Fácil y Precisa mecanoterapia perfiles en micropost Arrays

Ensayos basados ​​en células de mecanoterapia sensibles permiten investigar las células adherentes, con una amplia gama de aplicaciones que reflejan el papel central que la mecánica pueden desempeñar en la biología celular. Estas aplicaciones suelen centrarse en los mecanismos subyacentes que impulsan procesos subcelulares o el comportamiento de células enteras. Por un lado, los factores ambientales externos, tales como composición de la matriz extracelular o la rigidez de la matriz puede afectar dramáticamente la respuesta mecánica y biológica de una célula. ¹ El mismo se puede observar después de su uso de muchas clases de compuestos farmacéuticamente activos, los efectos de los cuales son caracterizan a menudo el uso de modelos de cultivo celular. ² En las otras propiedades genotípicas de mano, tales como las causadas por mutaciones genéticas espontáneas o inducidas experimentalmente, puede inducir cambios marcados en el fenotipo celular que están asociadas con alteraciones en la estructura y función del citoesqueleto. ³ Estos ejemplos son sólo algunos de los muchos posiblestemas para los que fenotipificación mecánica de las células es relevante, y todos ellos han sido útilmente investigado con matrices micropost.

Al momento de escribir esto, alrededor de 200 artículos han sido publicados describiendo la interacción célula-micropost. Estas obras discuten aspectos teóricos de micropost principios de desviación, así como instrucciones prácticas sobre su fabricación. El primer artículo que describe la interacción de las células y matrices micropost flexibles fue publicado por Tan y sus colegas en 2003. ⁴ En contraste con la microscopía de fuerza de tracción clásica (TFM), donde se utilizan sustratos blandos continuos para estimar la contractilidad celular nanonewton escala, Tan et al. se describe un método que utiliza múltiples vigas verticales espaciados estrechamente hechos de elastómero de silicona. Las principales ventajas de esta técnica emergen de dos características principales. En primer lugar con el fin de cambiar la rigidez del sustrato de células aparente sólo se necesita cambiar las dimensiones micropost mientras se mantienela composición de otra manera constante y evitando de esta manera las diferencias en la topología de la superficie y la química del sustrato. Segundo microposts actúan como resortes individuales que se pueden analizar de forma discreta con la fuerza y ​​la resolución espacial del orden de adhesiones focales individuales y pueden reducir los desafíos analíticos que son inherentes al análisis análoga por la norma TFM.

Hoy en día la gama de aplicaciones para las matrices micropost excede en gran medida sólo el mapeo de las fuerzas de unas pocas células individuales. Por ejemplo, Akiyama informa el uso de un aislado de tejido vaso dorsal a partir de una oruga de la polilla como un actuador para una matriz de micropost, con el fin de desarrollar un robot autónomo micro-músculo-accionado de insectos. ⁵

Sin embargo, las aplicaciones más publicadas de microposts se han centrado en los estudios de las condiciones médicas como infección o cáncer. Por ejemplo, las matrices micropost se han utilizado para estudiar la generación de la fuerza de liado IV pili tipo de Neisseria gonorrhOEA colonias que se asocia con la mejora de cascadas de señales infección. ⁶ Otros han utilizado microposts para estudiar las células de cáncer de mama tratados con compuestos farmacéuticos dirigidos a la citoesqueleto. ⁷

Desviación de un micropost se describe a menudo utilizando la teoría clásica de haz para un voladizo con una carga final asumiendo la célula se une sólo a la punta de la micropost. Aquí la fuerza aplicada F que provoca una deflexión δ depende de k "rigidez a la flexión" de la micropost y se calcula por:

(1)

con E, I, L y siendo el módulo de Young, área de momento de inercia y haz de longitud respectivamente. Sin embargo, los resultados de esta ecuación sólo dan una aproximación general de las fuerzas en el trabajo ya esquila viga y flexión, así como la deformación del sustrato no se tienen en accontar. Teniendo en cuenta que microposts se hacen típicamente de materiales blandos como polidimetilsiloxano (PDMS) basado en caucho de silicona estos factores deben ser incluidos. . Schoen et al demostraron que existe un factor de corrección tales basada en la relación de aspecto de la micropost (L / D) y del polímero correspondiente relación de Poisson v ⁸ Lo administra.:

(2)

Con T _{de inclinación (v)} un coeficiente de inclinación que incluye como se puede encontrar en el mismo artículo de ajuste de parámetros a = 1,3:

(3)

Eso significa que la rigidez corregida de un micropost k _corr es el producto de la rigidez a la flexión pura k = k _{se doblan y} el factor de corrección corrdada por:

(4)

Por lo tanto, los cálculos de fuerza células deben realizarse utilizando la variación más refinada de la ecuación (1) ya la lectura:

(5)

El impacto de la corrección se hace más evidente tan pronto como se utilizan los valores típicos para las dimensiones micropost. Por ejemplo, una larga micropost 15 micras con una sección transversal circular y un diámetro de 5 micras hecha de caucho de silicona a base de PDMS conduce a un factor de corrección de 0,77 y por lo tanto un cálculo no corregida sería sobreestimar las fuerzas de células ejercida por 23%. Esto se hace aún más grave para microposts con relaciones de aspecto más pequeños.

Tradicionalmente, el análisis de imagen micropost también se ha basado en la viga idealizada teoría de la flexión. En 2005 el grupo que fue pionero en el uso de micrmatrices opost publicaron un software de análisis de imagen adecuado para el análisis micropost ⁹ El software requiere una licencia de software y el usuario debe tomar tres imágenes para cada posición.; uno de cada uno de los planos superior e inferior de la micropost en modo de transmisión y otro en modo de fluorescencia con la célula teñida. Después de comparar las posiciones superior e inferior para cada micropost el software determina un campo vector de fuerza y ​​calcula los parámetros relacionados como la fuerza por correo. Existen otros paquetes de software y sus principios de análisis se mencionan brevemente en los artículos correspondientes que los describen, pero estos paquetes de software de análisis generalmente no están disponibles al público. ^10,11

Las matrices micropost diseñados para las fuerzas de células mapeo se pueden clasificar como estar en una disposición ortogonal micropost o un ser hexagonal, el último de los cuales tienen la ventaja de huecos equidistantes entre todos microposts vecinos. Microposts típicos jave una sección transversal circular y sus dimensiones varían desde 1.0 micras a 10 micras de diámetro y de 2 a 50 micras de longitud. ⁴ Sin embargo, microposts con sección transversal elíptica o cuadrada también se han reportado ^12,13.

El uso de mezclas de silicona a base de PDMS como material de micropost permite la adición de las nanopartículas en la mezcla. Por ejemplo la adición de cobalto nano-barras permite una activación magnética del micropost y por lo tanto da otro grado de libertad de los posibles diseños experimentales. ¹⁴ La mayoría de los grupos producen sus matrices micropost en sustratos rígidos planos como cubierta de vidrio o en el interior de una caja de Petri. Sin embargo, Mann y sus colaboradores informaron recientemente una serie micropost formado sobre una membrana elástica. ¹⁵ Esto permite que la aplicación de fuerzas de células estiramiento a células adherentes mientras estudiaba de células en vivo subcelular respuestas dinámicas en cuanto a la contractilidad celular.

El estab y más ampliamente empleadocido proceso para la fabricación de matrices micropost se basa en litografía blanda como se describe en los protocolos de Sniadecki interesantes y sus colegas ^16-18. En los procesos de sala limpia estándar cortos se utilizan para generar las microestructuras en la parte superior de una oblea de silicio usando fotorresistente SU8. Esto es seguido por un proceso de copiado en el que el caucho de silicona se proyecta sobre las estructuras de la transferencia de ellos en los moldes. En una segunda etapa estos moldes se usan para replicar la microestructura inicial usando caucho de silicona en la parte superior de un sustrato elegido. Sin embargo a pesar del número grande y creciente de publicaciones relacionadas con su aplicación, estableciendo un proceso de fabricación de microposts lleva una considerable cantidad de tiempo incluso para los expertos micro-ingeniería; hay muchos pasos de proceso que requieren la optimización y adaptación al entorno de laboratorio específica y el diseño micropost para producir un nivel de calidad aceptable.

Matrices micropost comerciales están ahora disponibles en una lista-tformato o-uso ("off-the-shelf") con una alta calidad constante. Como tales, son una alternativa al proceso de fabricación complejo y largo requerido para la producción in situ. En este trabajo se utilizó una matriz micropost disponible en el mercado para el mapeo de las fuerzas celulares utilizando imagen de microscopía un solo campo brillante. Más importante este artículo describe y documenta un software de código abierto completamente funcional llamado MechProfiler, que está disponible para su descarga como material complementario a este manuscrito. Una versión mantenido activamente del software también se puede encontrar en http://www.orthobiomech.ethz.ch.

La combinación de un ensayo de "off-the-shelf" y un software de análisis de código abierto compatible reduce notablemente el obstáculo de entrada para lograr experimentos TFM precisos. Los investigadores no tienen acceso a cualquiera de las instalaciones de sala limpia o experiencia en el desarrollo de software pueden analizar las fuerzas celulares con éxito. Permite a un usuario a centrarse en los mechanossalida ensayo ensitivity en lugar de la tecnología en sí, y hace mediciones de fuerza de tracción a disposición de una comunidad más amplia. Además, este es un paso importante para allanar el camino hacia la detección completamente automática de matrices micropost.

El software de análisis MechProfiler procesa imágenes en formato tiff archivo, png, bmp y gif. Las imágenes pueden ser tomadas usando la fluorescencia, contraste de fase o el microscopio óptico de campo claro. El programa independiente se ejecuta junto con el Compiler Runtime libre de Matlab (disponible en: Figura 12) y los algoritmos subyacentes permite el procesamiento de imágenes aerodinámico, que permite al usuario procesar las imágenes con células individuales o múltiples en aproximadamente 1 min. Además, estas células o bien pueden estar viviendo o "fijos".

El software MechProfiler es capaz de aumentar en gran medida el análisis de datos de rendimiento basándose en la reproducibilidad de arrays micropost calidad comercial, más específicamente, el valor predeterminado & #8220; no desviada "posición de cada mensaje en la matriz puede presumirse en contra de una rejilla ideales (desviaciones de fabricación de la red en las matrices utilizadas para este estudio tenían menos de 100 nm).

En resumen se abre una selección de archivos de imágenes para el análisis, los cultivos de la región de interés, define los puestos de trabajo regulados por las células o que deben ser desechados, determina las posiciones de correos, calcula las desviaciones / fuerzas contra la red de ideales, y, finalmente, guarda todos los datos específicos de la célula con una posibilidad para la exportación, incluyendo a una hoja de cálculo estándar de oficina.

1. Las células de cultivo en micropost Arrays

Nota: Todos los pasos deben realizarse en una cabina de bioseguridad para garantizar la esterilidad. Los volúmenes que se dan aquí son para frascos de cultivo de células T25. La densidad media de la receta y la siembra de células de cultivo de células están optimizados para líneas celulares de cáncer de hueso HuO9 y M132.

1. Preparar un cultivo de células para la siembra en una matriz micropost.
   1. Inspeccione la calidad del cultivo celular colocando el frasco de cultivo en un microscopio óptico estándar. Asegúrese de que las células muestran un crecimiento y morfología típicos mediante la estimación de la cantidad del fondo frasco de cultivo está cubierto. Una cobertura de 70% -80% refleja una tasa de crecimiento saludable. Preste atención a la cantidad de células flotantes ya que representan las células muertas y / o una cultura con mucha vegetación.
   2. Trypsinize células mediante la eliminación de medio y el lavado con 4 ml de 1x tampón fosfato salino tampón (PBS). Añadir 0,8 ml de 1x tripsina / ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) y se incuba a RT hasta que la células dislodge, que toma alrededor de 2-4 min. Compruebe el proceso con el microscopio y, ocasionalmente, golpee suavemente el frasco para apoyar el desalojo.
   3. Añadir 5 ml de medio de cultivo celular (medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) / F12 con 10% de suero bovino fetal (FBS), 1% de penicilina / estreptavidina (Pen / Strep)) para detener la reacción y para lavar las células residuales que todavía se sientan en la parte inferior del matraz. Posteriormente, verter esta suspensión hacia arriba y abajo varias veces para obtener una mezcla homogénea. Asegúrese de pipeta todas las soluciones en todo el área de crecimiento original del matraz para obtener un desalojo efectivo.
   4. Transferir la suspensión celular en un tubo de 15 a ml y centrifugar usando una centrífuga de mesa en 0,5 xg durante 3 min.
   5. Eliminar el sobrenadante y volver a suspender el sedimento celular en 5 ml de medio pipeteando arriba y abajo 5 veces. Asegúrese de evitar la generación de burbujas mientras lo hace.
   6. Determinar la densidad celular mediante el uso de una cámara de recuento celular y un microsco luzEducación física. Consultar la suspensión celular en cámara de recuento celular para los agregados de células y garantizar tener solamente células individuales para el experimento posterior. Pipetear otra vez hacia arriba y abajo varias veces si las células tienden a formar agregados para separarlas.
   7. Diluir la suspensión de células con medio suficiente para obtener una solución de células de 25.000 células / ml. Mezclar bien invirtiendo el tubo cerrado en varias ocasiones.
2. Preparar una matriz micropost para la siembra de células.
   Nota crítico: No pipetear en la matriz micropost directamente como esto podría dañar las microposts, sobre todo cuando se introducen burbujas no deseadas. Además, asegúrese de que la matriz micropost nunca se seca como se producen fuerzas capilares conducen al colapso de los microposts.
   1. Coloque el sustrato de vidrio con la matriz micropost boca arriba en un pocillo de una placa de 12 pocillos usando un par de pinzas y mojar mediante la adición de 1 ml de etanol (99%). Incubar a temperatura ambiente durante 20 a 30 segundos.
   2. Diluir el etanolpaso a paso mediante la adición de aproximadamente 1 ml de agua desionizada estéril (agua DI) en el lado de aspiración bien y aproximadamente 1 ml usando una pipeta de transferencia o dispositivo de aspiración. Repita este paso al menos 3 veces.
   3. Sustituir el agua DI con PBS-buffer de la misma manera mediante la adición y la aspiración de aproximadamente 1 ml. Repita este paso 3 veces.
   4. Sustituir el tampón PBS con medio mediante la adición de aspiración y aproximadamente 1 ml de medio. Repita este paso 3 veces.
3. Pipeta solución de 1 ml de células (25.000 células) en la parte superior de cada matriz micropost preparado. Cerrar placa de pocillos múltiples y transferirlo a una incubadora (CO ₂ al 5%, 37 ° C). Deje que las células se adhieren y crecen en la parte superior de microposts para 6 -7 horas.
4. Inspeccione el proceso de adhesión en ocasiones mediante el uso de una luz de un microscopio. Compruebe que la mayoría de las células aparecen extendían a través de múltiples microposts.

2. Fijación y tinción de las células

Nota: Todas las medidas yvolúmenes que se dan aquí son para un solo pocillo de una placa de 12 pocillos. Se recomienda para procesar no más de cuatro de los doce pozos en un momento para evitar una desecación de los pocillos después de la aspiración de cualquier líquido, lo que resultará en un colapso de los microposts.

1. Aspirar medio del pozo y lavar las células 2 veces con 1 ml de PBS-buffer. Asegúrese de aplicar una fuerza suave mientras se lava con PBS para eliminar los desechos celulares que se acumuló en la matriz micropost durante la incubación y para desprender las células muertas.
2. Fijar las células con una solución de formaldehído tamponado 0,5 ml 3,7% durante 5 min.
3. Reemplace la solución de formaldehído por lavado de las 2x matriz micropost con 1 ml de agua DI estéril.
4. Teñir las células con colorante (0,05% Coomassie azul brillante en el 50% de agua, 40% de etanol y ácido acético al 10%) por alrededor de 90 segundos. Lave solución de tinción exceso de 2 veces con 1 ml de agua DI estéril. Añadir agua DI 1 ml a micropost matriz.
5. Compruebe la tinción con un microscopio óptico. Repita tque manchaba paso, si el cuerpo celular es demasiado débil para ser visualizado.
6. Matrices micropost tienda con las células teñidas en la parte superior en un refrigerador a 4 ° C. Asegúrese de mantenerlos bajo el agua en todo momento.

Imagen 3. celular

Nota: El paso 4 sólo se aplica a los microscopios y sin infinito corregido la óptica.

1. Añadir 2 ml de agua DI a una placa de Petri con un fondo de cristal fino para obtener imágenes de alta resolución.
2. Transferencia array micropost usando un par de pinzas en el plato de imagen con las microposts hacia arriba.
3. Coloque la imagen placa de Petri en un escenario móvil de un microscopio de luz.
4. Girar el anillo de compensación de la lente utilizada para formación de imágenes hasta que el número en la escala representa el espesor total de todos los materiales a lo largo de la trayectoria óptica para compensar la falta de coincidencia en los índices de refracción del sustrato de vidrio, el elastómero de silicona y el líquido en la parte superior. Esto debería conducir a un aspecto brillante de los micropostsnúcleos.
5. Cerrar el iris en el lado de la iluminación a 50% y eliminar cualquier anillos de contraste de fase de la trayectoria óptica que permite un modo de campo brillante ordinaria.
6. Alinear la matriz micropost que los microposts forman una línea horizontal a través del campo de observación. Definir un punto de partida (por ejemplo, arriba a la izquierda) y mover el plato de Petri por etapas a través del escenario escanear la matriz micropost mientras toma numerosas imágenes.
7. Tome todas las imágenes con la configuración más alta resolución de la cámara utilizando un objetivo 20X o 40X. Objetivo es tener una sola célula en el centro de la imagen.
8. Barrer lo largo del eje z a través del sustrato hasta que las puntas micropost están en foco. Utilice la rueda de enfoque fino de sintonización del microscopio y gire hacia centrándose en la parte inferior micropost durante unos 2-3 micras.
9. Establecer un procedimiento de imagen estándar tomando serie de imágenes de prueba de una sección matriz barriendo a través de los parámetros de una imagen a la vez (por ejemplo, tiempo de exposición,ajuste de iris, la configuración de la lámpara, etc.). Analizar imágenes con MechProfiler y determinar un conjunto de parámetros adecuados para un análisis rápido y fiable.

Análisis 4. Imagen con Open Source Software "MechProfiler"

Nota: Todas las funciones de software se pueden activar con un dispositivo señalador con el botón izquierdo del ratón. Sin embargo, un operador entrenado utilizará la combinación de teclas documentados diseñados para estar en la media izquierda del teclado para permitir un procesamiento de imagen de dos manos eficiente.

1. Comience el análisis de imágenes MechProfiler software y abrir una serie de imágenes que necesitan ser analizados haciendo clic en "Abrir".
2. Inserte todos los parámetros en la sección "Configuración" propuesta por el desarrollador de software. Determinar los parámetros que se deben configurar a medida (es decir, el umbral de contorno y distancia mínima) de acuerdo con los procedimientos descritos en detalle en el manual de software.
3. Analizar imagens uno por uno a los cultivos a la zona de interés mediante el uso de "Recortar" (haga clic y arrastre con el botón del ratón pulsado). Haga doble clic dentro del rectángulo dibujado para terminar esta acción.
4. Marcado cada contorno celular visible uno por uno haciendo clic en "Dibujar contornos celulares" y utilice el cursor de cruz para el dibujo incluyendo todos microposts la célula está unido a.
5. Deseche cualquier microposts no deseados haciendo clic en "Descartar Mensajes" y utilice el cursor de cruz para el dibujo. Adjunte todos microposts que pertenecen a una celda fuera de la sección de imagen o que son desviados por cualquier otra razón, pero no por la célula de interés.
6. Inicie el software de subrutina "Encuentra centroides" por clic del ratón. Ajustar la configuración justo al lado del botón "Buscar centroides" hasta que todos microposts están registrados, que es visible por una cruz roja en su centro de filtro. Si el ajuste del filtro es demasiado serán ignorados microposts bajas, si es demasiado alta muposiciones ltiple estarán marcados por un solo micropost. Mantenga el filtro de la creación constante durante una sesión de análisis.
7. Utilice la función de edición manual "Edición manual" para centroides con múltiples o perdidas posiciones micropost. Utilice la cruz del ratón para seleccionar el micropost en cuestión haciendo clic y arrastrando al otro lado. Haga doble clic dentro del rectángulo y colocar el marcador rojo que falta en la sección de imagen ampliada, que se cierra automáticamente. Descartar una micropost como si está fuera del contorno celular dibujado (véase el paso 4.5) antes de continuar.
8. Encuentra la red micropost ideales mediante la activación de la función "Generar cuadrícula" con un clic del ratón. Asegúrese de que la posición se corresponde con la verdadera cabeza micropost, que se muestra por un anillo azul, adentro de la línea celular dibujado.
9. Corrija cualquier fabricante de rejilla fuera de lugar dentro del área de la celda donde sea necesario el uso de la función correspondiente "Manuel Editar" con un clic del ratón. Utilice la cruz para seleccionar el micropost en question haciendo clic y arrastrando al otro lado. Haga doble clic dentro del rectángulo que aparece y colocar el marcador azul perdido en la sección de imagen ampliada, que se cierra automáticamente.
10. Utilice el botón "Calcular" deflexiones por clic del ratón para obtener un histograma de los valores de deflexión estimado a partir de la diferencia entre la posición de un micropost dentro de la sección de imagen y la rejilla ideal generado.
11. Guarde el análisis completo que incluye las tablas de valores por un clic del ratón en "Guardar".
12. Continuar con el análisis de la imagen, ya sea haciendo clic en "Reset View" y analizar otra sección de imagen o clic con el ratón en "Siguiente Imagen", que convenientemente se puede hacer con la tecla de cursor derecha del teclado.

5. Análisis de Datos - Mechanoprofiling

1. Abra el archivo "Results.xls" con un programa de hoja de la oficina de la carpeta con las imágenes analizadas. Contiene los datos con otrosl valores calculados incluyendo todos deflexiones micropost y medidas derivados estándar, tales como el trabajo (es decir, la energía de deformación del sustrato) por la célula analizada.

La principal ventaja de la técnica descrita radica en su simplicidad y su potencial para la integración rápida y efectiva sobre el trabajo de laboratorio de rutina. La combinación de redes de sensores comerciales de alta calidad combinados con software de código abierto proporciona información acerca de mecano-sensibilidad que de otro modo requiere el acceso a las instalaciones de sala limpia y un profundo conocimiento de análisis de imagen y desarrollo de software. La figura 1 ilustra el flujo de trabajo del método presentado. Se inicia con la preparación y siembra de células en la matriz micropost. Después de la fijación y tinción de las células los arrays micropost están listos para la formación de imágenes. La parte central de la técnica es el análisis de imagen usando el software MechProfiler. Un usuario puede iniciar analyszng imágenes inmediatamente después de entrar en todos los parámetros relevantes en los "Ajustes" de la interfaz gráfica de usuario. El tamaño del píxel correspondiente es la longitud que está representado por un solo píxel y depende de la configuración del usuario. Necesitadebe establecerse por separado para cada ampliación utilizado por la toma de imágenes de objetos con tamaño conocido. Un ejemplo se da en la figura complementaria 9.

La calidad de imagen es un factor clave, ya que influye fuertemente en el proceso de análisis. Con el fin de lograr la más alta calidad que uno debe asegurarse de contar con una plataforma de imagen estable y mantenido de forma rutinaria como se muestra en la Figura 2. En particular, la alineación de la fuente de luz es importante como desalineación provocará sombras no deseados que pueden ser problemáticos en el análisis de la imágenes. Por otra parte, la colocación del microscopio de luz encima de una mesa antivibraciones o placa es beneficioso en la mayoría de los laboratorios, ya que da estabilidad adicional durante la exploración.

Las ventajas de usar un cristal fino fondo placa de Petri para imágenes incluyen valores de apertura numérica más alta efectivos que se traduce en imágenes más brillantes con una mayor resolución.

Cuando taking las imágenes en el modo de campo claro se recomienda un 50% iris cerrados, ya que se centra en la punta microposts se facilita debido a las circunferencias que aparecen como un anillo oscuro quebradizo. Por otra parte, en caso de que el objetivo usado tiene un anillo de compensación, es esencial para establecer correctamente para lograr lecturas precisas de fuerza. El impacto de esa característica se puede ver mediante la comparación de la Figura 3A y la Figura 3B. Las imágenes que se pueden analizar rápidamente se consiguen mediante la combinación de la configuración correcta del anillo de compensación junto con una iluminación óptima como se muestra en la Figura 3C. Fuerte contraste entre un micropost y su alrededores reduce el tiempo de análisis, ya que acelera el algoritmo de búsqueda. Los usuarios encontrarán que sólo se requiere experiencia mínima de lograr imágenes que se pueden analizar con facilidad.

Es importante destacar que los protocolos anteriores superar un obstáculo crítico y común a la integración rápida y eficaz de arrays micropost en la rutinatrabajo de laboratorio. Este obstáculo se deriva de la necesidad de controlar la calidad del array - una demanda que se puede lograr sólo mediante la caracterización experimental completo y detallado de la reproducibilidad del sensor, la sensibilidad, y la precisión. Sin embargo, girando a arrays micropost disponibles comercialmente este obstáculo considerable se evita completamente. Figuras 4A y 4B ilustran la exactitud de una matriz de tales micropost. La desviación de la posición microposts es bien bajo 200 nm y, como tal comparable con un "error pixel" que acompaña a la / combinación objetivo de la cámara que resultó en un tamaño de píxel de 82 nm para la configuración utilizada. El análisis de imágenes con células desviar el microposts demuestra que los valores para una deflexión de células-impuestas son sustancialmente superiores a 200 nm (como se muestra en la figura 4C y figura 4D) que conduce a una señal cómoda a ruido.

Figura 5 Illustrates los diferentes tipos de partidos con microposts dentro de una imagen en función de si se desvía o no. Como se mencionó anteriormente microposts no desviada tener un aspecto circular brillante con un anillo oscuro alrededor de ellos. Su posición se puede determinar usando una transformación Hough, que es una técnica de extracción de características para el análisis de imagen digital.

Además, muestra que microposts desviados en un microscopio invertido muestran dos hacia formas de media luna oscuros (ver Figura 5A). En un microscopio vertical del borde de la punta micropost y uno forma de media luna oscura son adecuadamente visible mientras que la segunda se hace difícil de detectar. Estas características son la base para calcular las posiciones de brillantes imágenes de microscopio de campo de los consejos de microposts desviadas, que ha sido desarrollado para este protocolo y fue nombrado "Enfoque contorno".

La Figura 5B es un ejemplo de un cáncer de hueso HuO9celular en microposts fotografiados en un microscopio invertido (arriba). La versión analizada de esa imagen muestra los resultados del contorno de aproximación aplicada (abajo). Figura 5C fue tomada usando la misma matriz micropost con un microscopio vertical (de arriba). Una vez más la versión analizada muestra los resultados de usar el enfoque de contorno.

Cada sesión de análisis de imágenes se inicia por una verificación de usuario de los parámetros en la sección "Configuración" del MechProfiler. Algunos se dan por el fabricante micropost como micropost dimensiones de matriz y constante del resorte. Otros son definidos por el usuario, tales como los valores para el umbral de contorno y un umbral mínima deflexión de acuerdo con procedimientos detallados en el manual del software. Sin embargo, es importante tener en cuenta que estos valores deben ser elegidos cuidadosamente y deben ser constantes para todas las imágenes dentro de un conjunto interrelacionado de imágenes para garantizar la comparabilidad. Considerando que las medidas tratamientos previos para la analysi imagens, como el recorte, se auto-explicando las estrategias subyacentes de las funciones de software como "Finding centroides", "Generar Grid" y el "Enfoque Contorno" necesita una explicación más detallada.

Detección algorítmica de la posición micropost defecto (como entregado por el fabricante) comienza con la función de software "centroides Encontrar". El algoritmo comienza en la esquina superior izquierda de la imagen en busca de la primera micropost. Posteriormente todas las demás microposts se encuentran basado en las coordenadas de ese primer micropost más los valores para el tamaño de la cuadrícula y micropost dada por el fabricante siguiendo la geometría hexagonal. El centro de gravedad de cada micropost encontrado se calcula utilizando una transformación de Hough. La corredera del filtro junto al botón de mando de la interfaz gráfica de usuario permite ajustar la sensibilidad de esta transformación. Todos microposts encontrados se marcan con una cruz roja y sus posiciones destacan por suprocesos bsequent.

A continuación, la función "Generar Grid" conduce a las coordenadas de todos microposts consejos. Son los resultados de un proceso de múltiples pasos. En primer lugar una función de optimización se resuelve incluyendo las posiciones iniciales del algoritmo antes ejecutado "Encuentra centroides" para establecer la red ideal. En segundo lugar se calculan las posiciones de los microposts dentro del área de la celda. Microposts con menos desviación que se define en el parámetro de configuración "umbral mínimo de desviación" con respecto a la red ideales se procesan con una transformación Hugh. Todas las demás posiciones de punta micropost se calculan utilizando el método de contorno anteriormente descrito para microposts desviadas. Aquí, el software inicia la búsqueda desde el centroide inicial del centro de la celda para un borde circular (brillante a oscuro) dentro de un ángulo de 15 ° (véase la figura 5A). Una vez que el borde se encuentra un círculo con el diámetro micropost dado está montado en tborde del sombrero usando el valor umbral de contorno de la configuración de la interfaz gráfica de usuario. Ese parámetro determina qué valor de gris del pixel se utiliza para el proceso de adaptación. Cuanto mayor sea ese valor es el más el accesorio se inclina hacia el centro micropost brillante es la más baja que se valoran más se ajuste a ese círculo al contorno micropost más oscuro. Una vez elegido ese valor debe permanecer constante para todos los análisis de imagen dentro de un estudio dado a evitar la adición de deflexión artificial o llamando deflexiones demasiado conservadora.

Por ejemplo, la Figura 6 ilustra la importancia de decidir por un valor de umbral de contorno apropiado. El software permite al usuario elegir para una amplia gama (0,1 a 0,9) para abarcar todas las posibles situaciones de iluminación físicamente. La traducción de la información óptica en distancias de deflexión dadas para ambos extremos y un valor más práctico en el medio se da en la Figura 6B. Sin embargo, los usuarios de software capacitados menudo convergE para valores de umbral contorno muy similares, lo que lleva a resultados comparables como puede verse en la Figura 6C. Además, usando procedimientos estandarizados para la tinción celular y de formación de imágenes minimiza el riesgo de valores de umbral contorno no válidos, que generalmente debe permanecer constante dentro de conjuntos interrelacionados de imágenes.

Con el fin de demostrar la robustez del método de una selección de resultados mecano-perfilado se resumen en la Figura 7. En la Figura 7A dos resultados a partir de células de cáncer de hueso HuO9 y dos de M132 se comparan. Todos los cuatro arrays son del mismo lote de producción y por lo tanto tienen propiedades mecánicas idénticas. El análisis se realizó con un conjunto fijo de parámetros para la desviación mínima (0,25 micras) y para el umbral de contorno (0.125). Además, dos juegos idénticos de imágenes de SaOS cáncer de hueso 2 fueron entregados a dos analistas, sin más información sobre la configuración de parámetros (ver Figura 7B). La influencia de la tinción en el análisis fue probado por la toma de imágenes de células de cáncer de hueso teñidas con azul de Coomassie R. Posteriormente se retiró el tinte. Después de volver a la tinción con Coomassie azul G se tomó un segundo conjunto de imágenes. Figura 7C ilustra los resultados de ambas series, las cuales fueron analizadas por el mismo usuario con valores idénticos para la desviación mínima (0,25 m) y el umbral de contorno (0.25) .

Un ejemplo típico de aplicado mecano-perfiles se presenta en la Figura 8A, en el que los datos recopilados se presenta para las líneas celulares de cáncer de hueso HuO9 y M132 después de analizar 151 células agrupadas de cada uno de los cuatro conjuntos. En este panorama, todos los valores de los indicadores son más altos para HuO9 que para M132 ya que indica que las células HuO9 aplican más fuerza de la M132. Sin embargo, los datos del análisis de imagen contiene una gran cantidad de información adicional de una sola célula que puede ser extraído para entender mejor phencomportamiento línea celular otypic y la variabilidad de célula a célula dentro de una línea determinada. Con la presentación de los resultados de la fuerza por micropost en un gráfico de caja se encuentra que a pesar de mínimos y máximos similares, los valores de datos se distribuyen de manera diferente y de hecho la línea celular metastásica baja células HuO9 tienden a aplicar más fuerza de la línea M132 altamente metastásico (ver Figura 8B). Además, mediante la categorización de los valores de fuerza con respecto al área de la celda se encuentra que la fuerza media por célula no sólo se eleva para las células HuO9 en comparación con M132 sino también que la fuerza promedio por aumentos micropost medida que las células se extendió hasta que la fuerza promedio por enviar alcances un valor más estable (como se puede ver en la Figura 8C). Por otra parte para las células que cubren siete microposts los valores son casi idénticos, que es probablemente debido al hecho de que normalmente aparecen en forma hexagonal con un solo centro no desviada micropost independiente de su línea celular. Aparte del diffcias de la contractilidad, diferencias morfológicas se pueden cuantificar con resultado interesante. Por ejemplo, en contraste con las células M132 altamente metastásicas había muy pocas células HuO9 que cubrían sólo tres microposts. Otras comparaciones morfológicas entre las líneas celulares se pueden hacer, incluyendo la distribución de área de la celda representado por el número de microposts cubiertos. Figura 8D ilustra que las dos líneas celulares también difieren en el comportamiento dinámico cuando la difusión cada vez mayor en la parte superior de microposts. En resumen, el mechanoprofile para la línea celular parental HuO9 revela que suelen cubrir más área y aplicar un poco más de fuerza a microposts mientras que la línea celular metastásico M132, una célula agresiva que se deriva de HuO9, cubre característicamente menos microposts y aplica menos fuerza por micropost . Estos resultados demuestran el potencial de un enfoque basado en TFM para aplicaciones discriminatorias.

Figura 1. Experimento de flujo de trabajo. (A) El procedimiento general contiene cinco consecutivos principales pasos de la siembra de células en una matriz micropost a perfilar sus propiedades mecánicas. (B) El análisis de las imágenes se realiza con el software MechProfiler descrito. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2. Configuración Imaging. Un microscopio invertido estándar se utiliza para obtener imágenes de las células en las matrices de micropost. La configuración también contiene una cámara de microscopio y su controlador, que también puede proporcionar funciones de almacenamiento de datos. La gran pantalla que se muestra no es esencial pero no obstante es conveniente para la imagen ampliadasesiones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3. Guía para la formación de imágenes micropost. (A) Imagen de células teñidas en una matriz micropost tomada con una lente de 40X en modo de campo brillante. Microposts no desviadas-aparecen anillos oscuros cuando fotografiado. Mensajes desviados asumen una forma elíptica con las dos regiones más oscuras y más brillantes sub. Células teñidas que cubren microposts hace parecer aún más oscuro hasta el punto de que no hay contraste entre micropost y celular. (B) imágenes idénticas tomadas después de ajustar el anillo de compensación de la lente y volver a enfocar. Aquí los núcleos de los microposts vuelven sustancialmente más brillante y dar más contraste. (C) La misma posición fotografiado de nuevo después de adjusting todos los parámetros de iluminación con el controlador de la cámara. Los microposts libremente de pie aparecen como círculos brillantes con un anillo oscuro. Microposts desviados muestran una media luna "sombra" distinta alrededor del núcleo de la ensenada a lo largo del eje de tracción. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.>

Figura 4. capturas MechProfiler de microposts analizados. (A) Un ejemplo típico de un vacío array micropost se puede ver en esta captura de pantalla. Los microposts están dispuestos en un patrón hexagonal constante. (B) El histograma con los valores de desviación para estos microposts muestra que todos los valores están por debajo de 200 nm. (C) Ejemplo típico de un hueso cubierta de células de cáncer HuO9y tirando de múltiples microposts. Se puede observar que la cantidad de tracción es heterogénea. (D) El histograma con los valores de deflexión para la célula HuO9 muestra el amplio espectro de las desviaciones que surge de la interacción de las células con el sustrato micropost. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5. apariencias micropost en la iluminación de campo brillante y las estrategias para el cálculo de su posición dentro de una imagen. (A) microposts para no desviarse aparece como un área circular brillante con un anillo exterior oscuro. El centroide se calcula una transformación Hough. Microposts desviado muestran formas de media luna oscura. Dependiendo de la configuración del microscopio si las microposts enfrentan el ligh fuente t (por ejemplo, microscopio invertido) hay dos formas bien visibles de media luna. Si los microposts enfrentan el objetivo (por ejemplo, microscopio vertical) sólo una media luna es bien visible, sino también el mismo borde de la punta. En ambos casos el contorno de aproximación se debe utilizar para calcular la punta micropost. (B) Una imagen original (parte superior) usando un microscopio invertido de una célula de cáncer de hueso HuO9 y su versión analizada (parte inferior) utilizando el contorno de aproximación. (C) La imagen original de la misma matriz micropost (arriba) utilizando un microscopio vertical y la versión analizada, una vez más la aplicación del enfoque de contorno (abajo), pero con un valor mucho más bajo umbral de contorno más adecuado para llamar el borde en forma de anillo oscuro. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 6. El contorno de aproximación y elegir el valor umbral apropiado. (A) Los tres capturas de pantalla ilustran las mismas microposts analizados utilizando tres valores de umbral de contorno diferentes. Si el valor se establece demasiado baja (izquierda) o muy alta (derecha) que el software se ajuste el anillo azul que representa la cabeza micropost incorrectamente. Se subestima o sobrepasa la posición real de la cabeza micropost. Un valor umbral elegido correctamente permite que el software para adaptarse a ese anillo azul a la forma de la zona oscura en el interior del micropost que se forma a través de la desviación media luna. (B) El gráfico muestra la cantidad promedio de la desviación depende de la contorno umbral elegido para los microposts mostrados en la anterior. También ilustra que los valores para los microposts fuera del contorno de células no se ven afectados ya que el ajuste del contorno no se aplica allí. (C) El gráfico ilustra que la elecciónun valor umbral dentro de un intervalo de moderado minimalizes el riesgo de sobre o subestimar las deflexiones micropost. La diferencia entre los valores elegidos por diferentes usuarios capacitados es normalmente inferior a 0,05, lo que se traduce en diferencias aceptables en los valores medios de desviación. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7. Prueba de robustez para mecano perfil resultados de diferentes líneas celulares de cáncer de hueso; las barras de error representan una desviación estándar (A) de perfiles de Mecano-resultados de cuatro arrays micropost idénticos después de la siembra de células en la matriz de HuO9 1 y M132 en la matriz de 3 -. cuatro días más tarde siembra HuO9 en la matriz 2 y M132 en la matriz 4. (B) Comparación de los resultados de mEchano-perfiles basados ​​en juegos idénticos de imágenes tras el análisis por dos analistas independientes. (C) Comparación de los resultados de análisis de imágenes de dos diferentes series de imágenes una primera toma después de la tinción con Coomassie Blue R y la segunda después de la eliminación completa de tinte y re-tinción con Coomassie azul G. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura .>

Figura 8. mecanoterapia perfiles de líneas celulares de cáncer de hueso. (A) La comparación entre las dos líneas celulares de cáncer de hueso HuO9 (bajo potencial metastásico) y M132 (altamente metastásico) gráfico muestra que todos los valores de los indicadores son más altos para la línea celular HuO9 ( N total = 302; dos conjuntos independientes de experimentos, barra de error = desviación estándar). (B trong>) El diagrama de caja ilustra que las fuerzas aplicadas por micropost están en el rango de nano-Newton inferior. Sin embargo, las células HuO9 tiran más de células M132 (Bigotes representan el mínimo de datos y máximo). (C) Un resultado similar se puede ver mediante la comparación de células que cubren el mismo número de microposts. Celular HuO9 aplicar más fuerza que las células M132. El número de células que cubren tres microposts HuO9 no es representativo y sólo se incluye para la integridad (barra de error = desviación estándar). (D) Las diferentes distribuciones a través de los números de microposts cubiertos demostrar que cada línea celular de cáncer de hueso tiene su propia característica extendiendo al interactuar con matrices micropost. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Suplementaria Figura 9. El tamaño de píxel para una configuración de microscopio se determina típicamente usando un portaobjetos de microscopio especial con una barra de escala en el mismo; alternativamente, el diseño conjunto micropost, propuesta por el fabricante puede ser utilizado. Por ejemplo, 15 unidades con 13 micras (195 micras de longitud total) dividido por 2.375 píxeles (establecidos con una herramienta de procesamiento de imágenes) conduce a 0.082 m / pxl. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Suplementaria Figura 10. Comparación de imágenes de una célula de cáncer de hueso HuO9 tomada desde la misma posición utilizando dos técnicas de iluminación en un microscopio invertido; los microposts DiO manchado son verde fluorescente. (A Modo de campo brillante. (B) analizó i MAGE tomada después de cambiar al canal de fluorescencia verde sin reenfoque.   Segunda imagen de fluorescencia después de corregir el enfoque de los consejos muy micropost (C). (D) de superposición de ambos canales de iluminación para fines ilustrativos solamente.   Indicadores (E) de mecanoterapia perfilado como los resultados de las tres imágenes. A pesar de la corrección del enfoque de la desviación máxima no puede estimarse a partir de las imágenes de fluorescencia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Fi Complementariogura 11. Secuencia de imágenes de la misma posición de microposts teñidas con fluorescencia utilizando Dil en un microscopio vertical imagen brillante de campo (A).; hay tres microposts se tocan en la punta. (B) La misma posición después de cambiar al canal fluorescente ligeramente por encima de las cabezas de los microposts. (C) La reducción del plano focal hasta la punta de los microposts. (DE) imágenes consecutivas después de bajar aún más el paso a paso de plano focal hacia abajo los microposts. (F) La imagen de los microposts después de bajar el plano focal dentro del sustrato de elastómero de silicona. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Suplementaria Figura 12. Captura de pantalla de la GUI MechProfiler. Resultado típico análisis de perfiles de una célula de cáncer de hueso HuO9. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

El autor principal (NG) es cofundador de MicroDuits GmbH, el proveedor comercial de las matrices de micropostes utilizadas en este estudio. Ningún otro autor tiene ningún conflicto de intereses potencial con este trabajo.