Intracellular Ca2+ remodeling in aging may contribute to excitotoxicity and neuron damage, processes mediated by Ca2+ overload. We aimed at investigating Ca2+ remodeling in the aging brain using fluorescence and bioluminescence imaging of cytosolic and mitochondrial Ca2+ in long-term cultures of rat hippocampal neurons, a model of neuronal aging.
La susceptibilidad a la muerte celular neuronal asociada a la neurodegeneración y la isquemia se incrementan excesivamente en el cerebro envejecido pero los mecanismos responsables están mal conocido. La excitotoxicidad, un proceso que se cree que contribuir al daño neuronal inducido por ambos insultos, está mediada por la activación de receptores de glutamato que promueve Ca 2 + afluencia y mitocondrial Ca 2 + sobrecarga. Un cambio sustancial en Ca 2 + homeostasis intracelular o remodelación de Ca2 + intracelular homeostasis puede favorecer el daño neuronal en las neuronas viejas. Para la investigación de Ca 2+ remodelación en el envejecimiento se han utilizado imágenes de células vivas en cultivos a largo plazo de las neuronas del hipocampo de rata que se asemejan en algunos aspectos las neuronas in vivo edades. Para este fin, las células del hipocampo son, en primer lugar, recién dispersa de nuevos hipocampo de rata nacida y chapada en cubreobjetos recubierto, vidrio poli-D-lisina. A continuación, los cultivos se mantienen en medios de comunicación controlados por varios días o varias wEeks para la investigación de las neuronas jóvenes y mayores, respectivamente. En segundo lugar, las neuronas cultivadas se cargan con fura2 y sometidos a mediciones de la concentración citosólica de Ca2 + utilizando imágenes de fluorescencia ratio digital. En tercer lugar, las neuronas cultivadas son transfectadas con plásmidos que expresan un tándem de aequorina baja afinidad y GFP apuntado a las mitocondrias. Después de 24 h, aequorina dentro de las células se reconstituye con coelenterazina y las neuronas son sometidos a imágenes de bioluminiscencia para la monitorización de la concentración de Ca 2+ mitocondrial. Este procedimiento de tres pasos permite la monitorización de citosólica y mitocondrial Ca 2 + respuestas a los estímulos relevantes como, por ejemplo, el agonista del receptor de glutamato NMDA y comparar si estas y otras respuestas están influenciadas por el envejecimiento. Este procedimiento puede producir nuevos conocimientos en cuanto a cómo el envejecimiento influencia citosólica y mitocondrial Ca 2 + respuestas a los estímulos seleccionados, así como las pruebas de medicamentos seleccionados destinadas a prevenir célula de la neuronamuerte en enfermedades relacionadas con la edad.
La excitotoxicidad es uno de los mecanismos más importantes que contribuyen al daño neuronal y muerte celular en insultos neurológicos tales como isquemia, y en algunas enfermedades neurodegenerativas tales como la enfermedad de Alzheimer 1. Este tipo de neurotoxicidad está mediada principalmente por el glutamato actúa sobre Ca 2+ receptores ionotrópicos, -permeable NMDA (NMDAR) 2. La exposición de las neuronas cultivadas a glutamato puede conducir a la excitotoxicidad 3, lo que provoca la apoptosis neuronal 4. Nosotros y otros han informado anteriormente de que la vulnerabilidad neuronal a la apoptosis inducida por NMDA puede cambiar con el desarrollo in vitro y el envejecimiento de 5-8.
Es ampliamente aceptado que un aumento en la concentración de Ca2 + citosólico-libre ([Ca2 +] cyt) conduce a la activación de las células. Sin embargo, si este aumento es demasiado alta y / o sostenida suficiente, puede desencadenar la muerte celular 9. Por otra parte, se ha propuestoque excitotoxicidad requiere Ca 2+ mitocondrial captación 10, ya que el tratamiento de las neuronas con las neuronas protegidas desacoplador mitocondrial contra glutamato inducida por la muerte celular 11. Si mitocondrias ocupan demasiado Ca 2+, se puede producir la apertura de la transición de la permeabilidad mitocondrial, lo que lleva a la liberación de citocromo c y otros factores pro-apoptóticos, y la apoptosis que induce. Recientemente hemos demostrado que este mitocondrial de Ca 2 + captación está directamente relacionado con la susceptibilidad dependiente de la edad a la excitotoxicidad, midiendo directamente inducida por NMDA mitocondrial de Ca 2 + captación en las neuronas del hipocampo individuales 5, un método que se informa en este artículo. El hipocampo, involucrado en procesos fisiológicos tales como el aprendizaje, la memoria y otros procesos cognitivos 12, es altamente vulnerable al envejecimiento y los trastornos neurodegenerativos 13. Se ha propuesto que, después de varias semanas in vitro, se cultivaronlas neuronas del hipocampo muestran un número de características típicas de las neuronas de edad 14. En consecuencia, las neuronas del hipocampo en cultivo a largo plazo pueden proporcionar un modelo integral para investigar Ca 2+ mecanismos mediadas de mayor excitotoxicidad en el envejecimiento.
El objetivo general del método presentado es, por lo tanto, para investigar los cambios sustanciales en el Ca 2+ intracelular homeostasis o Ca 2+ remodelación en el envejecimiento del cerebro incluyendo las respuestas el diferencial Ca 2+ provocadas por agonistas de los receptores NMDA en un largo plazo neuronas del hipocampo en cultivo . El método incluye una descripción detallada de la cultura de las neuronas del hipocampo de rata y el seguimiento de las concentraciones de Ca2 + citosólico y mitocondrial mediante fluorescencia y imágenes de bioluminiscencia en las neuronas individuales, respectivamente. Imágenes de fluorescencia de Ca 2+ citosólico en las neuronas cultivadas es un procedimiento estándar. Sin embargo, este método es menos fiable para subcelular Ca 2+ mediciones incluyendo mitocondrial de Ca2 +. Las razones para esto son la falta de orientación adecuada de sondas sintéticas y afinidad inapropiado para Ca 2+ concentraciones que pueden cambiar en las mitocondrias del bajo nivel M, incluso al nivel mM. El uso de Ca 2 + sondas basadas en proteínas como, por ejemplo, aequorina, ha permitido a la focalización a orgánulos subcelulares y el uso de derivados de diferentes Ca 2 + afinidades utilizando diferentes coelenterazines o sondas mutados que carecen de sitios de unión específica 15 Ca 2+. De esta manera, imágenes de bioluminiscencia de células que expresan aecuorina mitocondrias-dirigida puede permitir el seguimiento de mitocondriales de Ca 2 + concentraciones en neuronas individuales. Sin embargo, este procedimiento puede requerir el uso de cámaras de conteo de fotones o cámaras CCD ultrasensibles de imágenes de bioluminiscencia 16-18. Este método puede producir nuevos resultados que debe ser confirmada en más establmodelos cies de envejecimiento del cerebro como, por ejemplo, secciones de cerebro de animales viejos.
La remodelación de Ca 2 + homeostasis intracelular en el envejecimiento del cerebro se ha relacionado con la pérdida cognitiva, aumento de la susceptibilidad a daños isquémico, la excitotoxicidad y la neurodegeneración. Para investigar esta hipótesis in vitro, procedimientos de imagen Ca 2+ están disponibles. Por desgracia, las culturas viables de las neuronas del hipocampo de edad no son fiables. Recientemente, se ha observado que los cultivos a largo plazo de las neuronas del hipo…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by Ministerio de Economìa y competitividad (BFU2012-37146) and Junta de Castilla y Leòn (BIO103/VA45/11, VA145U13 and BIO/VA33/13), Spain. MCR was supported by Junta de Castilla y Leòn (Spain) and the European Social Fund. We thank the late Dr. Philippe Brûlet (1947-2013) for the mitochondrial GFP Aequorin plasmid.
Neurobasal Culture Medium | Gibco | 21103-049 | |
HBSS medium | Gibco | 14170-088 | |
Ham's F-12 medium | Gibco | 31330-038 | |
DNase I (from bovine pancreas) | Sigma | D5025-15KU | |
Fetal Bobine Serum | Lonza | DE14-801E | |
B27 | Gibco | 17504-044 | |
Gentamicin | Gibco | 15750 | |
L-glutamine | Gibco | 25030-032 | |
12 mm glass coverslips | Labolan | 0111520/20012 | |
Papain | Worthington | LS003127 | |
4-well multidish plaques | Nunc | 176740 | |
Petry dishes | JD Catalan s.l. | 2120044T | |
Sterile pipettes | Fisher Scientific | 431030 | |
Fura2-AM | Life Technologies | F1201 | |
Lipofectamine2000 | Invitrogen | 11668-027 | |
Coelenterazine n | Biotium | BT-10115-2250 uG | |
Digitonin | Sigma | D5628 | |
NMDA | Sigma | M3262 | |
Glycine | Sigma | 50046 | |
Zeiss Axiovert S100 TV microscope | Carl Zeiss Inc. | ||
Xcite ilumination system | EXFO | ||
ORCA ER fluorescence camera | Hamamatsu | ||
VIM photon counting CCD camera | Hamamatsu | ||
VC-8 valve controller | Warner Instruments | ||
SH-27B heating system | Warner Instruments | ||
Aquacosmos Software | Hamamatsu Photonics |