La transferencia de linfocitos bm12 a un receptor C57BL/6 es un modelo establecido de lupus eritematoso sistémico. Aquí describimos cómo iniciar la enfermedad utilizando este modelo y cómo caracterizar las células T foliculares auxiliares, las células B del centro germinal y las células plasmáticas mediante citometría de flujo.
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Artículo de método
El inducible Modelo BM12 del lupus eritematoso sistémico (LES) en ratones C57BL / 6 ratones
En este artículo
Resumen
Resumen
El lupus eritematoso sistémico (LES) es una enfermedad autoinmune con diversas manifestaciones clínicas e inmunológicas. Varios modelos animales espontáneos e inducibles reflejan componentes comunes de la enfermedad humana, incluido el modelo de transferencia bm12. Tras la transferencia de esplenocitos bm12 o células T CD4 purificadas, los ratones C57BL/6 desarrollan rápidamente grandes frecuencias de células T foliculares auxiliares (Tfh), células B del centro germinal (GC) y células plasmáticas seguidas de altos niveles de anticuerpos antinucleares circulantes. Dado que este modelo utiliza ratones en un fondo C57BL/6 puro, los investigadores pueden estudiar rápida y fácilmente la progresión de la enfermedad en cepas de ratones transgénicos o knockout en un período de tiempo relativamente corto. En este trabajo se describen los protocolos para la inducción del modelo y la cuantificación de Tfh, células B GC y células plasmáticas mediante citometría de flujo multicolor. Es importante destacar que estos protocolos también se pueden utilizar para caracterizar la enfermedad en la mayoría de los modelos murinos de LES e identificar Tfh, células B GC y células plasmáticas en otros modelos de enfermedad.
Introducción
El lupus eritematoso sistémico (LES) es una enfermedad compleja caracterizada prototípicamente por el anticuerpo antinuclear (ANA) la producción y la glomerulonefritis. Numerosas otras secuelas, incluyendo dérmica, cardio-pulmonar y lesiones hepáticas están asociadas con la enfermedad en algunas personas. Las estimaciones de prevalencia en los EE.UU. varían ampliamente, desde 150,000-1,500,000 1,2, con especial incidencia en las mujeres de alto y las minorías 3. Aunque la etiología de LES ha sido difícil de discernir, se cree que surgen de la interacción de diversos factores genéticos y ambientales, que culminan en la autoinmunidad sistémica.
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Protocolo
Trabajo con animales se realizó en condiciones libres de patógenos específicos, de acuerdo con las directrices establecidas por la Asociación para la Evaluación y Acreditación de Laboratorio Animal Care International y nuestra Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión (IACUC).
NOTA: Incorporar los ratones que expresan un marcador congenic como CD45.1 a cada donante o animales receptores, si es posible, ya que esto permite la monitorización de la eficiencia de injerto donante y ampliación específica del donante población de células T CD4. Si está considerando el uso de ratones modificados genéticamente, como lo contrario de do....
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Resultados
Ratones enfermos desarrollan esplenomegalia en tan sólo 14 días, exhibiendo bazos 2-3 veces el tamaño de ratones sanos en términos de masa y celularidad (Figura 2).
Los esplenocitos se secuencialmente cerrada en dispersión de la luz (FSC-A por SSC-A), la eliminación de dobletes (FSC-W o -H por FSC-A), células viables (bajo tinción de colorante de viabilidad) y CD4 + TCRβ + (Figura 3A). Las células donantes se distinguen de las células r.......
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Discusión
El modelo inducible BM12 es una manera relativamente fácil y eficiente para estudiar los procesos celulares y moleculares de la LES. La activación crónica de las células T CD4 adoptivamente transferidas dirigidas contra antígenos propios conduce a la acumulación de Tfh, las células B GC, y las células plasmáticas que puede ser medida por citometría de flujo, tal como se describe aquí. Futuros estudios que utilizan este modelo de forma rápida y sencilla puede interrogar al papel de los genes candidatos y nuevas terapias .......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado en parte por el Instituto de Investigación del Lupus, el CA138617 de subvenciones del NCI, el DK090978 de subvenciones del NIDDK, el Premio Charlotte Schmidlapp (a E.M.J.) y la Beca Albert J. Ryan (a J.K.). Estamos agradecidos por el apoyo y la instrumentación proporcionados por el Centro de Citometría de Flujo de Investigación en la División de Reumatología del Centro Médico del Hospital Infantil de Cincinnati, respaldado en parte por NIH AR-47363, NIH DK78392 y NIH DK90971.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| B6. SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ | El Laboratorio Jackson | 001162 | CD45.1+ Cepa de ratón BoyJ |
| B6(C)-H2-Ab1bm12/KhEgJ | El Laboratorio Jackson | 001162 | cepa de ratón Bm12 |
| FastDigest PsuI | Life Technologies | FD1554 | Enzima de digestión de restricción para el genotipado |
| 1X Tampón de lisis de glóbulos rojos | eBioscience | 00-4333-57 | |
| IMDM | GE Healthcare | SH30228.01 | |
| Tubo de separación de plasma (PST) | BD | 365974 | Tubo de extracción de sangre con EDTA dipotásico |
| Tubo de separación de suero (SST) | BD | 365967 | Tubo de extracción de sangre con activador de coágulos / SST Gel |
| Ficoll | GE Healthcare | 17-1440-02 | Solución de separación celular de alta densidad |
| Lympholyte-M | Cedarlane | CL5030 | Solución de separación celular de alta densidad |
| GL-7-biotina | eBioscience | 13-5902-82 | |
| Estreptavidina-BUV395 | BD | 564176 | |
| CD138-BV421 | BioLegend | 142508 | |
| CD4-BV510 | BioLegend | 100559 | |
| TCRβ-BV605 | BD | 562840 | |
| CD45.1-BV711 | BioLegend | 110739 | |
| CD45.2-FITC | BioLegend | 109806 | |
| PD-1-PE | BioLegend | 135206 | |
| CD19-PerCP | BioLegend | 115532 | |
| Fas-PE-Cy7 | BD | 557653 | |
| CXCR5-APC | BioLegend | 145506 | |
| Tinte de viabilidad fijable ef780 | eBioscience | 65-0865-18 | |
| CD4-BV421 | BioLegend | 100443 | |
| 1,2 ml Insertos de tubo FACS, bastidor | USA Scientific | 1412-1400 | |
| BD Falcon™ Tubos de fondo redondo | BD | 352017 |
Referencias
- Helmick, C. G., Felson, D. T., et al. Part I. Arthritis Rheum. Estimates of the prevalence of arthritis and other rheumatic conditions in the United States. 58, 15-25 (2008).
- Lupus Foundation of America Web Site. , Available from: http://www.lupus.org/answers/entry/what-is-lupus (2015).
- Somers, E. C., Marder, W., e....
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Reimpresiones y permisos
