 37 a DO.
4. Medición de la Permeabilidad
- Colocar los tubos cónicos que contienen los sacos intestinales en un baño de agua de calefacción ajustada a 37 DO. A 0, 30, 60, 90 y 120 puntos de tiempo min, tomar una muestra de 100 l desde el tubo cónico y la transferencia a una placa de 96 pocillos, en sustitución del volumen con 100 l de medio fresco en cada caso.
- Después de que se haya tomado la muestra final, cortar sacos abiertos en el punto de sutura y abajo de la longitud del segmento, la exposición de la superficie de la mucosa.
- Medir la longitud y la anchura de cada segmento intestinal. Si desirojo, broche congelar los segmentos y almacenar a -80 ° C para la proteína o el análisis bioquímico, o, alternativamente, almacenar en solución de estabilización de ARN para análisis moleculares.
- Construir una curva estándar de diluciones de registro de moléculas marcadas con FITC van de 1 a 1 x 10 -6.
- medir las muestras y estándares para FITC en un lector de placas de fluorescencia, FITC excitación / emisión: 495 nm / 519 nm.
5. Cálculo de la permeabilidad aparente para cada individuo intestinal Sac
- Convertir unidades de tiempo de segundos.
- Para cada punto de tiempo, calcular la concentración acumulativa, Q
Q t = (C * t V r) + (Q t suma * V s), Donde:
Q t = concentración acumulativa en el tiempo t
C t = concentración en el tiempo t
V r = Volumen en el lado del receptor
Q t = suma Suma de todos los Q anterior t
= V svolumen muestreado - Parcela Q en función del tiempo (T) y calcular la pendiente: δQ / dt
- Se calcula la permeabilidad aparente (P app)
P = aplicación (δQ / dt) / (A * Co), donde:
A = área de tejido
C 0 = concentración inicial
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Resultados
Este protocolo puede ser usado para examinar los cambios regionales en función de la barrera intestinal en modelos animales de enfermedad gastrointestinal. Al medir el flujo de una sonda paracelular a través de la superficie de la mucosa a diferentes áreas del tracto gastrointestinal 7, la integridad de las uniones estrechas epiteliales se puede evaluar. Además, mediante la variación de la naturaleza de la sonda paracelular por tamaño (Figura 2) o hidrofobicid...
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Discusión
Aquí, hemos detallado el aislamiento y la preparación de los sacos intestinales para evaluar la función barrera de la mucosa ex vivo. preparaciones saco intestinal principalmente se han utilizado en la investigación farmacéutica, el examen de la absorción de los fármacos candidatos a través del intestino. Sin embargo, este ensayo es igualmente bien adecuada para el estudio de la enfermedad intestinal. la permeabilidad intestinal puede variar considerablemente según la región y la evaluación específica del sitio...
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por el Proyecto Nacional de Investigación Médica y de Salud Grant APP1021582 y una beca del Instituto de Investigación Médica Hunter patrocinada por Sparke Helmore/NBN Triathlon y el patrimonio del difunto Leslie Kenneth McFarlane.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Dekantel Sutura de seda no absorbible | Braintree Scientific | SUT-S 116 | |
| Media 199 (TC199) | Life Technologies | 11043-023 | Sin rojo de fenol, ya que interfiere con la fluorescencia |
| Medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM) | Life Technologies | 21063-045 | Sin rojo de fenol, ya que interfiere con la fluorescencia |
| N-acetilcisteína | Sigma Aldrich | Uso a 10 mM en medios | |
| Catéter vascular para animales pequeños: Physiocath | Data Sciences International | 277-1-002 | |
| FITC-Dextrano 4.400 MW | Sigma Aldrich | FD-4 | |
| FITC-Dextran 20.000 MW | Sigma Aldrich | FD-20 | |
| FITC-Dextran 70.000 MW | Sigma Aldrich | FD-70 |
Referencias
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