Artículo de método

Laser-captura microdisección de Human Prostática epitelio de Análisis de ARN

DOI:

10.3791/53405

⸱

26 de noviembre de 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, University of Illinois at Chicago, 2Department of Periodontics, University of Illinois at Chicago

En este artículo

Resumen

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El objetivo de este protocolo es utilizar la microdisección de captura láser como un método eficaz para aislar poblaciones puras de tipos celulares de tejidos prostáticos heterogéneos para el análisis de ARN posterior.

Resumen

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La glándula prostática contiene un entorno heterogéneo de tipos de células estromales, epiteliales, neuroendocrinas e inmunitarias. La próstata sana está compuesta por un estroma fibromuscular que rodea lúmenes secretores discretos con revestimiento epitelial y una población muy pequeña de células inmunitarias y neuroendocrinas. Por el contrario, las áreas de cáncer de próstata tienen un aumento del epitelio luminal displásico con una población estromal muy reducida o ausente. Dada la profunda diferencia entre los tipos de células estromales y epiteliales, es imperativo separar los tipos de células para cualquier tipo de análisis molecular posterior. A pesar de este conocimiento, la mayor parte de los estudios de expresión génica comparan la próstata benigna con el cáncer sin microdisección, lo que lleva a un sesgo estromal en las muestras benignas. La microdisección por captura láser (LCM) es un método eficaz para separar físicamente diferentes tipos de células de una sección de muestra. El objetivo de este protocolo es demostrar que el ARN puede aislarse con éxito del epitelio prostático humano recogido por LCM y utilizarse para estudios posteriores de expresión génica como RT-qPCR y RNAseq.

Introducción

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La glándula prostática es un tejido heterogéneo compuesto de epitelio secretor dispuestos en los acinos glandulares rodeado por estroma fibromuscular compuesto principalmente de músculo liso 1. El compartimiento epitelial está formado por cinco tipos de células diferentes, pero organizados: células basales, células secretoras, células neuroendocrinas, células de amplificación de tránsito y las células madre 2. En el cáncer de próstata (CaP), que surge de las células epiteliales luminales, el crecimiento de la adenocarcinoma provoca una disminución progresiva evidente del compartimiento del estroma 3. Por estas razones, las muestras de tejido tendrán claras diferencias en la proporción de estroma y el tipo de células epiteliales basado en la medida del CaP. Estas diferencias pueden conducir a suposiciones sesgadas de los datos de expresión de genes adquiridos de tejidos enteros sin tener en cuenta microdisección del tipo celular deseado. Por lo tanto, para eliminar este sesgo es esencial para separar los tipos de células antes de la extracción de RNA yanálisis de expresión génica.

Macrodissection o microdisección se pueden utilizar para separar físicamente las zonas epiteliales bien caracterizados desde el estroma circundante 4 -6. Macrodissection se realiza típicamente con una hoja de afeitar bajo un microscopio de disección y funciona bien para la separación de gran CaP nódulos de estroma, pero no es capaz de eliminar el epitelio benigno del estroma circundante (véase el ejemplo de la histología benigna de la próstata en la Figura 1). Microdisección con láser (LCM) es significativamente más mano de obra que macrodissection, pero puede diseccionar de forma muy precisa el epitelio benigno 4.

Publicaciones recientes de nuestro laboratorio han demostrado que el ARN se puede extraer con éxito por LCM ya sea de (FFPE) biopsias incluidas en parafina fijado en formol o tejido congelado 4,7-9. Los principales desafíos en la extracción de RNA son LCM-1) para diseccionar con precisión las áreas deseadas del tejido, y 2) para preservar RIntegridad NA durante el proceso de 4,10 LCM y el aislamiento. ARN aislado de poblaciones de células puras puede ser utilizado para el análisis de la expresión génica mediante varios métodos que incluyen transcripción inversa-PCR cuantitativa (RT-qPCR) 7,8, microarray 11, y profundo -sequencing 12-14.

El objetivo de este protocolo es aislar ARN total de epitelio prostático LCM de tejido congelado para análisis de aguas abajo de la expresión génica.

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Protocolo

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Todos los tejidos humanos utilizados para estos experimentos fueron adquiridas a través de un protocolo aprobado la Junta de Revisión Institucional y / o exención de la Universidad de Illinois en Chicago.

1. Sección fresco congelado de próstata en PEN-diapositiva y en Charged portaobjetos de vidrio

  1. El día anterior o unas horas antes de seccionar la muestra, limpie las herramientas (es decir, cepillo, fórceps, coplins, cuchillas, diapositivas enmarcadas-PEN (si no está ya RNasa libre), un marcador de ETOH seguro y un lápiz) y el interior de un criostato RT con una solución de RNasa descontaminar utilizando una botella de spray y de laboratorio-toallitas.
    1. Deje que la solución de RNasa descontaminar reposar por 5 minutos antes de limpiar de distancia, enjuague con DEPCH 2 0 para eliminar sobrantes solución y un enjuague final con EtOH al 70% (preparado con DEPCH 2 0) RNasa descontaminación.
      Nota: Es esencial para mantener un espacio de trabajo libre de RNasa. Todos coplins, herramientas, medios de montaje congelado, cuchillas y diapositivas utilizadas deben ser utilizados sólo para RNasa trabajo librey nunca se utiliza en un ambiente libre de norma no RNasa. Todos los instrumentos deben ser tratados con una solución de descontaminación RNasa antes de cada experimento.
  2. Enfriar criostato a -24 ° C.
  3. Coloque los siguientes instrumentos gratuitas RNasa limpiadas dentro criostato para enfriar al menos 30 minutos antes de seccionar: Diapositiva Coplin llena con etanol al 100%, las herramientas, las pequeñas cintas de tejido congelado y el mandril de montaje.
  4. Recuperar el tejido prostático congelado de almacenamiento criogénico y el lugar en un cubo de espuma lleno de hielo seco para el transporte. Coloque tejido en criostato equilibrar a criostato temperatura durante al menos 30 min.
    Nota: Los tejidos de la próstata humanos para láser captura micro-disección pueden ser fresco congelado o fijado en formol e incluido en parafina (FFPE). Las limitaciones de tiempo y la preparación de diapositivas son ligeramente diferentes entre las fuentes de tejido. Aquí se describen los pasos para secciones congeladas.
  5. Trabajar con un tejido a la vez, y vierta medio de montaje congelado en el Bottom de la casete y rápidamente montar el tejido de la próstata congelado en el medio de montaje congelado usando las pinzas refrigeradas.
  6. Coloque el casete con el tejido en enfriadores en criostato durante 5 min para establecer medio de montaje congelado.
  7. Aplique una pequeña cantidad de medio de montaje congelado en el plato y presione con cuidado el lado inferior del tejido montada arriba en el medio de montaje congelado. Deje reposar en el criostato durante 5 min para permitir que el medio de montaje congelado se solidifique por completo.
  8. Coloque tirada en el soporte y apriete.
  9. Bloquear el mango en la posición de bloqueo y coloque una nueva cuchilla en el criostato. Para los puntos finales moleculares aguas abajo que incluyen una etapa de amplificación (es decir, qPCR), es aconsejable utilizar una cuchilla nueva para cada paciente para evitar la contaminación (o mover la hoja de más de utilizar el área de la cuchilla para la siguiente muestra).
  10. Desbloquear el mango y avanzar cuidadosamente el tejido a mano o con un pedal de pie para igualar y exponer el tejido con 50 μm secciones hasta que la exposición de tejido deseado es alcanzado.
  11. Ajuste criostato a 5 micras, cortar una o dos secciones y colocarlos en portaobjetos de vidrio cobrado por hematoxilina y eosina (H & E) tinción (ver paso 2).
  12. Coloque inmediatamente la diapositiva en el etanol frío al 100% durante 2 min.
  13. Retire la lámina de vidrio cargada de etanol y dejar secar a temperatura ambiente antes de proceder a la tinción de H & E (Paso 2).
  14. Coloque RT diapositivas PEN-marco en un partidario marco.
  15. Ajuste criostato a 10 secciones micras y lugar en las diapositivas de marco RT PEN. Uno a cuatro secciones pueden ser lugar en cada diapositiva dependiendo del tamaño del tejido.
  16. Sumergirse inmediatamente la diapositiva en el etanol frío al 100% durante 2 min.
  17. Retire las diapositivas PEN-frame a partir de etanol y almacenar el portaobjetos en una caja de portaobjetos en una caja en un desecador de -80 ° C congelador hasta el momento de LCM. Tres días es el tiempo máximo de almacenamiento para una recuperación óptima de ARN.
  18. Continúe con el Paso 2 por sólo el vidrio cargada deslizómi. Continúe con el Paso 3 para diapositivas PEN-marco.

2. hematoxilina y eosina-Y (H & E) de la mancha para histológico Mark-up

Nota: Esto si por el tejido en el portaobjetos de vidrio cargada y no la diapositiva PEN-marco para LCM.

  1. Hidratar las secciones sobre el portaobjetos de vidrio cargada de inmersión la corredera a través de etanol clasificado como sigue: sumergir el portaobjetos dos veces en etanol al 100% durante 3 min, dos veces en etanol al 95% durante 3 min, una vez en etanol al 70% durante 3 min y dos veces en H2O destilada durante 3 min.
    1. Preparar la solución de alcohol de ácido: 99 ml 70% de etanol + 1 ml 1% de HCl y una solución de bicarbonato de sodio 0,1%: 0,1 g de bicarbonato sódico en 100 ml H 2 O destilada
  2. Sumerja el portaobjetos en hematoxilina Gill II (0,4%) durante 5 minutos.
  3. Lavar el exceso de manchas en constante grifo abierto H 2 O durante 3 min.
  4. Sumerja la diapositiva 10 veces en ácido alcohol
  5. Lave la diapositiva en el funcionamiento del grifo H2O durante 3 min.
  6. Sumerja el portaobjetosen una solución de bicarbonato de sodio al 0,1% durante 30 a 60 segundos para encender el color morado a azul.
  7. Lave la diapositiva en el funcionamiento del grifo H2O durante 3 min.
  8. Enjuague el portaobjetos en etanol al 95%, con 10 inmersiones.
  9. Sumerja el portaobjetos en tiempos Eosina-Y 2-3 durante 15 segundos totales.
  10. Deshidratar el portaobjetos a través de etanol clasificado como sigue: sumergir el portaobjetos dos veces en etanol al 95%, dos veces en etanol al 100%, y dos veces en xileno (asegúrese de que el tejido parece claro que indica la deshidratación a fondo).
  11. Montar la diapositiva con no acuoso dura medio de montaje y la cubierta antideslizante permanente.
  12. Deje que el portaobjetos seco durante 30 minutos.
  13. Diapositiva Scan con cualquier escáner de diapositivas entera e imprimir una imagen de gran tamaño, de alta resolución en 8 "x 11" de papel.
  14. Áreas Esquema de interés (generalmente realizadas por un patólogo certificado por el consejo) con un marcador. Este marcado es la guía para el procedimiento de LCM.

3. toluidina azul tinción de diapositivas PEN-frame

Nota: Jes que se hace el mismo día de la LCM. Utilice DEPCH 2 O el agua para todas las soluciones. Completar todos los pasos en la zona libre de RNasa. Todos los coplins deben ser limpiados con una solución de RNasa descontaminar.

  1. El día de LCM eliminar las diapositivas PEN-marco de -80 ° C congelador y de hidratos de diapositivas que sumergen suavemente en el 90% de EtOH durante 2 minutos y luego 75% EtOH durante 2 min.
    1. Preparar 0,5% de azul de toluidina por disolución en agua de calidad para biología molecular luego filtrar esterilizar a través de un filtro de 0,2 micras y almacenar a TA. Esta solución puede ser reutilizado para hasta 6 meses. Nota: Es muy recomendable para preparar la solución antes de que la filtración puede tomar unos pocos horas.
  2. Manchar el tejido de la próstata mediante inmersión suavemente diapositivas en 0,5% de azul de toluidina para 5 a 30 seg. Destain el tejido se desliza por lavado 2 veces en DEPCH 2 O durante 15 segundos seguido de 75% de EtOH durante 30 segundos a 3 min. Nota: las manchas y destain veces se pueden ajustar para asegurar una buena tinción. Próstata tiende a más de mancha.
  3. Transferencia de diapositivas PEN-marco para recipiente seco ARNasa libre de hielo.

4. láser captura micro-disección (LCM)

  1. Inmediatamente antes de la LCM, tobogán seco en un calentador de portaobjetos a 42 ° C durante 15 min. Seco sólo la diapositiva que se procesa y almacena el resto en hielo hasta que esté listo para ellos.
  2. Encienda el LCM y el ordenador en este orden, el poder del microscopio, la clave de láser, el interruptor láser y luego la computadora. Inicie el software Láser microdisección.
  3. Utilice el software para controlar el microscopio para cargar los toboganes y tubos de recolección. Haga clic en "soporte de muestra de descarga", cargue la diapositiva con las secciones en el soporte de portaobjetos de microscopio con el tejido hacia abajo e inserte el soporte de diapositivas en la ranura correspondiente en el microscopio, a continuación, haga clic en "Continuar".
    1. Haga clic en "tubos de recogida de descarga", etiqueta y cargar 0,5 ml tubos en soporte de tubo y la inserta en la ranura correspondiente en el instrumento. Una veztapas están asegurados, añadir 35 l de tampón de lisis a las tapas de recolección y tratar de evitar burbujas. Luego haga clic en "Aceptar".
      Nota: Si la evaporación es un problema, diluir el tampón de la siguiente manera: tampón de lisis 25 l con 10 l depcH2O.
  4. En el software, seleccione la posición en la diapositiva se ha colocado en el soporte de diapositivas. Seleccione la tapa de recogida para recoger la muestra de LCM.
  5. Visualice y enfocar la diapositiva a través del ordenador a 10X. Utilice el software para calibrar el láser mediante la selección de "láser" y luego "calibrar". Ajustar la potencia, apertura y la velocidad del láser, la selección de "láser" y luego "control" para permitir que el rayo láser para cortar la zona seleccionada por completo y de manera eficiente. Repita los ajustes hasta que el láser corta completamente a través del tejido.
  6. Utilizando el margen de ganancia patólogo 8 "x 11" como guía, utilice la herramienta de "llamar la forma de" circunscribir las áreas deseadas de epitheLium en la vista y evitar recoger cualquier estroma.
    Nota: Las zonas Se pueden seleccionar varios dentro de un punto de vista, pero no se mueven a otra vista sin antes cortar haciendo clic en la herramienta "cortar la forma".
    1. Si un área no quede completamente aislada por el láser utilizar la función "mover y cortar" para repasar de forma manual. Continuar mover el objetivo a nuevos puntos de vista y repetir el corte por láser hasta corredera está completamente disecado o la cantidad deseada de tejido que se ha recogido (típicamente 100 glándulas benignas producen de 150-500 ng de ARN). (véase el ejemplo en la figura 1A).
  7. Retire con cuidado los tubos de la titular de la recolección y cerrar las tapas, siendo consciente del tampón de lisis y tejidos en las tapas. Centrifugar brevemente durante 30 segundos para recoger el líquido y el tejido en la parte inferior del tubo. Incubar las muestras a 42 ° C durante 30 minutos y se almacena a -80 ° C hasta que esté listo para el aislamiento de ARN.

5. Aislamiento de ARN total con un FilKit basado en ter y Análisis de la Calidad

  1. Descongelar los tubos en hielo y llevar el volumen de la solución a 100 l.
  2. Pre-humedecer el filtro de micro de un kit de aislamiento de ARN mediante la aplicación de 30 l Solución ofLysis al centro del filtro y déjelo en remojo whileperforming los dos pasos siguientes (al menos 5 min).
  3. Añadir 3 l de solución de LCM Aditivo (proporcionado en el kit) al lisado y mezclar mediante agitación durante 5 s. Centrifugar durante 30 segundos para recoger el fluido en la parte inferior del tubo.
  4. Centrifugar el filtro pre-humedecida por unos 30 segundos a máxima velocidad para eliminar el líquido.
  5. Añadir 1,25 volúmenes (en este caso 129 l) de etanol al 100% a la mezcla de lisado, suavemente vórtice o una pipeta de arriba abajo. ** Este método se recuperará ambas especies de ARN grandes y pequeñas.
  6. Cargar la muestra sobre el filtro micro-pre mojada, y se centrifuga a 10.000 xg durante 1 min para unir el ARN al filtro. A continuación, lavar micro filtro con 180 l de "solución de lavado 1, R21; centrifugar a 10.000 xg durante 1 min.
    Nota: A partir de ahora todas las centrifugaciones se debe hacer a 13.000 xg, o la velocidad máxima.
  7. Filtro de lavado dos veces con 180 l de "soluciones de lavado 2 y 3", respectivamente según las indicaciones del protocolo del kit. Centrifugar durante 30 segundos, a continuación, se descarta el flujo a través, y girar el filtro durante 1 min para eliminar el líquido residual y para secar el filtro.
  8. Transferencia del filtro a un nuevo tubo de recogida.
  9. Caliente la solución de elución a -95 ° C (suministrado con el kit).
  10. Aplicar 10 l de solución de elución precalentado al centro del filtro, cerrar la tapa y almacenar durante 5 min a RT. Centrifugar a continuación durante 1 min para eluir el ARN, y repetir este paso una vez para dar ~ 20 l de ARN.
  11. Realizar el tratamiento DNasa I durante 15 minutos a 37 ° C.
  12. Cuantificar el ARN mediante el espectrofotómetro con la absorbancia a 260 nm. La relación de la densidad óptica a longitudes de onda de 260 nm y 280 nm se utiliza para evaluar la pureza deel ARN (ver Tabla 1) 15.

Análisis de Expresión Génica 6.

Nota: La expresión de genes de especies de ARN largos (como los ARNm y lncRNAs) se muestra en el paso 6.1 y especies de ARN cortas (como microRNAs) se muestra en el paso 6.2. Diferentes kits están disponibles para RT-qPCR y la cantidad de ARN requerido varía según el kit (tan poco como 10 ng). Análisis de secuenciación de ARN se describe en 6.3.

  1. Transcribir inversa (RT) del RNA a cDNA mezclando 5 l de 20 ng / l de muestra de ARN con 5 l de la mezcla maestra RT (tampón RT, dNTPs, cebadores aleatorios, enzima RT, inhibidor de RNasa). Se incuba la reacción durante 25 min a 25 ° C, a continuación, 120 min a 37 ° C y 5 min a 85 ° C.
  2. Se diluye la reacción RT 1:10 con RNasa libre de agua y el uso de 2,5 l por 10 l de reacción qPCR con cebadores o conjuntos de cebadores / sondas para los genes de interés.
    Nota: Para facilitar el análisis de ARN parcialmente degradado Es aconsejable el uso de cebadores for amplicones más cortos (menos de 100 bp) 16. (Tabla 2B)
    1. Para el análisis de la expresión de microARN ejecutar la reacción de RT mezclando 5 l de 2-10 ng / l muestra de ARN con 5 l de la mezcla maestra RT.
      Nota: cada tecnología de detección de microRNA disponible comercialmente basado en la PCR requiere el uso de cebadores de RT de propiedad y específicas.
  3. Alternativamente o además de RT-PCR, utilizar la secuenciación de próxima generación (RNA-Seq o pequeño-RNA-Seq) para cuantificar las diferentes especies de ARN. Típicamente, utilice 500 ng de ARN para este procedimiento (Tabla 3) y llevar a cabo el método como se indica por el instrumento fabricante y detección.

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Resultados

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En un estudio previo se demostró el uso de LCM para recoger tejidos epiteliales y del estroma de comparar los perfiles de expresión por RT-qPCR de mRNA y microRNA de los tejidos de la próstata congelados y FFPE del mismo paciente 4. LCM es mucho tiempo, sobre todo si gran cantidad de ARN se percibirá para el análisis de secuenciación de próxima generación. Por lo tanto, es crucial para mantener el espacio de trabajo y las herramientas de RNasa libre. Se recomienda examinar los controles de calidad y célula-es...

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Discusión

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Perfiles de expresión génica de muestras humanas puede ser un reto, no sólo por la calidad o cantidad de tejido disponible, sino también por las diversas entidades histológicas presentes en una muestra de tejido dado. Esto es particularmente difícil en la próstata en el que los tejidos benignos son en gran parte los tejidos del estroma y áreas de cáncer están desprovistos de estroma. LCM facilita la separación física de estroma prostático y ARN epitelio para una firma más precisa de los dos tipos diferentes de células <...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos a la Dra. Vicky Macias, Angeline Giangreco y Avani Vaishnav por su ayuda en la optimización de esta metodología a lo largo de los años y a Yang Zhang y al Dr. Jian Ma de la Universidad de Illinois en Urbana-Champaign por el análisis de secuenciación de ARN. Este trabajo fue financiado por NIH/NCI R01 CA166588-01 (Nonn), American Cancer Society Research Scholar 124264-RSG-13-012-01-CNE (Nonn), NIH/NCI R03 CA172827-01 (Nonn), DOD-CDMPR PRCP Health Disparities Idea Award PC121923 (Nonn) y una subvención de la Prevent Cancer Foundation (Zhou).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
RNasa-AWAY MBP7005-11
PEN-membrana 4,0 mm correderas Portaobjetos Leica11600289
Glass, Superfrost PlusFisherBrand12-550-15
Ethanol 200 proofDecon labs.2701
DEPC (pirocarbonato de dietilo)SigmaD-5758
CryostatLeicaCM3050
Coplins (Frasco de tinción)IHCWORLDM900-12
Coplins (Gradilla de tinción)IHCWORLDM905-12
Aperio ScanScopeAperio(Leica)ScanScope®
Toluidina AzulFluka89640-5G
Sistema de Microdisección LáserLeicaLMD7000
0,5 ml Tubos de pared delgada para LCMThermo ScientificAB-0350
ARNacuoso®-Micro Kit de aislamiento de ARN totalAmbionAM1931Thermo Fisher Scientific
Marca NanoDropThermo ScientificND-1000
Qubit 2.0 FluorímetroLife TechnologiesQ32866Thermo Fisher Scientific
Brand Kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidadApplied Biosystems4368814Thermo Fisher Scientific Brand
Kit universal de síntesis de ADNc II, 8-64 rxnsExiqon203301
TaqMan microRNA RT kitApplied Biosystems4366597Tinción de hematoxilina de la marca Thermo Fisher
Scientific Ricca Chemical Company3536-16
Eosin-YRichard Allan Scientific 7111
CS

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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