Este método evalúa la invasión de células cancerosas desde esferoides a una matriz 3D circundante. Los esferoides se generan mediante el método de cultivo de gota colgante y luego se incrustan en una matriz compuesta por materiales de membrana basal y colágeno tipo I. Posteriormente, se monitorea la invasión de los esferoides.
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Artículo de método
Un Cancer Cell esferoide Ensayo para evaluar la invasión en un entorno 3D
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Resumen
Resumen
Se cree que la naturaleza invasiva de las líneas celulares cancerosas se correlaciona con su potencial metastásico. Sin embargo, la mayoría de los ensayos tradicionales no examinan estas características invasivas en un entorno tridimensional y los datos resultantes sufren de una aplicabilidad biológica reducida. Aquí se presenta un enfoque para visualizar la capacidad invasiva de las líneas celulares en un entorno fisiológicamente relevante. El ensayo de invasión de esferoides de células cancerosas primero utiliza la gravedad para generar esferoides dentro de gotas de medio que cuelgan de la tapa de una placa de cultivo celular. A continuación, estos esferoides se incrustan en una matriz 3D que consiste en una mezcla de materiales de la membrana basal y colágeno tipo I. La salida de las células cancerosas de los esferoides a la matriz circundante se monitorea a lo largo del tiempo. El método descrito aquí puede modificarse para examinar la invasión después del cocultivo de diferentes tipos de células, la inclusión de fármacos/inhibidores o alteraciones en los constituyentes de la matriz extracelular (MEC).
Introducción
Se establece que la motilidad de células de cáncer es predictivo de potencial metastásico, dado que tal comportamiento facilita la invasión a través de la membrana basal y la entrada en el sistema circulatorio 1. Mayoría de las investigaciones sobre la motilidad se ha centrado en cómo las células se comportan en un entorno de dos dimensiones (2D), a pesar de que se está ampliamente reconocido que el movimiento de las células en una matriz (3D) tridimensional es más representativo de cómo estas mismas células en realidad comportarse 2 in vivo. Sistemas de cultivo en 3D se utilizan cada vez más para estudiar comportamientos celulares que van desde la morfología celular, a la cinética de crecimiento y la sensibilidad de drogas 3. El deseo de supervisar la invasión de células de cáncer dentro del contexto de un entorno 3D ha llevado a la síntesis de las técnicas previamente establecidas que implican la generación de agregados de células 3D (esferoides) a través del método de cultivo gota colgante 4, seguido por la incorporación de estos esferoides en un extracelular 3D matriz (ECM) compuesto de colágeno y de la membrana basal materiales 5. Este método tiene por objeto mejorar en estas técnicas establecidas anteriormente proporcionando un método simplificado que se puede utilizar fácilmente para comparar invasión bajo una variedad de condiciones experimentales.
Más formas tradicionales para evaluar la motilidad celular in vitro son el ensayo de rayado de la herida y el ensayo transwell 6. El primero representa ensayo de la motilidad celular en un entorno 2D, y es por lo tanto independiente de una variedad de características críticas para la invasión in vivo, por ejemplo, actividad de la proteasa 7. El ensayo transwell puede invasión de células modelo mejor cuando los insertos así se recubren con sustratos de ECM, pero sólo un único parámetro, es decir, la aparición de células en la superficie de la membrana opuesta se mide, y muchos matices de la invasión de células por lo tanto no son fácilmente observables. En contraste con estas técnicas, el ensayo de invasión de esferoides de células del cáncer (Figura 1 </ strong>) permite la monitorización en tiempo real de la invasión de células en un entorno que no sólo es fisiológicamente relevante, sino que también permite que las características de la línea específica de células importantes para ser visualizados, como la migración de células individuales vs. colectiva 8. Este método también ofrece ventajas sobre los ensayos de crecimiento de cultivo 3D estándar. La generación de agregados celulares a través del método de la gota colgando limita inicialmente el movimiento celular, por lo que las células serán incentivados para invadir después de que se levantó esta restricción. Además, una vez que se levanta restricción, la salida de células procederá en una dirección uniforme que luego pueden ser convenientemente cuantificó.
Los materiales de ECM más populares utilizados para esferoides ensayos de células del cáncer son Matrigel y colágeno tipo I, en donde cada uno de estos componentes tiene un papel importante y distintas en influir en el comportamiento metastásico. Matrigel es una mezcla secreta de las proteínas producidas por las células del sarcoma Engelbreth-Holm Swarm ratón, y se enriquece en sótano ocupandoproteínas de membrana nt como laminina, entactina, y el colágeno tipo IV 9. Por esta razón Matrigel se denomina de aquí en adelante como "materiales de la membrana basal." Estos materiales proporcionan ligandos de la membrana basal esenciales necesarios para integrina adherencia durante la invasión de células de cáncer 10, además de muchas otras proteínas que ejercen una variedad de efectos sobre el comportamiento celular 11. En comparación, el colágeno tipo I, comúnmente preparada a partir de las digestiones ácidas de tendones y otras estructuras colágenas densas 12, es un material de matriz mucho más simple que sirve como un elemento estructural importante de los tejidos tejidos y estroma de sostén conectivos y órganos del cuerpo. Se ha demostrado que las características físicas de colágeno pueden regular una serie de características de la motilidad celular; por ejemplo, la alineación de las fibrillas de colágeno en la interfase tumor estromal permite las células cancerosas para migrar posteriormente a lo largo de las fibrillas al invadir el estroma 13 en. En el ensayo que aquí se presenta, tanto colágeno tipo I y los materiales de la membrana basal se utilizan como herramientas para estudiar el cáncer 3D interacciones célula-estroma.
El efecto de la inhibición o estimulación de las vías que controlan la invasión se puede controlar después de que las células se han incrustado en la matriz 3D. Las células pueden ser pretratadas durante el crecimiento en las gotas colgantes o después de la transferencia a la cultura 3D, dependiendo de si se requiere un tratamiento prolongado para modular la invasión. Para los tratamientos más cortos, se recomienda que el fármaco se mezcla con la suspensión esferoide después de la recogida, así como los medios de comunicación que rodeará los cultivos 3D, para facilitar la exposición adecuada al fármaco a las células. A continuación, las células normales o asociados a tumores estromales se pueden mezclar con el material de matriz para evaluar su papel en la modulación de invasión de células tumorales, o para determinar cómo el comportamiento celular influencias de señalización paracrina y autocrina. Esta idea se demostró en un estudio en el que el co-cultivo de la colsobre el cáncer y las células endoteliales en gotas colgantes conducido a una red vascular dentro de los esferoides 14. Finalmente, los componentes de ECM también pueden ser alterados, como la invasión de células de cáncer se ve afectado por diferentes sustratos 15. El método presentado a continuación será por lo tanto proporcionar un marco para evaluar la invasión de células de cáncer bajo una variedad de condiciones. En general se encontró que no todas las líneas celulares crearán esferoides en las gotas colgantes y líneas de células epiteliales de aspecto típicamente formar esferas regulares.
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Protocolo
1. Generación de esferoides
- Preparar la suspensión de una sola célula para colgar culturas gota a separar los cultivos de células adherentes cáncer de ~ 70% de confluencia usando un lavado con PBS seguido de exposición a solución de tripsina-EDTA 0,05%.
- Neutralizar la solución de tripsina con medio de cultivo celular y contar las células usando una parte alícuota de la suspensión celular. Nota: El medio de cultivo celular específica dependerá de la línea celular se está probando. Siga ATCC recomendaciones de los medios, donde el medio de cultivo celular es típicamente DMEM + 10% FBS. Más información se puede encontrar en la Tabla de Materiales.
- Realizar una dilución para permitir la siembra de 500-1.000 células por 20 l gota de medio de cultivo celular.
- Adquirir placa de 10 cm y añadir 5 ml de PBS estéril hasta el fondo. Nota: Este paso protege el ahorcamiento cae de evaporación. Bajo costo "grado bacteriológicos" platos puede ser usado en lugar de platos de grado de cultivo de células, como las células no lo hará contactuar de la superficie de cultivo.
- Usar una pipeta multicanal para transferir 20 l gotitas de la suspensión celular diluida a la superficie interior de la tapa.
- Pipetear 40 gotas (5 filas de 8 gotas) en la tapa de la placa de 10 cm.
- Invierta la tapa y colocar en la placa de cultivo. Incubar los cultivos gota colgante a 37 ° C durante 72 horas para generar esferoides.
- Voltear la tapa de una manera segura, pero controlada. Nota: La inversión de la tapa demasiado rápido o demasiado lento puede hacer que las gotas se desplacen. Algunas líneas de células pueden formar esferoides en 48 horas o menos, mientras que otros pueden requerir más de 72 horas para producir agregados compactos.
2. Incorporación de esferoides en Matrix 3D
- Descongelar una alícuota del sótano materiales de membrana del factor de crecimiento reducido a 4 ° C durante la noche antes de la incorporación de los esferoides.
- Opcional: pozos de capa con ECM de antelación para evitar posibles interacciones esferoide con la cultu tejidovolver a emerger.
- Pipeta 200 l de ECM por pocillo en una placa de 24 pocillos.
- Inclinar la placa para asegurarse de que el ECM cubre toda la superficie del pocillo.
- Eliminar cuidadosamente el exceso de ECM con una pipeta.
- Incubar la placa hasta que los pocillos están secos: 3 hr a temperatura ambiente o durante la noche a 4 ° C.
- Opcional: pozos de capa con ECM de antelación para evitar posibles interacciones esferoide con la cultu tejidovolver a emerger.
- Recoger los esferoides por la inclinación de la tapa de la placa de cultivo tisular y puesta en común de los medios de comunicación. La transferencia de los medios de comunicación con los esferoides en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
- Permitir 10 min para los esferoides para ubicarse en la parte inferior del tubo de microcentrífuga. Esferoides deben ser visibles a simple vista.
- Mezclar 100 l de los materiales de la membrana del sótano con 100 l de frío (4 ° C) de colágeno tipo I en un tubo de pre-enfriado por separado. Mantenga la mezcla a 4 ° C para prevenir ya sea en gel se solidifique antes de tiempo.
- Utilice puntas de pipeta pre-refrigerados si la transferencia de pequeños volúmenes.
- Dar cuidado almezclar el material de la membrana basal y el colágeno de tipo I, que impiden la formación de burbujas de aire. Nota: Las burbujas de aire pueden obstaculizar las imágenes más tarde en el protocolo si se incrustan en el gel.
- Aspirar los esferoides de la porción inferior 40 l de la tubo de microcentrífuga, y se combinan con el material de la membrana basal / colágeno tipo I mezcla. Tenga cuidado para evitar la formación de burbujas de aire cuando la mezcla. Nota: La solución que contiene de 100 l material de la membrana basal, 100 colágeno tipo l I, y 40 l de los esferoides crearé material suficiente para 4 culturas 3D independientes. Esto se puede escalar hacia arriba o hacia abajo.
- Pipetear 40 mu l gotas de la mezcla viscosa en los centros de los pozos en una placa de 24 pocillos. Mantenga el nivel de placa para evitar que la mezcla se ejecuta en el lado del pozo. Nota: Una sola columna de la placa de 24 pocillos - se recomienda para cada condición a ensayar - 4 pozos.
- Coloque la placa de intOA 37 ° C incubadora y dejar en reposo durante 30 min. La cultura 3D polimeriza durante este período.
- Lentamente sumergir las culturas 3D en 1 ml de medio de cultivo celular.
- Asegúrese de que los medios de comunicación es cálido al agregar que en los pocillos para promover aún más la polimerización del gel.
- PASO CRÍTICO: añadir con cuidado los medios de comunicación a las culturas 3D. Pipetear los medios de comunicación demasiado rápido en los pocillos puede dar lugar a la separación de las culturas 3D a partir de la superficie de cultivo de tejidos.
3. Seguimiento y análisis de esferoide Invasion
- Invasión de la imagen de los esferoides en la matriz 3D que rodea a los puntos de tiempo decidido por el investigador. Adquirir fotografías utilizando un microscopio invertido con la lente de objetivo de 20x. Nota: Los puntos de tiempo Ideal serán diferentes dependiendo de la línea celular que se está probando. Líneas celulares más invasivos comenzarán su egreso de los esferoides, poco después de la siembra y, por tanto, tomar fotografía inicials dentro de un par de horas después de la siembra. Generalmente, las fotografías se toman a 0 h (después de la siembra), las 24 horas, y 48 horas. Invasión normalmente concluye 24 a 48 horas después de la siembra.
- Cuantificar la capacidad invasiva utilizando el software de análisis de imagen como imagen J.
- Analizar la invasión como la distancia celular desde el borde del esferoide.
- Utilice la herramienta Draw recta para marcar el radio y / o la distancia invasivo máxima.
- Haga clic en "Analizar" en el menú superior y haga clic en "Medir" para mostrar la medición de longitud.
- Analizar la invasión como la zona invasivo totales fuera del esferoide.
- Utilice la herramienta de dibujo a mano alzada para trazar la frontera del esferoide y / o área invasivo totales.
- Haga clic en "Analizar" en el menú superior y haga clic en "Medir" para mostrar la medición de área.
- Use un plugin como herramientas del Administrador de retorno de la inversión para crear mediciones para una pila de imágenes.
- Analizar la invasión como la distancia celular desde el borde del esferoide.
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Resultados
Usando el ensayo de invasión esferoide (Figura 1), un panel de líneas celulares de cáncer se ensayó para determinar su capacidad para formar esferoides, así como para la cantidad de egreso celular exhibido después de la implantación en una matriz 3D que consiste en materiales membrana basal y colágeno tipo I (Tabla 1). Estos resultados demuestran que no todas las línea celular de cáncer creará esferoides bien formadas, donde las líneas celulares que poseen una morfología epitelial i...
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Discusión
Este estudio evaluó el rendimiento de un panel de líneas celulares de cáncer en un ensayo de invasión esferoide (Tabla 1). En general, nos encontramos con que la formación de esferoides es mayor en los más líneas de células epiteliales de aspecto, donde la presencia de uniones célula-célula promueve la formación de una arquitectura esferoide similar. Líneas celulares conocidos que se han sometido a una transición epitelial-mesenquimal, como MDA-MB-231 células no forman esferoides en el cultivo gota colg...
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.
Agradecimientos
Apoyado por el NIH subvenciones CA051008 P30 y T32 CA009686 (ATR).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Matrigel Factor de Crecimiento Reducido | Corning | CB-40234 | |
| Colágeno Tipo I, Cola de Rata, 100 mg | Millipore | 08-115 | |
| DMEM | Life Technologies | 11995-065 | |
| RPMI 1640 Medio | Life Technologies | 11875-093 | |
| PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
| 0.05% Tripsina-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| Suero Fetal Bovino, Inactivado por Calor | Omega Scientific | FB-12 | |
| 100 mm Platos tratados con TC | Corning Incorporated | 430167 | |
| placas tratadas con TC de 24 pocillos | NEST | 702001 | |
| Microscopio | |||
| mantuvieron en DMEM + 10% FBS, con la expectativa de células BT-474 y LNCaP, que se mantuvieron en RPMI + 10% FBS. |
Referencias
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