Artículo de método

El aislamiento físico de endosporas de muestras ambientales por Targeted lisis de las células vegetativas

DOI:

10.3791/53411

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21 de enero de 2016

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1Department of Biological Sciences, Macquarie University, 2Vital-IT group, Swiss Institute of Bioinformatics, 3Laboratory of Microbiology, University of Neuchatel

En este artículo

Resumen

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Se desarrolló un método para identificar endosporas bacterianas de comunidades microbianas complejas para realizar estudios moleculares o de cultivo personalizados de este grupo de bacterias.

Resumen

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La formación de endosporas es una estrategia de supervivencia encontrada entre algunas bacterias del filo Firmicutes. Durante la formación de las endosporas, estas bacterias entran en un estado de reposo morfofisiológico que mejora la supervivencia en condiciones ambientales adversas. A pesar de que las Firmicutes formadoras de endosporas son uno de los grupos bacterianos más frecuentemente enriquecidos y aislados en los estudios de cultivo, a menudo están ausentes de los estudios de diversidad basados en métodos moleculares. La resistencia del núcleo de esporas se considera uno de los factores que limitan la recuperación de ADN de las endosporas. Desarrollamos un método que aprovecha la mayor resistencia de las endosporas para separarlas de otras células en una comunidad microbiana compleja utilizando métodos de lisis física, enzimática y química. La preparación solo para endosporas así obtenida se puede utilizar para el recultivo o para realizar análisis posteriores, como la extracción de ADN personalizada optimizada para endosporas y la posterior secuenciación de ADN. Este método, aplicado a muestras de sedimentos, ha permitido el enriquecimiento de las endosporas y, tras la secuenciación, ha revelado una gran diversidad de formadores de endosporas en los sedimentos de los lagos de agua dulce. Esperamos que la aplicación de este método a otras muestras arroje un resultado similar.

Introducción

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El objetivo de este trabajo es proporcionar un protocolo para la separación de las endosporas bacterianas a partir de células bacterianas vegetativas en muestras ambientales. La formación de endosporas bacterianas es una estrategia de supervivencia, por lo general desencadenada por la inanición, que se encuentra en una serie de grupos de bacterias pertenecientes a la phylum Firmicutes 1. Bacterias que forman endosporas están bien estudiados, principalmente debido a que un número de cepas son patógenos y, por tanto, de importancia médica (por ejemplo, Bacillus anthracis o Clostridium difficile). Cepas ambientales de bacterias formadoras de endosporas se han aislado de prácticamente cualquier entorno (suelo, agua, los sedimentos, el aire, hielo, intestino humano, animales intestino, y más) 1-3. Por lo tanto, Firmicutes son el segundo phylum más abundante en las colecciones de cultivos 4.

Debido a sus proteínas de la corteza externa y el núcleo de protección resistentes, endosporas pueden sobrevivir en condiciones ambientales extremas que van from desecación de alta radiación, temperaturas extremas y sustancias químicas nocivas 5. Este notable resistencia hace que sea un reto para extraer el ADN de las endosporas 6-8. Esto probablemente explica por qué se les ha pasado por alto en los estudios de secuenciación del medio ambiente 9,10. Otros métodos, tales como la orientación de endosporas en muestras ambientales por anticuerpos fluorescentes 11, la cuantificación de ácido dipicolínico (DPA) en el suelo 12 y el sedimento 13, citometría de flujo 14 o pasteurización y posterior cultivo de 15,16 se han utilizado para recuperar o cuantificar en endosporas muestras ambientales. En los últimos años, los métodos de extracción de ADN optimizada, así como cebadores moleculares específicos a secuencias diana de genes-endosporas específica se han desarrollado 10,17-20. Esto ha ayudado a revelar más biodiversidad en este grupo de bacterias 21 y también ha dado lugar a aplicaciones en la industria y la medicina para la detección de endosporas, Por ejemplo en la leche en polvo 19.

El protocolo que aquí se presenta se basa en la diferencia de resistencia a las condiciones físico-químicas nocivas (como el calor y detergentes) de endosporas bacterianas en relación con las células vegetativas. Para destruir las células vegetativas en una muestra, que consecutivamente aplicar calor, lisozima y bajas concentraciones de detergentes. El tiempo y la fuerza de estos tratamientos han sido optimizados a fin de no destruir las esporas, pero para lisar todas las células vegetativas. Algunas células en una piscina de células del medio ambiente son más resistentes que otros, por lo que con el fin de aumentar la probabilidad de destruir todas las células vegetativas, se aplican tres tratamientos diferentes. La ventaja y novedad de este método es que las endosporas después del tratamiento están todavía intactos y pueden ser utilizados para otros análisis aguas abajo. Estos incluyen la extracción de ADN, PCR cuantitativa (qPCR) y amplificación o secuenciación metagenómica (dirigido específicamente al grupo de endosporas y por lo tanto la reducción dIVERSIDAD, al tiempo que aumenta la cobertura). Las endosporas también podrían utilizarse para el cultivo de aguas abajo o cuantificación por microscopía de fluorescencia, citometría de flujo, o detección de DPA. Una característica importante de este método es que mediante la comparación de una muestra no tratada con una muestra tratada, se puede deducir la cantidad y diversidad de endosporas en una muestra ambiental, además de la componente correspondiente a las células vegetativas.

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Protocolo

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1. Preparación de los productos químicos y equipo

  1. Hacer 500 ml de una hexametafosfato de sodio 1% (SHMP) (NaPO3) n solución y esterilizar en autoclave.
  2. Esterilizar nitrocelulosa (NC) Filtros (tamaño de poro de 0,22 m, diámetro 47 mm) por autoclave en platos de cristal cerrado Petri.
  3. Esterilizar filtros NC (tamaño de poro de 0,22 m, 25 mm de diámetro) en autoclave en platos de vidrio cerrado de Petri.
  4. Pesar y anotar el peso en vacío de 50 ml tubos estériles (con tope a) (un tubo por muestra).
  5. Preparar Tris-EDTA-buffer (tampón TE) 1x: hacer una solución de Tris 10 mM (tris (hidroximetil) aminometano) y EDTA 1 mM tampón. Ajustar el pH a 8 y esterilizar en autoclave.
  6. Preparar la solución de lisozima (20 mg / ml) disolviendo 0,02 g de lisozima en 1 ml de tampón TE. Lo ideal es hacer fresco cada vez. Almacenar a 4 ° C durante no más de 1 semana.
  7. Preparar la solución fisiológica disolviendo / L de cloruro de sodio 8 g(NaCl) en agua destilada. Esterilizar en autoclave.

2. Separación de la biomasa a partir de sedimentos

  1. Añadir 3 g de muestra de sedimento de tarados estéril tubos de 50 ml utilizando cucharas de metal con etanol flameado. Realice esto en una, UV esterilizada gabinete de bioseguridad limpia para evitar la contaminación.
  2. Añadir 15 ml de una solución SHMP 1% estéril (autoclave) a la muestra usando una bureta graduada estéril. La solución SHMP también puede ser filtrada para evitar la contaminación.
  3. Homogeneizar el sedimento y la solución SHMP con un dispersor líquido / homogeneizador (por ejemplo, homogeneizador Ultra-Turrax). 70% de etanol-esterilizar en autoclave o el rotor de dispersión antes de su uso. Ejecutar la homogeneización durante 1 min a 17.500 rpm. Dejar reposar la muestra durante 2 min y repetir la homogeneización durante 1 minuto a la misma velocidad del rotor.
  4. Deje reposar la muestra durante 10 minutos. En este paso, las partículas más pesadas (minerales) se asentarán. Las células y los componentes orgánicos de la muestra sin embargo wenfermos permanecen en solución. Después, transferir la solución sobrenadante (que contiene la biomasa celular) en un tubo de 50 ml limpio, teniendo cuidado de no perturbar el pellet de sedimentos.
  5. Para el sedimento sedimentos añadir de nuevo 15 ml de una (autoclave) Solución de SHMP 1% estéril usando una bureta graduada estéril. Luego repita los pasos 2.3 y 2.4. Esta repetición asegura la separación de la cantidad máxima de células y partículas orgánicas a partir del componente mineral del sedimento. El sobrenadante de esta segunda separación se puede fusionó con el sobrenadante de la primera separación.
    Nota: Los siguientes pasos se puede hacer todo en el sobrenadante (que contiene la biomasa celular). El componente mineral (pellet sedimentos) puede ser desechada.
  6. Centrifugar la muestra a 20 xg durante 1 min. Este paso aumenta la fuerza g suficiente para resolver partículas minerales pequeñas mientras que el material de célula biológica aún permanece en solución. Después de la centrifugación, transferir la solución sobrenadante (que contiene la biomasa celular) en unalimpia tubo de 50 ml. Deseche el sedimento mineral.
  7. Determinar el volumen final de la solución que contiene la biomasa pesando la muestra. La determinación del peso evita tener que transferir la muestra a un cilindro graduado y reduce el riesgo de contaminación.

3. Recolección de Biomasa en filtro de membrana

  1. Preparar unidad de filtración (por 47 mm de diámetro membranas) y la bomba de vacío. Esterilizar la unidad de filtración, ya sea en autoclave o (si vidrio Pyrex) rociándolo con etanol al 70% y en llamas con un mechero Bunsen. Deje que se enfríe antes de continuar con el protocolo.
  2. Añadir membrana NC estéril para la unidad de filtración usando pinzas esterilizadas con etanol flameado.
  3. Añadir la mitad de la muestra de sobrenadante (de la etapa 2.6) en la unidad de filtración de membrana y recoger las células en la membrana utilizando la bomba de vacío.
  4. Cuando el líquido ha pasado totalmente a través del filtro, detenga la bomba de vacío y retire con cuidado la membrana utilizando ethanol-llama esterilizado fórceps. Colocar la membrana en una placa de Petri estéril.
    1. Cortar la membrana en un medio con unas tijeras esterilizadas con etanol flameado. Añadir cada medio de la membrana a un tubo de 2 ml separado. Una media de la membrana se utiliza para la extracción y el análisis de toda la comunidad bacteriana de ADN. El otro medio de filtro se almacenó a -80 ° C y sirve como una copia de seguridad.
  5. Coloque nueva membrana NC en la unidad de filtración y recoger biomasa a partir de la segunda mitad del volumen de la muestra (del paso 2.6) utilizando la bomba de vacío.
  6. Cuando el líquido ha pasado totalmente a través del filtro, detenga la bomba de vacío y retire con cuidado la membrana utilizando pinzas esterilizadas con etanol flameado. Coloque toda la membrana en un tubo de 2 ml separado. Esta muestra se utiliza para el tratamiento para separar las endosporas a partir de células vegetativas. La muestra puede ser almacenada a -20 ° C hasta su uso.

4. La lisis de las células vegetativas

  1. Realizar eltratamiento para separar las endosporas de células vegetativas en la biomasa recogida previamente sobre una membrana de NC (paso 3.6).
    1. Si la membrana se congela, dejarlo a temperatura ambiente durante 10 minutos para descongelar. A continuación, coloque la membrana en una placa de Petri estéril y cortarla (aproximadamente 4 veces) en trozos más pequeños con unas tijeras esterilizadas con etanol flameado. A continuación, coloque todas las piezas del filtro de membrana en un tubo de 2 ml estéril.
  2. Añadir 900 l de TE (Tris-EDTA) tampón 1x (véase 1.5) al tubo que contiene la membrana muestra y mezclar a fondo por vórtice. En este paso, la biomasa se elimina de la membrana en la solución de tampón TE.
  3. Colocar el tubo en una incubadora a 65 ° C durante 10 min y 80 rpm. Luego retire el tubo de la incubadora y deje que se enfríe durante 15 minutos.
  4. Añadir 100 l de lisozima recién preparada (ver 1.5) para llegar a una concentración final de 2 mg / ml. No agregue la lisozima antes de la muestra se ha enfriado a 37 ° C, ya que esto podría degRade la enzima.
  5. Incubar la muestra a 37 ° C durante 60 min y 80 rpm, las condiciones óptimas para la lisozima para lisar las células vegetativas.
  6. Después de la lisis es completa, añadir 250 l de 3 N de hidróxido de sodio (NaOH) y 250 l de dodecilsulfato de sodio (SDS) solución al 6% a la muestra. Mediante la adición de esto, el volumen de la muestra llega a 1,5 ml y hay una concentración final de 0,5 N NaOH y la concentración final de 1% de SDS.
  7. Incubar esta mezcla a TA durante 60 min y 80 rpm. Adición de la base y detergentes ayudará en la lisis celular final. La concentración de estos detergentes se ha optimizado para no dañar las endosporas, mientras que la lisis de las células vegetativas.
  8. Preparar una unidad de filtración estéril que contiene membranas de 25 mm de diámetro por tratamiento en autoclave, o (si Pyrex vidrio) rociándolo con etanol al 70% y en llamas con un quemador Bunsen. Deje que se enfríe.
  9. Coloque una membrana de 0,2 micras NC (25 mm de diámetro) en la unidad de filtración utilizando fórceps etanol llama esterilizados.
  10. Añadir la muestra a partir del paso 4.7 en la membrana y el filtrado del líquido utilizando la bomba de vacío. Cuando el líquido ha pasado a través, apague la bomba de vacío. En este paso, se retira el material de célula vegetativa lisadas, ya que no se retiene en la membrana. Sólo endosporas permanecerán en la membrana.
  11. Añadir 2 ml de solución fisiológica estéril para lavar detergentes residuales y filtrar el líquido usando la bomba de vacío.
  12. Cuando el líquido se filtra completamente, apague la bomba de vacío. Deja la membrana de la unidad de filtración.

5. El tratamiento DNasa

Nota: Realice el tratamiento DNasa directamente en la membrana de filtro. Es importante que la unidad de filtración no se escapa y la bomba de vacío está apagado.

  1. Añadir 450 l de agua estéril, 50 l de tampón de reacción de DNasa (1x) y 0,5 l enzima DNasa directamente sobre la membrana de filtro y se deja reposar durante 15 minutos. Si es posible, hacer esto digestión en una habitación que es ligeramente guerramer que el promedio RT, ya que la enzima funciona mejor a temperaturas de 25 ° C y por encima.
    Nota: Mantener el quemador Bunsen a un lado la unidad de filtración también aumenta la temperatura y tiene la ventaja añadida de mantener estéril el entorno, por lo tanto menor riesgo de contaminación de las muestras.
  2. Una vez finalizada la digestión DNasa, encienda la bomba de vacío para eliminar la enzima de la muestra.
  3. Lavar la enzima residual mediante la adición y filtrado 1 ml de solución fisiológica.
  4. Si el líquido ha pasado totalmente, apague la bomba de vacío y quitar la membrana de filtro que contiene endosporas usando pinzas estériles y colocarlo en una placa de Petri estéril.
    Nota: La muestra de endosporas separadas está ahora listo para el análisis de aguas abajo. Almacenar a -20 ° C si se utiliza para la extracción de ADN o, alternativamente, a 4 ° C si se utiliza para la germinación y el cultivo.

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Resultados

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Los resultados presentados aquí han sido publicados anteriormente 10,21. Por favor, consulte los artículos para la interpretación ambiental y análisis de los datos.

El procedimiento global se resume en la figura 1 y corresponde a tres pasos principales: primero, la separación de la biomasa a partir de sedimentos o cualquier otra matriz ambiental; segundo, la destrucción de las células vegetativas; y tercero, el análisis de aguas abajo de las endos...

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Discusión

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La resistencia de endosporas a factores fisicoquímicos agresivas externas (por ejemplo, la temperatura o detergentes) se utilizó para diseñar un método para separar las endosporas bacterianas de células vegetativas en muestras ambientales. Esta es la primera método integral para aislar endosporas a partir de muestras ambientales de una manera no destructiva. Los métodos anteriores para cuantificar, detectar o analizar endosporas en las muestras se basan en la medición de los proxies específicos para la...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Los autores agradecen a la Fundación Nacional de Ciencia de Suiza para la Subvención No. 31003A-132358/1, 31003A_152972 y No. 151 948, y la Fundación Pierre Mercier pour la Ciencia.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Filtros de membrana de nitrocelulosa Whatman, 0.2 μ m tamaño de poro, 47 mm de diámetroSigma-AldrichWHA7182004 Aldrich 
Tris(hidroximetil)aminometanoSigma-Aldrich252859 Sigma-AldrichCAS 77-86-1
EDTASigma-AldrichE9884 Sigma-AldrichCAS  60-00-4 
Lisozima de clara de huevo de gallinaSigma-Aldrich62971 Flukaen polvo, CAS  12650-88-3 
Homogeneizador Ultra-Turrax T18 basicIKA3720000
Portafiltros de vidrio para 47  membranas mm, vidrio PyrexEMD MilliporeXX10 047 00
Bomba de vacío para productos químicosMilliporeWP6122050 220 V/50 Hz
Filtración de muestreo por colector para 25  mm membranasMillipore1225 Colector de muestreopolipropileno
DnaseNew England BiolabsM0303Slibre de rnasa
Sigma-AldrichS5881 Sigma-AldrichCAS  1310-73-2 
Dodecil sulfato de sodio (SDS)Sigma-AldrichL3771 Sigma 
Filtros de membrana de nitrocelulosa Whatman, 0.2 μ m tamaño de poro, 25 mm de diámetroSigma-AldrichWHA7182002 Aldrich
NaOH

Referencias

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  1. Nicholson, W. L. Roles of Bacillus endospores in the environment. Cell Mol Life Sci. 59 (3), 410-416 (2002).
  2. Lester, E. D., Satomi, M., Ponce, A. Microflora of extreme arid Atacama Desert soils. Soil Biol Biochem. 39 (2), 704-708 (2007).
  3. Wilson, M. S., Siering, P. L., White, C. L., Hauser, M. E., Bartles, A. N. Novel archaea and bacteria dominate stable microbial communities in North America's Largest Hot Spring. Microb Ecol. 56 (2), 292-305 (2008).
  4. Hugenholtz, P. Exploring prokaryotic diversity in the genomic era. Genome Biol. 3 (2), (2002).
  5. Onyenwoke, R. U., Brill, J. A., Farahi, K., Wiegel, J. Sporulation genes in members of the low G+C Gram-type-positive phylogenetic branch (Firmicutes). Arch Microbiol. 182 (2-3), 182-192 (2004).
  6. Delmont, T. O., et al. Accessing the soil metagenome for studies of microbial diversity. Appl Environ Microbiol. 77 (4), 1315-1324 (2011).
  7. Ricca, E., Henriques, A. O., Cutting, S. M. Bacterial spore formers: probiotics and emerging applications. , Horizon Bioscience. (2004).
  8. Kuske, C. R., et al. Small-Scale DNA Sample Preparation Method for Field PCR Detection of Microbial Cells and Spores in Soil. Appl Environ Microbiol. 64 (7), 2463-2472 (1998).
  9. von Mering, C., et al. Quantitative phylogenetic assessment of microbial communities in diverse environments. Science. 315 (8515), 1126-1130 (2007).
  10. Wunderlin, T., Junier, T., Roussel-Delif, L., Jeanneret, N., Junier, P. Stage 0 sporulation gene A as a molecular marker to study diversity of endospore-forming Firmicutes. Environ Microbiol Rep. 5 (6), 911-924 (2013).
  11. Siala, A., Hill, I. R., Gray, T. R. G. Populations of spore-forming bacteria in an acid forest soil, with special reference to Bacillus subtilis. J General Microbiol. 81 (1), 183-190 (1974).
  12. Brandes Ammann, A., Kolle, L., Brandl, H. Detection of bacterial endospores in soil by terbium fluorescence. Int J Microbiol. , 435281(2011).
  13. Fichtel, J., Koster, J., Rullkotter, J., Saas, H. High variations in endospore numbers within tidal flat sediments revealed by quantification of dipicolinic acid. Geomicrobiol J. 25 (7-8), (2008).
  14. Cronin, U. P., Wilkinson, M. G. The potential of flow cytometry in the study of Bacillus cereus. J Appl Microbiol. 108 (1), 1-16 (2010).
  15. de Rezende, J. R., et al. Dispersal of thermophilic Desulfotomaculum endospores into Baltic Sea sediments over thousands of years. ISME J. 7 (1), 72-84 (2013).
  16. Hubert, C., et al. Thermophilic anaerobes in Arctic marine sediments induced to mineralize complex organic matter at high temperature. Environ Microbiol. 12 (4), 1089-1104 (2010).
  17. Garbeva, P., van Veen, J. A., van Elsas, J. D. Predominant Bacillus spp. in agricultural soil under different management regimes detected via PCR-DGGE. Microb Ecol. 45 (3), 302-316 (2003).
  18. Brill, J. A., Wiegel, J. Differentiation between spore-forming and asporogenic bacteria using a PCR and southern hybridization based method. J Microbiol Methods. 31 (1-2), 29-36 (1997).
  19. Rueckert, A., Ronimus, R. S., Morgan, H. W. Development of a real-time PCR assay targeting the sporulation gene, spo0A., for the enumeration of thermophilic bacilli in milk powder. Food Microbiol. 23 (3), 220-230 (2006).
  20. Bueche, M., et al. Quantification of endospore-forming firmicutes by quantitative PCR with the functional gene spo0A. Appl Environ Microbiol. 79 (17), 5302-5312 (2013).
  21. Wunderlin, T., Junier, T., Roussel-Delif, L., Jeanneret, N., Junier, P. Endospore-enriched sequencing approach reveals unprecedented diversity of Firmicutes in sediments. Environ Microbiol Rep. 6 (6), 631-639 (2014).
  22. Nicholson, W. L., Law, J. F. Method for purification of bacterial endospores from soils: UV resistance of natural Sonoran desert soil populations of Bacillus spp. with reference to B. subtilis strain 168. J Microbiol Methods. 35 (1), 13-21 (1999).

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